CN103946712A - 用于流动控制润湿的方法和设备 - Google Patents

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Abstract

本文提供测定分散相液滴润湿通道表面所处的第一位置的方法。所述方法包括：使分散相液滴浸入连续相流体中，其中所述连续相流体与所述分散相液滴不混溶；然后使连续相中的分散相液滴以分散相液滴速度流过通道，其中所述分散相液滴通过具有膜厚度的连续相流体的膜与表面分开；以及减小膜厚度以使第一位置处的膜破裂，其中所述液滴润湿第一位置处的表面。

Description

用于流动控制润湿的方法和设备
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年9月30日提交的美国临时申请61/541,916号的优先权，其通过引用并入本文。
背景技术
1.技术领域
本发明涉及微流体装置。特别地，本发明涉及基于液滴的微流体装置及其用途，以及用于将反应物连续合并到反应混合物的方法。
2.相关技术说明
微流体系统提供用于生物分析的许多优点，包括自动化、在小体积中增大的反应效率、有利的传质性能以及用于有限样品的可扩展和成本节约的分析的潜能。微流体系统在过去十年的发展已经导致越来越精细的芯片上功能以及用于控制和储存流体的两种正交策略的出现，基于使用集成的微阀或在不混溶载体相中输送微液滴。软刻蚀的发展(1)和该方法延伸到使用多层软刻蚀来制备集成微阀(2,3)已经使得装置能够每cm2具有数千个活动微阀。该高水平的集成使得装置结构能够并行地实施数千个预定“单元格(unit cell)”反应，并且应用包括蛋白结晶(4,5)、蛋白相互作用研究(6,7)、单细胞分析(8-11)、细胞培养(12,13)和基因组学(14)。最近，已经开发了两相微液滴体系，其理想地适用于高速系列分析，并且已经用于高通量筛选应用(15-17)和基因组学的样品制备(18)。
这类装置已经清楚地证明了微流体在多种生物研究领域中的潜在影响，然而微流体装置的应用很大程度上仍停留在以微流体为焦点的实验室的范围。这主要是由于以下事实：这些装置需要专门的训练和仪器来制造，并且一般与特定的流体处理任务“密切相关”，对于每一应用或试验方案变化需要定制的设计和制造。不幸地，这类设计迭代是通常生物实验室难以达到的。通用的、灵活性的和使用者可编程的微流体平台会对移除整个科学界普遍采用的这种屏障非常有效。
在电极阵列上操纵液滴的电介质上电润湿系统通过允许同时对多个液滴进行控制来实现高度的可编程性和灵活性，包括融合和分开确定体积的液滴的能力(19)。还已经证实了使用阀门来重新配置流体可以通过的结点的栅格的可编程装置(20-22)。然而，这类系统迄今已经实现了有限数量的平行反应，并具有相当低分辨率的配制。
所有生物系统中细胞与细胞异质性的重要性以及微流体对单细胞分析的顺从性使单细胞的操作成为可编程微流体装置的许多潜在使用者会从中受益的重要能力。然而，该能力有待集成到现有可编程微流体系统中。
发明内容
本发明涉及允许在可独立访问储存元件的阵列中可编程高分辨配制纳升级溶液和洗脱反应产物的通用且灵活的微流体方法和系统。该功能通过使用流动控制润湿来布置和融合可完全编程数量的液滴的新型液滴储存策略来实现。
根据一个实施方案，提供测定分散相液滴润湿具有均匀润湿性的通道的表面所处的第一位置的方法。所述方法包括以下步骤：使分散相液滴浸入连续相流体中，其中所述连续相流体与分散相液滴不混溶；然后使连续相中的分散相液滴以分散相液滴速度流过通道，其中所述分散相液滴通过具有膜厚度的连续相流体的膜与表面分开；以及使第一位置处的膜破裂，其中所述液滴润湿第一位置处的表面。使膜破裂可以包括降低分散相液滴速度以减小膜厚度。
根据另一实施方案，提供测定分散相液滴润湿通道表面所处的第一位置的方法。所述方法包括以下步骤：使分散相液滴浸入连续相流体中，其中所述连续相流体与分散相液滴不混溶；然后使连续相中的分散相以分散相液滴速度流过通道，其中所述分散相液滴通过具有膜厚度的连续相流体的膜与表面分开；以及减小膜厚度以使第一位置处的膜破裂，其中所述液滴润湿第一位置处的表面。使膜破裂可以包括降低分散相液滴速度以减小膜厚度。减小膜厚度可以包括在分散相液滴接近第一位置时从通道移除连续相流体的一部分。
根据另一实施方案，提供合并多个分散相液滴的方法。所述方法包括以下步骤：a)维持第一分散相液滴润湿到第一位置处的通道表面；b)根据本文所述方法使第二分散相液滴润湿第一位置处的通道表面；以及c)使第一分散相液滴与第二分散相液滴接触足以使第一分散相液滴和第二分散相液滴合并的时间。所述方法还可以包括将另外的液滴引入到通道，然后与先前合并的液滴融合。第一液滴、第二液滴和另外的液滴可以包含相同的溶液，或可以包含不同的溶液。每一液滴都可以包含化学反应的不同组分。因此，所述方法可以用于通过连续添加分散相液滴来配制或执行多步反应。
根据另一实施方案，提供从分散相保存室中移除浸入连续相流体中的分散相的第一部分，其中所述连续相流体与分散相不混溶，所述分散相保存室在第一部分的体积小于所述室的体积的前提下可操作地配置为保存所述第一部分。所述方法包括以下步骤：a)使分散相液滴浸入连续相流体中以形成分散相的第二部分，其中所述连续相流体与分散相液滴不混溶；b)使分散相的第二部分流入到分散相保存室中，其中保存室中分散相部分的总体积超过分散相保存室的体积；c)使第一分散相部分与第二分散相部分接触足以使第一分散部分和第二分散相部分合并的时间，以形成包封在连续相流体中的洗脱流；以及d)使洗脱流流过分散相保存室出口。
根据另一实施方案，提供用于减小包封分散相液滴的连续相流体的膜的厚度的微流体装置，其中所述分散相液滴在连续相流体中不混溶。所述装置包括用于使分散相液滴流动的通道和可操作地配置为从通道中转移出连续相流体的一部分以减小膜厚度的筛元件系列，其中每一筛元件的直径小于分散相液滴的直径。筛元件可以大致垂直于通道排列。所述装置还可以包括与通道流体连通以用于接收来自通道的分散相液滴的分散相保存室。筛元件可以可操作地配置为在到达分散相保存室之前从通道中转移出连续相流体的一部分。所述装置还可以包括与所述系列的筛元件流体连通的旁路通道，其中所述旁路通道可操作地配置为接收所述部分并维持所述部分在保存室外部。
根据另一实施方案，提供用于降低包封在连续相流体中的分散相液滴的速度的微流体装置，其中所述分散相液滴与连续相流体不混溶。所述装置包括用于使分散相液滴流动的通道和可操作地配置为从通道中转移出连续相流体的一部分以降低分散相液滴速度的筛元件系列，其中每一筛元件的直径小于分散相液滴的直径。筛元件通常可以垂直于通道排列。所述装置还可以包括与通道流体连通以用于接收来自通道的分散相液滴的分散相保存室。筛元件可以可操作地配置为在到达分散相保存室之前从通道中转移出连续相流体的一部分。所述装置还可以包括与该系列筛元件流体连通的旁路通道，其中所述旁路通道可操作地配置为接收所述部分并维持所述部分在保存室外部。
根据另一实施方案，提供处理微流体装置中分散相液滴的方法。所述方法包括以下步骤：a)使第一分散相液滴浸入连续相流体中以形成分散相的第一部分，其中所述连续相流体与第一分散相液滴不混溶；b)使第一分散相液滴以第一分散相液滴速度流入到所述装置的储存元件中，其中所述储存元件包括主通道和用于接收来自主通道的所述分散相液滴的分散相保存室，其中所述主通道可操作地配置为在所述分散相液滴接近保存室时降低分散相液滴速度，且其中所述保存室在保存室内分散相的总体积小于保存室的体积的前提下可操作地配置为保存储存元件内的所述分散相液滴，其中所述第一分散相液滴通过具有第一膜厚度的连续相流体的第一膜与储存元件的表面分开；c)使储存元件内第一位置处的第一膜破裂，其中所述第一分散相液滴润湿第一位置处的表面。使第一位置处的第一膜破裂可以包括减小第一膜厚度以使第一位置处的第一膜破裂。减小第一膜厚度可以包括降低第一分散相液滴速度。所述表面可以具有均匀的润湿性。
所述方法还可以包括以下步骤：d)使第二分散相液滴浸入连续相流体中以形成分散相的第二部分，其中所述连续相流体与第二分散相液滴不混溶；e)使第二分散相液滴以第二分散相液滴速度流入到储存元件中，其中所述第二分散相液滴通过具有第二膜厚度的连续相流体的第二膜与表面分开；以及f)使储存元件内第二位置处的第二膜破裂，其中第二液滴润湿第二位置处的表面。第一位置可以基本上与第二位置相同，且第一分散相液滴可以与第二分散相液滴接触足以使第一分散相液滴和第二分散相液滴合并的时间。
所述方法还可以包括以下步骤：g)使第三分散相液滴浸入连续相流体中以形成分散相的第三部分，其中所述连续相流体与第三分散相液滴不混溶；h)使第三分散相液滴以第三分散相液滴速度流入到储存元件中，其中所述第三分散相液滴通过具有第三膜厚度的连续相流体的第三膜与表面分开；以及i)使储存元件内第三位置处的第三膜破裂，其中所述第三液滴润湿第三位置处的表面。第三位置可以基本上与第一位置相同，且第三分散相液滴可以与第一分散相液滴接触足以使第一分散相液滴和第三分散相液滴合并的时间。或者，第三位置可以基本上与第二位置相同，且第三分散相液滴可以与第二分散相液滴接触足以使第二分散相液滴和第三分散相液滴合并的时间。在另一替代方案中，第三位置可以位于第一位置和第二位置之间，并且第三位置可以充分接近第一位置和第二位置，其中第三分散相液滴可以与第一分散相液滴和第二分散相液滴两者接触足以使第三分散相液滴与第一分散相液滴和第二分散相液滴合并的时间。
所述方法还可以包括以下步骤：j)使第四分散相液滴浸入连续相流体中以形成分散相的第四部分，其中所述连续相流体与第四分散相液滴不混溶；k)使第四分散相液滴流入到分散相保存室中，其中储存元件内分散相的总体积超过分散相保存室的体积；l)使储存元件内的分散相液滴与第四分散相液滴接触足以使第四分散相液滴和分散相液滴合并以形成包封在载流体中的洗脱流的时间；以及m)使洗脱流流过分散相保存室出口。
本领域技术人员会理解可以连续流入到储存元件中并与之前固定的分散相液滴融合的分散相液滴的数量仅受保存室体积的限制。
根据另一实施方案，提供用于储存和处理分散相液滴的微流体系统。所述系统包括如本文所述的至少两个平行的可独立访问的储存元件的阵列，其中每一储存元件都具有主通道和用于接收来自主通道的至少一个所述分散相液滴的分散相保存室。至少一个所述分散相液滴形成分散相在储存元件内的部分。主通道可操作地配置为在至少一个所述分散相液滴接近分散相保存室时降低至少一个所述分散相液滴的速度。分散相保存室在分散相保存室内的分散相的总体积小于保存室的体积的前提下可操作地配置为保存储存元件内的至少一个所述分散相液滴。所述系统还包括由至少两个储存元件共享的用于使至少一个所述分散相液滴流动到选定的储存元件的入口通道和由至少两个储存元件共享的用于使分散相从选定的储存元件流出的洗脱通道。
根据另一实施方案，提供测定分散相液滴润湿具有均匀润湿性的微流体装置的分散相润湿表面所处的第一位置的方法。所述方法包括以下步骤：使分散相液滴浸入连续相流体中，其中所述连续相流体与分散相液滴不混溶；然后使分散相液滴以分散相液滴速度流过微流体装置，其中所述分散相液滴通过具有膜厚度的载液的膜与管道的表面分开；以及减小膜厚度以使第一位置处的膜破裂。
在结合附图阅读本发明的具体实施方案的以下说明后，本发明的其它方面和特征对本领域普通技术人员会变得显而易见。
附图说明
在举例说明本发明实施方案的附图中，
图1为用于本发明一个实施方案的方法的微流体通道的示意图。
图2为用于本发明一个实施方案的方法的微流体通道的示意图。
图3为用于本发明一个实施方案的分散相液滴储存元件的示意图。
图4为如图3所示的储存元件的二维阵列的示意图。
图5为用于图4所示的阵列的细胞分选模块的示意图。
图6为分配到用于输送至储存室阵列的流动载流体流中的红色食用染料的单个泵增量的图的时间进程。四步蠕动泵循环使水流前进，且阀动夹断液滴。基准尺为500μm。
图7为临界进入速度的液滴融合和固定的图的时间进程。液滴在即将到达储存室前减速至液滴润湿速度，并且通过表面张力被拉入到储存室中。基准尺为100μm。
图8为低于临界进入速度的液滴融合和固定的图的时间进程。在储存室上游使液滴减速至液滴润湿速度。多个液滴在合并的液滴到达所述室前融合，并通过表面张力被拉入到所述室中。基准尺为100μm。
图9为高于临界进入速度的液滴融合和固定的图的时间进程。液滴不减速至液滴润湿速度，并自由地流动到将其融合的储存室顶部。在最后的图中焦点已经垂直上移以显示位于顶部的融合的液滴。基准尺为100μm。
图10A为图3所示的本发明实施方案的微流体装置的室中储存的水的2.7nL储存液滴的显微图。
图10B为图3所示的本发明实施方案的微流体装置的室中储存的含0.1％Tween20表面活性剂的水的2.7nL储存液滴的显微图。表面活性剂增强向装置表面上的润湿，导致与单独的水相比减小的接触角。
图11为在2.5μm高度的通过图3所示的本发明实施方案的储存元件的流动速度的有限元模拟的示意图。
图12为在通过储存元件中心的垂直面上的通过图3所示的本发明实施方案的储存元件的流动速度的有限元模拟的示意图。
图13为示出图1所示的本发明实施方案的室的洗脱的光学显微图。
图14为3轴机器人的图，图4所示的装置安装到所述3轴机器人以允许洗脱喷嘴在微孔板中的计算机控制的定位。
图15为平均荧光强度作为染料浓度的函数的图。
图16为示出测量的从8个试剂入口的每一个中装载的9个不同室中的储存液滴的体积的散点图。
图17为例示本发明一个实施方案的可访问性和可编程性的微流体显示器的光学显微图。储存的液滴由300个计量液滴构成，所述计量液滴通过从每一字母的顶部到底部使用染料的两倍稀释系列来布置为字母。
图18A为使用100nM BSA+0.1％Tween20,FC-40+PFO的FITC标记BSA的储存液滴的荧光显微图。
图18B为使用1uM BSA,FC-40+PFO的FITC标记BSA的储存液滴的荧光显微图。
图18C为使用1uM BSA+0.1％Tween20,FC-40+OEG含氟表面活性剂的FITC标记BSA的储存液滴的荧光显微图。
图18D为使用1uM BSA,FC-40+OEG含氟表面活性剂的FITC标记BSA的储存液滴的荧光显微图。
图19示出在40个PCR循环后液滴阵列的终点荧光图。
图20示出对于图19所示阵列中的每一液滴的实时扩增曲线。
图21为在每一模板稀释下的来自图14所示反应的平均CT值的图。
图22为在棋盘图案中用每一模板(每液滴1476个基因组拷贝)或缓冲剂装载的液滴的40个PCR循环后的终点荧光图。
图23为示出包含扩增模板和水的液滴的洗脱对中模板的浓度差倍数的图。
图24为储存液滴中单个表达红色荧光蛋白的沙门氏菌的重叠的亮视场和荧光显微图构成的图。
图25为随着培养物与单个分选的细菌一起接种到储存元件中的时间的整合绿色荧光蛋白荧光的图。
图26为随着培养物与单个分选的细菌一起接种到储存元件中的时间的整合红色荧光蛋白荧光的图。
图27为由储存液滴阵列中所有培养物的重叠的GFP和RFP通道共聚焦扫描构成的图。
图28为用于与不同数量的两种菌株接种的共培养物的GFP和RFP通道中标准化的终点荧光强度的散点图。
图29为显示关于单个分选的大肠杆菌(E.coli)上的qPCR反应的实时qPCR曲线的图。
图30为在每一模板稀释下的来自图29所示反应的平均CT值的图。
图31为显示关于单个分选的鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)和大肠杆菌以及每一物种的多个细胞的16S rRNA qPCR的qPCR曲线的图。
图32为示出关于图31的单个和多个细胞反应的平均CT值和标准差的图。
图33为基于PCR的WGA反应生成的16S rRNA拷贝数量的图。
图34为由微流体MDA反应生成的16S rRNA拷贝数量的图。
图35为由没有DDT的条件下进行的微流体单细胞大肠杆菌MDA反应生成的10个位点的拷贝数量的图。
图36为通过来自两个单独的单个大肠杆菌微流体MDA反应的测序数据的代尔夫特嗜酸菌(Delftiaacidovorans)参照基因组的读出覆盖度的图。
图37为通过来自(A)未扩增基因组的DNA、(B)纳升MDA、(C)合并的纳升/微升MDA、(D)微升MDA、和(E)纳升无细胞对照MDA的测序数据的大肠杆菌参照基因组的读出覆盖度的图。
图38为通过来自两个单独的单个大肠杆菌纳升MDA反应(红色和青色)的测序数据的大肠杆菌参照基因组的重叠标准化读出覆盖度的图。重叠区域为深青色。
图39为对于每一确定样品的参照基因组覆盖度相对于平均测序覆盖深度的图。
图40为示出对于每一MDA反应类型在16x的平均覆盖深度下的参照基因组的覆盖深度的柱状图。对于每一经测序的样品，示出关于参照基因组每一位置的覆盖的差异系数(CV)。
图41为来源于三种不同环境的67WGA样品的宏基因组中未覆盖的分类谱的概述。A)关于由单个宏基因组数据集的集合产生的所有重叠群的重叠GC核密度图。B)通过与RefSeq蛋白组学数据库的blastx序列比较的MEGAN分析产生的样品特异性分类谱的层序聚类分析。C)三种环境代表性宏基因组的分类谱，如通过三种不同过程(MLTreeMap、用egg NOG的blastx、用RefSeq蛋白组学的blastx)产生的。
图42为示出样品的形态不均匀性的原发肿瘤细胞核的一组显微图。
图43为(A)在细胞分选模块中和(B)在储存液滴中的原发乳癌胸腔积液细胞核的显微图。
图44A为显示关于单个分选的原发乳癌胸腔积液细胞核的核糖核酸酶P qPCR的qPCR曲线的图。
图44BB为显示关于图44A所示的所有反应类型的平均CT值和标准差的图。
图45为显示关于单个分选的原发乳癌胸腔积液细胞核的6重PCR的qPCR曲线的图。
图46为关于来自4个芯片上单核多重PCR反应的5个体细胞突变位点(左到右：FGA、GOLGA4、KIAA1468、KIF1C和MORC1)的PCR扩增子的毛细管电泳图。
图47为示出来自(A)纯化基因组DNA和(B)单个原发乳癌胸腔积液细胞核的芯片上多重PCR的5个位点扩增子的由染色体分装的读出覆盖度的柱状图。
图48A为示出纯化RNA的稀释物的GAPDH qRT-PCR的图(A)，关于列出的所有反应的qRT-PCR曲线(B)的图。
图48B为关于图48A中所有反应的拟合为直线的平均CT值和标准差的图。
图49aPCR的WTA产物中GAPDH cDNA的定量。(A)关于所有反应的qPCR曲线，(B)关于所有反应的拟合为直线的平均CT值和标准差。
图50显示关于应用于WTA产物的48qPCR分析的CT值的热图。
图51来自应用于芯片上WTA产物的选定qPCR分析的平均CT值的标准曲线。
图52关于芯片上WTA产物和管中WTA产物的18S rRNA的基因丰度的比较。(A)平均在2pg、20pg和200pg的输入RNA量以上的芯片上WTA产物的基因丰度，(B)来自100ng输入RNA的管内WTA产物的基因丰度。
具体实施方式
定义
如本文所使用的，“微流体装置”是指允许精确控制和操纵受其中至少一个维度(宽、长、高)通常可以小于1mm的结构的几何约束的流体的任何装置。
如本文所使用的，“流动(flow)”或“流动(flowing)”是指使流体移动通过装置或在本发明的方法中移动流体，并且包括但不限于流体顺流或逆流的移动，无论流体是否被所述流承载。例如，液滴通过装置或在本文所述的方法中的移动，例如通过本发明的储存元件或微流体芯片的通道，包括流动。根据本发明，无论液滴是否由还包括流动的连续相流体流承载，或无论是否通过一些其它直接或间接的力或推动使液滴移动，情况都是如此。任何力的施加可以用于提供流动，包括但不限于压力、毛细管作用、电渗透、电泳、介电电泳、光镊或其任何组合。
如本文所述的流体流动通过装置的方向规定液滴储存元件的“上游”和“下游”方向。因此，入口会位于液滴储存元件的上游位置处，且出口通常会位于液滴储存元件的下游位置处。
如本文所使用的，“连续相”或“连续相流”是指以单独连续整体形式流动的流体流。连续相的流动可以是层流，或者在一些情况中是湍流。在适当位置，连续相可以包围用第二流体(例如下文所定义的分散相液滴)填满或部分填充的内部空间。
如本文所使用的，“连续相流体”或“载流体”是指形成连续相的流体。不完全防止固定分散相液滴对给定表面的润湿且不使分散相液滴稳定以至于它们不能融合的任何连续相流体都可以适合于本发明的目的。
如本文所使用的，“分散相”或“不连续相”是指不以单独整体形式产生的任何流体流。分散相可以具有单个液滴的外观，任选地被第二流体、即连续相流体包围。
如本文所使用的，“分散相流体”或“不连续相流体”是指形成分散相的流体。分散相流体可以包括生物/化学材料。生物/化学材料可以是组织、细胞、颗粒、蛋白、抗体、氨基酸、核苷酸、小分子、药物等。生物/化学材料可以包括一种或更多种标记。标记可以是DNA标签、染料、量子点等，或其组合。
如本文所使用的，“液滴”或“不连续相液滴”是指至少部分地被液滴与其不混溶的第二流体、即连续相流体包围，或者至少部分地浸入液滴与其不混溶的第二流体、即连续相流体内的分散相流体的孤立部分。例如，液滴可以完全被连续相流体包围，或者可以受连续相流体和微流体装置的一个或更多个表面束缚。如果例如连续相流体为油，则液滴可以是水性的，或者可以是包含水性组分和非水性组分的混合物。如果例如连续相流体为水性的，则液滴可以是油，或者可以是包含油组分和非油组分的混合物。液滴可以采用多种形状。在一些情况下，液滴可以是球形或基本上球形的；然而，在其它情况下，液滴可以具有非球形的形状，这取决于环境，包括但不限于通常的碟形、块形、截断的球形、椭圆形、部分压扁的球形、半球形、卵形、圆柱形和在液滴上进行的过程、例如融合或分开中形成的多种形状。
术语“连续相”(或“载流体”)和“分散相”(或“不连续相”)是相对术语，其指在连续相流体比分散相流体更占优势时的相互作用期间的流体的特征。然而，如本文所使用的，即使在分散相更占优势时，例如当分散相液滴从如本文所述的储存元件洗脱时，连续相仍可以被认为是连续相。相似地，如本文所使用的，在不存在连续相或连续相流体不占优势的情况下，例如在从如本文所述的储存元件洗脱液滴期间，分散相仍可以被认为是分散相。
如本文所使用的，“乳液”是指两种或更多种流体的混合物，其中，两种或更多种流体中至少两种通常在给定温度和压力下为不混溶的(不可混合的)。在乳液中，第一(或更多)流体(“分散相”)的小球体分散或悬浮于第一或更多流体不会与其混合的第二流体(“连续相”)中，但是分散相的第一或更多流体可以彼此混合。
如本文所使用的，“入口”或“出口”可以包括任何孔，由此限制流体流动通过入口、出口或孔。可以有阀门来控制流动，或者流动可以通过利用阻止流动的层(例如油)分开通道而得到控制。
如本文所使用的，“污染物”是指可以干扰细胞或细胞内含物分析的精密度和/或准确度的任何材料。污染物包括但不限于蛋白、小分子、盐、缓冲剂、RNA、DNA、其它细胞、颗粒等。
如本文所使用的，表面的“润湿性”是指液体能够维持与固体表面接触的程度，其归因于在二者放到一起时分子间的相互作用。润湿性可以根据处于热平衡的液体液滴和水平表面之间的接触角来测量。0度的接触角对应于“完全”润湿，且液滴可以在表面上展开以形成膜。润湿性为取决于表面的界面张力的热力学变量。
如本文所使用的，“通道”是指用于流体的通常为管状的通路或管道。根据本发明的多个实施方案，通道会具有与一种或多种流体接触的表面。
如本文所使用的，“使……破裂”是指破坏或打破维持流体表面完整的凝聚力。
如本文所使用的，“合并(combine)”或“合并(combining)”或“融合(merging)”是指两个或更多个离散的分散相液滴及其内含物聚结为单个一致的液滴。
如本文所使用的，“储存元件”是指可操作地固定和无限地保存其中流动的分散相液滴的微流体结构。储存元件可以如图3进行配置，其中一个液滴或多个液滴会保留在储存元件中，条件是其体积不超过保存室的体积。
如本文所使用的，“分散相保存室”或“分散相液滴保存室”或“保存室”是指可操作地配置为无限保存沉积在其内的分散相流体的一部分或更多部分的结构。根据本发明的多个实施方案，分散相保存室会配置为保存沉积在其内的分散相流体的任何部分或所有部分，条件是沉积在保存室内的分散相流体的总体积不超过保存室的体积。如本文所使用的，分散相的“部分”可以指一个离散的液滴或多个离散的液滴。
如本文所使用的，“洗脱流”是指离开、已经离开或可操作地离开如本文所述的储存元件的分散相液滴。根据本发明的多个实施方案，保存在保存室内的分散相流体的部分在保存室内分散相流体的总体积超过保存室的体积时变为洗脱流。
如本文所使用的，“筛元件”是指从液滴流过的主通道分叉的小的侧通道。筛元件具有小于液滴的直径，并用于从主通道中转移出连续相流体。
如本文所使用的，“临界速度”是指如下的分散相液滴的速度：在所述速度或在所述速度以下将分散相液滴与表面分开的连续相流体的膜会破裂。
如本文所使用的，“临界进入液滴速度”是指分散相液滴在其进入储存元件时的速度，其会导致液滴润湿储存元件在保存室入口处的表面。
液滴润湿
参照图1，在10处概括示出根据本发明第一实施方案的测定分散相液滴润湿通道表面所处位置的流动控制方法中使用的设备。流动控制润湿方法能够在可访问储存元件的通道表面上精确定位、润湿和融合任意序列的分散相液滴。该方法利用多种流体物理现象：流过通道的分散相液滴周围的黏性连续相流体的薄膜的形成，该膜在其厚度充分降低时的破裂，和接触线钉扎(contact line pinning)。在非理想固体界面(毛细管表面)处的液-液边界的前进表现出明显的滞后(23)，导致抵抗流动下的液滴运动的保留力(24)。将该力用于液滴固定产生了需求之间的矛盾，这是因为没有污垢或交叉污染的液滴输送要求它们不接触通道表面(25)。虽然这些需求可以通过对所需位置处的表面性能进行化学改性来满足(26)，但是这可能难以实施。相反，流体动力学流动可以用于防止液滴在流动期间接触通道壁，同时保留在限定的储存区域润湿通道壁的能力，而无需装置表面性能的改性。
再次参照图1，浸入连续相流体14内的分散相液滴12从具有通道表面18的通道16流下。液滴12通过厚度为液滴速度函数的连续相流体14的薄润滑膜20与通道表面18分开(27)。如果液滴速度和由此的膜厚度降低至临界值，则不稳定性升高，其中液滴12和表面18之间的分子间力使膜20自发地破裂，使得液滴能够润湿通道的表面(28)。关于包围液滴12的膜20的自发破裂的临界膜厚度通过等式1给出：
h 0 = ( AR 2 ξ max γ ) 1 4
其中，h0为临界膜厚度，A为PDMS与水之间视为10-26J的Hamaker常数(29)，R为使液滴与通道壁分开的近似载流体盘的半径，ξmax为与均匀膜的扰动的最不稳定模式相关的数值常数(30)，以及γ为连续相/分散相界面处的界面张力。使用ξmax的最小值，这是因为其导致膜的最大不稳定性。然后，h0的值可以代入以下等式2以得到“临界速度”(U)，在所述临界速度，膜厚度降低至临界厚度，并且发生液滴对通道表面的自发润湿：
b = 0.643 r ( 3 μU γ ) 2 3
其中，b为膜厚度，r为液滴的半高度，且μ为连续相的粘度。因此可以实现选择性润湿，而无需表面性能的改性，即，当通道表面18具有均匀的润湿性时，通过设计装置几何形状和控制流动来维持液滴速度在该临界值之上，直至到达通道16中的预期位置。
参照图2，在100处概括示出根据本发明一个实施方案的测定分散相液滴润湿通道表面所处位置的流动控制方法中使用的微流体装置。浸入连续相流体114内的分散相液滴112从具有通道表面118的主通道116流下。液滴112通过厚度为液滴速度函数的连续相流体114的薄润滑膜120与通道表面118分开。在该实施方案中，通过筛元件122的系列(令人联想起Niu等(31))将流动的连续相流体114的一部分从主通道转移至旁路通道124，在液滴进入主通道116时降低进入液滴的速度。使液滴112变形所需的高界面能确保其不穿过筛元件122。旁路通道124用来保持经转移的连续相流体在主通道116外部，至少到液滴速度和由此的膜厚度降低至临界值，在所述临界值，膜120自发破裂，使得液滴能够润湿主通道的表面。因此，旁路通道124可以用来永久地从主通道116中转移出连续相流体的一部分，或者仅将所述部分转移至主通道内液滴112已润湿通道表面118所处位置下游的位置。在图2中，筛元件122以大致垂直于通过主通道116的流动的方向来取向，然而，本领域技术人员会理解，筛元件可以以有效地从主通道中转移出连续相流体的多种方式来取向。
参照图3，在200处概括示出根据本发明第三实施方案的固定和保存分散相液滴以用于处理的流动控制方法中使用的储存元件。储存元件200包括经由保存室入口204与具有通道表面218的主通道216流体连通的分散相保存室202。在该实施方案中，分散相保存室为圆柱形的，然而，本领域技术人员会理解，保存室可以具有多种形状。筛元件222的系列从主通道216分叉以连接主通道与旁路通道224。旁路通道224进一步与保存室202流体连通。保存室202进一步与保存室出口206流体连通。保存室出口206与旁路通道224汇合以形成洗脱出口208。
操作中，浸入连续相流体214内的第一分散相液滴212经由储存进给通道201流入储存元件200中，并从主通道216流下。液滴212通过厚度为液滴速度函数的连续相流体214的薄润滑膜220与通道表面218分开。在该实施方案中，通过筛元件222将流动的连续相流体214的一部分从主通道转移到旁路通道224中，在液滴进入主通道216时降低进入液滴的速度。使液滴212变形所需的高界面能确保其不穿过筛元件222。旁路通道224用来保持经转移的连续相流体在主通道216外部，至少到液滴速度和由此的膜厚度降低至临界值，在所述临界值，膜220自发破裂，使得液滴能够润湿主通道的表面。因此，旁路通道224可以用来从主通道216转移出连续相流体的一部分。在图3中，筛元件222以大致垂直于通过主通道216的流体的方向来取向。然而，本领域技术人员会理解，筛元件可以以有效地从主通道中转移出连续相流体的多种方式来取向。
如本文所使用的，“临界进入液滴速度”是指分散相液滴在其进入储存元件时的速度，其会导致液滴润湿储存元件在保存室入口处的表面。当分散相液滴212以小于或等于临界进入液滴速度的速度进入储存元件200时，其润湿主通道216在保存室202上游的第一位置230处的表面218。当分散相液滴212以临界进入液滴速度进入储存元件200时，保存室入口204处的流动速度会小于或等于所述速度，并且液滴会润湿室入口处或室入口附近的第二位置231。一旦分散相液滴212的前缘经由保存室入口204进入保存室202，其就被表面张力拉入其润湿保存室侧壁的位置，精确地将其定位在室入口附近的第三位置232处。如果分散相液滴212在保存室入口204处的流动速度超过临界进入液滴速度，则液滴没有凭借筛元件转移连续相流体214而得到充分减速，并且液滴不会在主通道216中或在保存室入口处进行润湿，但是会行进到保存室202中并按向上的轨迹来在室顶部203上的第四位置234处进行润湿。
尽管图3的第四位置234描绘为基本在室顶部203的中心处，但是本领域技术人员会理解，液滴212润湿顶部所处的位置会由液滴进入保存室202的速度、层流和液滴浮力来决定。此外，所述位置实际上可以位于顶部或保存室壁上的任何位置，而不必与主通道216共线。此外，还可以通过改变储存元件多个位置处的表面性能来影响液滴的定位。
一旦停靠在保存室202内部，液滴212就无限地固定，并与连续相流体214的高流动分开，使得液滴不会通过使连续相流体以最大速度从储存元件入口201流过储存元件200而被驱逐。无论如何，使液滴212变形所需的高界面能进一步确保其不穿过保存室出口206。
液滴融合
根据本发明的其它实施方案，在第一分散相液滴212已经固定后，另外的分散相液滴可以接着流入储存元件200中。每一后续液滴润湿储存元件表面所处的精确位置，无论是在主通道216内还是在保存室202内，都取决于后续液滴在其流过储存元件时的速度。如果流动速率保持恒定，则后续液滴会传送到并润湿到储存元件的与第一储存液滴位置相同的位置处的表面，并无限地保持与储存液滴接触，由此即使在使用部分稳定表面活性剂时也为合并提供充足的时间。在分散相流体中不存在表面活性剂时，液滴在接触后不久便合并，从而允许液滴在最大流动速率下连续融合。
几乎没有表面活性剂已经显示为能够使氟碳油中的水性液滴稳定(32；33)。然而，界面现象在液滴的形成期间是重要的。在连续相中不存在氟表面活性剂时，液滴可以在注入期间润湿通道壁，导致卫星液滴的形成和引入交叉污染的可能。对于测试的所有水性试剂，发现连续相中包含氟表面活性剂(17％PFO)(25)抑制液滴注入期间的润湿。该表面活性剂不阻止固定液滴润湿未处理的PDMS通道，并不使液滴稳定(32)。
除了连续相中的表面活性剂之外，可以包含第二分散相表面活性剂以降低分析物到通道壁或液滴表面的吸附。包含该分散相表面活性剂可以部分地使液滴稳定，并明显增加合并所需的时间。因此，当使用水性表面活性剂时，稳定的液滴融合可能需要它们保持接触较长的时间。然而，本装置和方法允许这种控制。无论如何，一旦传送到储存元件的液滴的总体积大到足以占据室体积的显著部分(约25％)，所有液滴就都与储存液滴融合。因此，如果最终储存液滴体积足够大且液滴融合的顺序不重要，则比临界进入液滴速度大得多的流动速度可以用于实现更快的配制。
或者，多个分散相液滴可以储存在单个储存元件内离散的位置。再次，每一后续液滴润湿储存元件表面所处的精确位置，无论是在主通道216内还是在保存室202内，都取决于后续液滴在其流过储存元件时的速度。因此，可以调整流动速率以将第二分散相液滴传送到储存元件内的第二位置，在所述第二位置处，将第二液滴与储存元件的表面分开的连续相流体膜破裂，且第二液滴润湿表面。
相似地，可以调整流动速率以将第三分散相液滴传送到储存元件内的第三位置，在所述第三位置处，将第三液滴与储存元件的表面分开的连续相流体膜破裂，且第三液滴润湿表面。如果第三位置与第一位置足够接近以使第三分散相液滴接触第一分散相液滴，则第一分散相液滴和第三分散相液滴可以无限地保持接触，从而为融合提供充足的时间。或者，如果第三位置与第二位置足够接近以使第三分散相液滴接触第二分散相液滴，则第二分散相液滴和第三分散相液滴可以无限地保持接触，从而为第二分散相液滴和第三分散相液滴合并提供充足的时间。在又一替代方案中，如果第三位置桥接第一位置和第二位置以使第三液滴接触第一分散相液滴和第二分散相液滴，则第三分散相液滴可以无限地保持与第一分散相液滴和第二分散相液滴接触，从而为全部三种分散相液滴合并为单个储存液滴提供充足的时间。
如本领域技术人员会理解的，该液滴储存方法允许直接在储存元件中通过连续或不连续地合并不同液滴类型来配制复杂的混合物，所述储存元件包含具有不同尺寸和化学成分的液滴。例如，包含不同底物、催化剂(包括酶)、试剂、缓冲剂等的液滴可以连续或不连续地传送到储存元件并在储存元件内合并。这使得能够精确配制和储存多步反应。储存元件阵列的可访问性和两相流动的性能还允许选择性洗脱任何储存液滴而不干扰相邻的室。
当在临界速度或在临界速度以下操作时，100％的合并可以是常规的。再次，如果最终储存液滴体积足够大且液滴融合的顺序不重要，则比临界进入液滴速度大得多的流动速度可以用于实现更快的配制。
液滴洗脱
保存室202的体积限定其可以包含的储存的一个液滴或多个液滴的体积的上限，在所述上限以上发生室的过度填充，其中液滴被夹断并泄露出储存元件。换言之，保存室202可操作地配置为保留储存液滴212，条件是储存液滴的体积小于保存室的体积。
因此，根据本发明的另一实施方案，储存在保存室202内的储存液滴可以通过使分散相流体的洗脱液滴流入保存室中而从储存元件200洗脱，其中储存液滴和洗脱液滴的合并体积超过保存室体积。进入洗脱液滴与储存液滴合并以形成洗脱流，其在超过保存室内洗脱流的体积时开始通过保存室出口206离开保存室202。该洗脱方法确保洗脱液滴的内含物总是包封在连续相流体中，并不在离开保存室202之后与储存元件壁接触。实际上，储存液滴的内含物可以利用体积为12.5倍保存室202体积的洗脱流来完全地洗脱。
阵列
参照图4，在300处概括示出根据本发明另一实施方案的包括储存元件的可访问阵列的微流体装置。装置300由95个如图3先前描绘的储存元件301的二维可访问阵列构成，布置为19行和5列。试剂可以单独地传送到每一储存元件301，并且反应产物可以单独地从每一储存元件301中提取出。在操作中，装置300充满连续相流体，且所有试剂都以分散相液滴的形式来处理。三阀蠕动泵303用于从8个试剂入口305分配任意体积的试剂，其中每一泵循环推动离散体积的分散相液滴。因此，使用者限定的体积可以使用编程数量的泵循环以离散增量形式计量出(34,35)。使用单个泵循环计量的体积在本文中被称为“泵增量”。试剂可以泵送到连续相流体的流动流中，然后分配的体积可以通过阀动而分裂为分散相液滴。
通过使用本领域已知的多路复用器例如(36)来选择活动行和使用一系列柱阀来选择活动列，从而独立地访问每一储存元件301。阀动模式产生从高压连续相流体输入端经过液滴计量单元到达选定储存元件并从两个低压出口(废物或洗脱)之一出来的独特流体路径。分配的分散相液滴通过连续相流体流动被输送到所访问的储存元件，这使全部进入液滴融合为储存液滴，从而配制所需溶液。分散相液滴经由共用进给通道307传送到每一行的储存元件301，并且洗脱流通过共用洗脱通道309从每一行的储存元件中收集。在储存元件301的洗脱期间，选定储存元件的内含物被冲到洗脱喷嘴311，其能够直接分配到标准microfuge管中。
为了实现自动化的液滴回收，装置300可以安装到由使工作台运动与液滴洗脱相协调的软件控制的定制3轴机器人机构(例如，参见图14)。来自每一室的洗脱液滴的沉积可以使用设计为适应标准microfuge管或微孔板的零死体积洗脱喷嘴311来实现。在液滴洗脱之间，可以用异丙醇清洗喷嘴以洗去任何可能保持与喷嘴外部附着的卫星液滴，所述卫星液滴会导致样品遗留。
装置300还可以包括集成的用于选择传送到阵列的完整细胞的细胞分选模块340。参照图5，在500处概括示出细胞分选模块。模块500允许将单细胞从悬浮液中目视分选到分散相液滴中，所述分散相液滴然后被传送到任何储存元件并与用于分析的试剂液滴合并。单细胞悬浮的悬浮液可以在通过显微镜目视监测隔离区域时沿着分选通道502向下泵送。当确定目标细胞504时，致动阀门506以隔离所述细胞，并将细胞泵入用于传送到储存阵列的液滴中。所使用的策略与Marcy等(9)所使用的策略相似，但是结合该装置的基于液滴的功能，允许单细胞处理的用途更广泛。
该微流体平台结合液滴的优点与微阀技术，以能够精确配制和储存多步反应。储存元件阵列的可访问性和两相流动的性能还允许选择性地洗脱任何储存液滴而不干扰相邻的室。
本领域技术人员会理解，图4所描述的装置结构可以仅通过适度增加控制复杂性来显著地规模化。例如，将部分多路复用器中控制线的数量从6增加到10会允许访问252行，其对应于使用5列布局的1260个储存元件的阵列。进一步的改善可以通过降低通道对增加液滴输送速度的抗性和通过减小每一储存元件的面积来容易地实现。
本领域技术人员还会理解，如本文所述的润湿和固定液滴的方法和系统可以利用影响润湿的其它特征来补充。表面特征可以引入到储存元件，这有利于润湿。可以改变主通道或保存室中的表面能构图以减小将液滴与表面分开的连续性流体膜的临界厚度，例如通过将经构图的亲水性聚丙烯酸光接枝到表面(42)。或者，当使用表面活性剂时，可以另外采用电润湿来帮助润湿和液滴融合。
储存液滴操作
高精度配制、可编程性和自动洗脱的组合能力允许执行长且多步的方案，而无需使用者干涉，使该系统良好地适合于需要仔细优化方案和实验条件且样品有限的应用。这类配制问题的实例包括酶表征、蛋白结晶、分子生物学方案的优化和组合化学合成。
根据本发明多个实施方案可处理用于多种不同分析的应用。例如，可以使用相同装置来进行多种单细胞实验，所述单细胞实验都需要不同的液体处理方案。这些包括表型分选、来自混合悬浮液的单细菌的培养、通过回收单细胞PCR扩增子并对其测序的基于PCR的单细菌物种鉴定以及对从生物膜分选的单细胞的多步全基因组分析。本文所述装置同样适用于微生物和较大的真核细胞，并与经证实的核酸的敏感和有效的扩增结合，这使这些体系对于单细胞分析引人关注，并在生殖药物和癌症研究中具有应用。装置还可以用于将多个选定的单细胞放入相同的小体积中，以允许在单细胞水平质证捕食者-猎物或病原体-宿主相互关系。
实施例1
1.1装置结构和操作
制造如图4所描绘的微流体装置以用于多个微流体应用。包括三阀蠕动泵的液滴计量单元(4)用于以大约133pL的泵增量从8个水入口分配任意体积的试剂。因此，可以使用编程数量的泵循环以离散的增量部分来计量出使用者限定的分散相液滴的体积。装置还包括如图5所描绘的集成细胞分选器。储存单元设计包括520μm长和10μm高的主通道520，以及沿着主通道每一侧的18个筛元件(30μm×10μm×5μm)。
1.2微流体装置制造和操作
本文所述装置使用多层软刻蚀来制造。通常，装置具有三层设计：顶层为“流动层”，包括用于液滴操作的通道。中间层为“控制层”，包括用于气动阀的通道。底层为“空白层”，控制通道密封到所述底层。所有装置都由聚二甲基硅氧烷(RTV615；General Electric)制成。装置在等离子体处理装置和载玻片(Harrick Plasma)的底部后与载玻片结合。光刻蚀掩膜通过使用AutoCAD软件(Autodesk)来设计，并用于产生高分辨(20000dpi)透明掩膜(CAD/Art Service)。模具通过在10.2cm硅片(Silicon Quest International)上的光刻蚀来制造。流动层由三种不同外形组成：5μm高的矩形熔块、12μm高的圆形通道和180μm高的圆柱形储存室。5μm层用SU8-5负性光刻胶(Microchem Corp.)制作，12μm圆形层用SPR220-7正性光刻胶(Microchem Corp.)制作，且180μm层用SU8-100负性光刻胶(Microchem Corp.)制作。控制层由两种不同外形组成：25μm高的矩形通道，其用于阀门；和5μm高的特征(featurs)，其用于控制线在流动通道下通过的部分，在该位置不需要阀门。5μm层用SU8-5负性光刻胶制作，且25μm层用SU8-2025负性光刻胶(Microchem Corp.)制作。根据制造商的说明来进行抗蚀剂处理。
使用在LabVIEWTM(National InstrumentsTM)中编写的定制软件来使微流体装置操作自动化。芯片上阀动使用连接到PCI-6533数字输入/输出卡(National InstrumentsTM)的气动电磁致动器(FluidigmTM)来控制。单个LabVIEWTM程序用于执行以文本文件输入的使用者设计的配制脚本。压缩空气(5psi-20psi)用于将试剂推入到装置中。在实验前，装置的死端填满载流体，所述载流体然后以0.5μL/分钟流过室阵列约1小时。在将芯片上反应洗脱到microfuge管中之前，每一管都充满轻矿物油，其优先在氟化载流体和水相两者上润湿PDMS，防止任何水性样品附着到喷嘴表面。轻矿物油的低密度还确保洗脱的样品沉到孔的底部，远离喷嘴尖端。在每一储存元件的洗脱之间，用异丙醇清洗喷嘴以洗去任何可能保持与喷嘴外部附着的水性液滴，所述水性液滴会导致样品遗留。在向microfuge管中的洗脱完成后，将另外的水或缓冲剂添加到每一管，以提供用于移液管的处理的足够体积，且管减慢旋转以确保所有水相在管底部合并。然后，可以通过从管的底部移液来提取样品以用于进一步处理。通过将装置安装到由3个互相连接的精密工作台T-LSM025A、T-LSR300D、T-LSR160D(ZaberTM)建成的3轴机器人上来进行自动液滴洗脱。装置使用真空泵来真空密封到下臂(图10)。LabViewTM控制用于使工作台位置和装置操作协调，以使在洗脱期间装置的洗脱喷嘴向选定的microfuge管中的插入自动化。
1.3试剂
在储存液滴配制期间，FC-40(粘度3.4cP)(Sigma AldrichTM)和1H,1H,2H,2H-全氟辛醇(PFO)(Sigma AldrichTM)的5:1的混合物(v/v)用作连续相流体。在洗脱期间，将其换为较低粘度的FC-72(粘度0.64cP)(Sigma AldrichTM)和PFO的5:1的混合物(v/v)，以实现用于较快洗脱的更高流动速度。Quasar670荧光染料从Biosearch TechnologiesTM获得。人类gDNA模板(BiochainTM)的PCR反应使用核糖核酸酶P FAMTM检测试剂盒(Biorad)和包含被动ROX荧光染料的Universal Fast PCRMixTM(BioradTM)来进行。扩增对K12大肠杆菌特异的16S rRNA基因片段的芯片上PCR反应使用来自Lee等(37)的引物序列(每个500nM)、LC绿色嵌入染料(Idaho TechnologyTMInc.)和包含被动ROX荧光染料的Itaq SupermixTM(BioradTM)来进行。扩增大肠杆菌和沙门氏菌中16SrRNA基因片段的PCR反应如上进行，但是使用以下引物：5'-TCGTGTTGTGAAATGTTGGGTT-3',5'-TAAGGGCCATGATGACTTGAC-3'。细菌DNA的所有芯片外PCR反应使用与芯片上相同的引物和引物浓度以及iQ SYBR Green SupermixTM(BioradTM)来进行。所有全基因组扩增(WGA)反应都使用Picople WGA Kit for Single CellsTM(Rubicon GenomicsTM)来进行。对于所有芯片上PCR和WGA实验，用0.1Tween20表面活性剂补充所有水溶液以避免试剂吸附到PDMS通道壁和液滴界面上，且试剂部分如制造商推荐地使用。
聚合酶链反应(PCR)。芯片上qPCR使用Biomark微流体qPCR仪器(FluidigmTM)的原型版本来进行，其由装备有照相机、荧光照明和滤光片的平台式热循环仪组成。芯片外qPCR使用Chromo4热循环仪(BioradTM)来进行，且数据使用Opticon MonitorTM3软件(BioradTM)来分析。用于核糖核酸酶P PCR的热循环方案包括最初在95C热起动20s，然后是40次95C下1s和60C下30s的循环。为了测定装置洗脱期间的交叉污染，连续洗脱的芯片上储存元件稀释到20μL的水中，且2μL该稀释物用作芯片外PCR反应中的模板。用于所有细菌的PCR反应的热循环方案包括最初在95C热起动3分钟，这还用于溶解细胞，然后是40次95C下10s、60C下30s和72C下30s的循环。
图像获取和分析。微流体装置安装到用于成像的DMIRE2TM荧光显微镜(LeicaTM)或SMZ1500TM立体镜(NikonTM)上。Leica L5和TX2滤光立方体分别用于成像GFP和RFP荧光。装置的静止图像使用CCD照相机(Q imaging RetigaTM4000R和CanonTM50D)来获取。视频使用IV-CCAM2CCD照相机(Industrial Vision SourceTM)来制作。共聚焦扫描仪(WellscopeTM,Biomedical PhotometricsTM)用于获取装置的共聚焦荧光扫描。
为了测量包含配制的荧光染料浓缩物的储存液滴的平均荧光强度，使用ImageJTM软件手动分析液滴阵列的荧光共聚焦扫描。数据的线性拟合使用MATLABTM中的曲线拟合工具盒来进行。
下文所述的所有定制图像分析软件是在MATLABTM(MathworksTM)中编写的，并使用来自Image Processing ToolboxTM的函数。假设球形液滴几何形状并使用定制软件分割和测定显微镜图像中储存液滴的半径，从而计算储存元件中储存液滴的体积。
编写定制软件以分析所有的芯片上qPCR图像。对于每一循环，液滴首先使用被动ROX染料图像来分割。对于所有芯片上反应，该染料都包含在PCR反应混合物中。因为芯片在PCR期间被加热到的高温使液滴在循环之间于储存元件中的位置稍微移动，所以每一循环后的分割都是必须的。通过被动ROX染料图像对FAM探针或LC绿色嵌入染料图像进行的像素分切用于使整个液滴阵列上的照明差异的数据标准化，并由于蒸发而引起信号增大。对于每一液滴，扩增曲线通过从第一循环的中值标准化像素强度中减去每一循环的中值标准化像素强度并移去从指前期中提取的线性部分来产生。进行指数期中扩增曲线的手动阈值化以测定每一液滴的CT。对于核糖核酸酶P qPCR实验，具有比在对应于单分子的平均CT之上2个标准差更大的CT的任何反应被确定为非特异扩增并归类为未检测到。
编写定制软件以分析从表达GFP和RFP的细菌的芯片上培养物中获取的荧光图像。当所使用的培养基在GFP通道中稍微发荧光时，第一GFP图像用于分割每一液滴。然后，每一液滴的边界稍微扩大以产生新的边界，其用于在所有后续图像中确定液滴。因为芯片的孵育以相当低的温度(25℃)进行，所以液滴在图像获取之间的时间间隔中不明显移动位置，并且该方法足以确定所有图像的所有液滴。为了产生每一储存液滴的生长曲线，首先对GFP和RFP通道中每一图像的每一液滴积分荧光强度，并且窗口宽度为3的移动平均滤波器应用于每一液滴的第3图像和最终图像之间的数据点以除去噪音。当比较每一两菌株共培养物中的终点GFP和RFP荧光时，通过将来自最终图像的每一通道中的积分荧光强度除以接种有相同数量细胞的共培养物的每一组的具有最高终点积分荧光强度的培养物来进行标准化。
有限元模拟。对流体流过液滴储存元件的模拟使用COMSOLv4.0a(COMSOL)来进行。使用FC-40的流体性质。
1.4试剂计量
使用三阀蠕动泵的可编程试剂分配用于通过改变泵循环的数量从八个单独的试剂入口以离散的增量传送任意体积的试剂(图3)。每一泵增量通过泵303的中间阀移动的体积来确定。装置制造为具有约133pL或150pL的泵增量。试剂液滴被直接分配到流动的压力驱动的载流体流中，其中所述试剂液滴通过表面张力、剪切应力和阀动的组合作用而分裂。所有试剂入口通道都设计为具有相同长度以防止流体阻力差影响不同试剂的计量精度。从液滴分散过程的视频中获取的时间进程图像示于图6中。液滴分配到其中的通道的横截面已经设计为具有低的长宽比和足够小的面积，使得单个泵增量形成占据大部分通道横截面积的液滴。液滴由此具有比其横截面直径更长的轴长，并在传输中通过载流体的薄膜与通道壁分开。“薄饼状”的液滴由此也处于能量不利的状态，这是因为其表面积未最小化。
1.5通过流动控制润湿的液滴对接和融合
流动控制润湿
FC-40和PFO的5:1混合物(v/v)用作连续相流体。为了使用等式1解出h0，假设R(将液滴与通道壁分开的近似载流体盘的半径)为50μm，且对于FC-40+17％PFO的连续相流体，γ为14mJ/m2。使用ξmax的最小值，大约为1.7，这是因为其导致膜的最大不稳定性。对于这些值，得到h0为大约8nm。将h0的值代入等式2以得到液滴速度，在所述液滴速度，膜厚度降低至临界厚度并发生液滴与通道表面的自发润湿，其中，r(液滴的半高度，假设液滴的高度近似为主通道的高度)为大约5μm，且FC-40的μ(粘度)为3.4cP，求解U得到大约170μm/s的临界速度。这些结果很好地符合通过分析视频以测定在液滴润湿通道壁前可获得的最低速度(100±50μm/s)而作出的实验估计。
储存元件设计允许3.9mm/s高的临界进入液滴速度。在临界进入液滴速度，液滴传送到阵列中的每一元件平均耗时7秒。从通过储存元件入口以3.9mm/s平均流动速度送到室的水的液滴的视频获取的时间进程图示于图7中，所述平均流动速度等于临界进入速度。
当液滴被以低于临界进入速度的流动速度送到储存元件时，液滴减速至远在储存元件上游的液滴润湿速度。在该情况下，其它液滴必须首先与其合并以使融合的液滴到达储存室的边缘，在该点处，其通过表面张力被拉入。从通过储存元件入口以2.9mm/s平均流动速度(小于临界进入速度)送到室的水的液滴的视频获取的静态图示于图8中。
该方法允许稳定的液滴融合，无论多个液滴到达储存元件之间的时间如何。当液滴以临界进入液滴速度或低于临界进入液滴速度送到储存元件时，在水相中有表面活性剂(0.1％Tween20)和没有表面活性剂两种情况下，通常观察到500次事件(10液滴×50室)中100％的合并。即使在将液滴送到储存元件之间等待几天之后，液滴也已经融合。在装置的长久加热之后，储存液滴还停留在储存室入口处，在许多分子生物学方案所需的延长的加热步骤之后允许其它试剂液滴与储存溶液融合。
储存室的体积仅限定储存液滴的体积的上限，但是储存元件设计允许以小于或等于该限制的任何体积配制和储存溶液，允许对最终溶液体积的可编程控制。
当高于临界进入液滴速度操作时，液滴不被侧壁充分减速，并进入保存室，而不润湿主通道的表面。在该情况下，自由液滴沿着上升轨迹，并最终在室顶部处停止移动，在该位置它们润湿并被固定。在流动速率恒定的前提下，每一进入液滴都传送到相同位置，并接触先前储存的液滴。在水相(即分散相)中不存在表面活性剂时，液滴在接触后不久合并，从而允许液滴在最大流动速率下连续融合。然而，当液滴成分包含表面活性剂时，聚结合并，导致最初添加期间短暂的液滴接触和不可靠的融合。然而，一旦传送到储存元件的液滴的总体积大到足以占据室体积的显著部分(约25％)，所有液滴就都与储存液滴融合。因此，如果最终储存液滴体积足够大且液滴融合的顺序不重要，则比临界进入液滴速度大得多的流动速度可以用于实现较快的配制。以该方案操作，储存元件可以在大约5秒中填充100个液滴。
从通过储存元件入口以7.2mm/s的平均流动速度(大于临界进入速度)送到室的水的液滴的视频获取的时间进程图示于图9中。在最后的图中，焦点已经移动到室的顶部以显示液滴位于室顶部处。然而，除了载体相(即连续相)中的表面活性剂之外，通常还期望在水相(分散相)中包含表面活性剂以降低分析物到装置水性部分中通道壁或到液滴界面的吸附。已经观察到包含这类表面活性剂(0.1％Tween20)部分地使液滴稳定，显著增加合并所需的时间。因此，当液滴内含物包含表面活性剂时，高于临界进入速度送到室中的液滴仅短暂地与之前储存的液滴接触，从之前储存的液滴“弹开”并在室顶部上的不同位置处变成静止。因此，当使用水性表面活性剂时，送到储存元件的每一液滴的稳定融合需要它们保持长时间接触，这仅能够通过以临界进入速度或低于临界进入速度操作来确保，从而确保通过润湿的液滴固定。使用这些流动速度操作装置，在水相中有表面活性剂(0.1％Tween20)和没有表面活性剂两种情况下，通常观察到1000次事件(20液滴×50室)中100％的合并。
具有和没有表面活性剂的润湿到储存元件在保存室入口处的表面的储存液滴分别示于图10A和10B中。这些液滴通过低于临界进入液滴速度传送到主通道的20个离散的分散相液滴的融合来形成。水性表面活性剂显示为增强液滴到PDMS表面上的湿润，如在图9B中可以通过减小的接触角所看到的。
图11为在2.5μm高度(该装置的筛元件的半高度)通过储存元件的流动速度的有限元模拟，且图12为在通过储存元件中心的垂直面上的流动速度的有限元模拟。阴影表示储存元件中的流动速率在流体接近保存室时降低。朝向主通道入口的暗阴影对应于最高流动速率，而保存室中的暗阴影对应于最低流动速率。一旦在室内部对接，液滴就与高流动分开，并不会通过储存元件入口在最大可获得流动速度(约50mm/s)下被驱逐。
试剂包封到液滴中消除不需要的扩散，同时其还有利于液滴内改善的混合。储存液滴的球形形状具有比试剂必须扩散以在典型的单相微流体体系中实现完全混合所经历的距离更小的直径，所述典型的单相微流体体系使用一系列互相连接的室以进行多步反应。仅通过扩散完全混合储存液滴所需的时间由此显著更短，这是因为分析物的扩散时间与扩散距离具有二次方依赖性。另外，由载流体将液滴输送到储存元件时相对于储存液滴的流动赋予的剪切应力导致平流混合液滴内含物的再循环流动，进一步减少混合时间。这些因素还允许添加小试剂体积并迅速与大得多的储存液滴混合，这在典型的单相体系中是有问题的，因为来自小室的试剂会花费长时间来扩散地完全混合到具有大得多的尺寸的相邻室中。
1.6选定液滴的自动洗脱
可以利用储存室阵列的可访问性和两相流动的区室化来实现单个储存液滴以完全自动化方式和在储存室之间具有可忽略的交叉污染的方式直接到标准微升体积管中的任意洗脱。在洗脱期间，相同的压力施加到水入口(aqueous inlet)和油入口之一，所述水入口和油入口在试剂计量模块的T连接处交叉。这导致连续的油封装的水流，其可以被引导至阵列的任何元件。所述流与储存元件中的储存液滴合并以形成洗脱流。如果洗脱流的体积超过保存室体积，则当前包含储存液滴内含物的油封装的水流会从元件中排出，并被引导至洗脱通道。图13为示出使用包封在油中的水的洗脱液滴的保存室的洗脱的光学显微图。包围该洗脱流的油使水相(即分散相)和通道壁之间的接触最小化，从而使与其它储存单元的内含物的交叉污染最小化。
用于洗脱的水相总体积可以通过对使水相流动到T连接中的时间编程来控制。在该实施方案中，保存室内含物的完全回收可以通过用大约500nL水(等同于12.5倍的最大储存液滴体积)冲洗储存元件来实现。染料的储存液滴的洗脱表示该体积足以完全冲洗储存单元。来自每一室的洗脱液滴的沉积使用设计为适应标准microfuge管形式的零死体积的洗脱喷嘴来实现。
为了实现自动化的液滴洗脱，如图14所描绘的，装置经由真空吸盘安装到定制的由3个互相连接的精密工作台建成的3轴机器人，其允许洗脱喷嘴的精确位置的自动化控制。定制软件用于基于使用者限定的网格的三个角的位置来计算任何二维网格中每个孔的位置，并使得在洗脱期间能够自动地将洗脱喷嘴插入到选定的孔中。每个孔都预填有轻矿物油，且洗脱喷嘴的尖端在洗脱开始前完全浸入。因为轻矿物油与PDMS的界面张力比水相和氟碳相两者都低，所以其覆盖洗脱通道的开口和洗脱臂的外部表面，防止任何洗脱水相附着到外部喷嘴表面和污染喷嘴降低到其中的下一个孔。因为轻矿物油还具有比水低的密度，所以从洗脱通道排出的水性液滴沉到孔的底部以使到喷嘴上的水性附着的可能性最小化。使用约5μL体积的洗脱足以确保在洗脱过程结束时可以停留在喷嘴外部的任何水性液滴包含可忽略量的储存液滴内含物。
在所访问的储存室的洗脱完成之后，在其它储存室的洗脱路径中的阵列的通道可以相似地用水流冲洗以确保排出任何可能的污染液滴。作为最后的预防措施，在每一储存元件的洗脱后，可以在异丙醇浴中清洗喷嘴以洗去任何可能保持与喷嘴外部附着并会导致样品遗留的水性液滴。可以选择异丙醇，这是因为其溶解轻矿物油，从而使得能够冲走喷嘴外部上的水性液滴，所述喷嘴外部可以包围在轻矿物油中。在洗脱之后，可以将其它水性缓冲剂添加到管以获得用于由移液管处理的更大体积，并且将管进行离心以确保所有水性组分的合并。
1.7配制实施
为了测定微流体方法和装置的配制准确度，通过分配编程数量(在该情况下200个)的1μM染料或稀释缓冲剂的泵增量来配制具有100nM至1μM的十个不同荧光染料浓度的一系列26.6nL的储存液滴。如图15所示，发现根据平均荧光强度测量的所得染料浓度符合全范围内的目标值(R2＝0.999)，平均差异系数为1.4％。图15的插图示出储存液滴阵列相应的荧光共聚焦图像，基准尺表示1mm。
还通过将5个泵增量的水从8个水入口的每一个传送到9个横跨阵列的储存元件来评价计量精度。通过显微镜和图像分析来测定72个储存元件的每一个中的储存液滴体积。图16为示出测量的从8个试剂入口的每一个中装载的9个不同保存室中储存液滴的体积的散点图。平均储存液滴体积由实心圆表示，在顶部表明标准差。对于全部72个元件，泵增量的平均绝对体积被确定为133pL，标准差为4.8％(图16)，这接近成像测量的准确度。
作为任意和可访问的配制的证明，装置以如图17所示的可编程显示器形式使用。由300个泵增量的组合而形成的储存液滴通过从每一字母的顶部到底部使用三种有色染料的两倍稀释系列而在储存阵列上排列为三个字母。液滴计量单元在显微图的右下角处可见。
为了测定在本装置中发生蛋白吸附到液滴界面的程度，磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的牛血清蛋白(BSA)和Alexa488标记的纤维蛋白原的储存液滴使用不同的添加到氟相和水相的表面活性剂来进行荧光成像。已知BSA和纤维蛋白原吸附多种表面，并通常用作蛋白吸附研究中的测试蛋白。测试四种表面活性剂组合：PFO与FC-40的混合物(1:5v/v比例)作为载体相，水相添加和不添加0.1％的Tween20；和OEG封端的氟表面活性剂与FC-40的混合物(1:4v/v比例)作为载体相，水相添加和不添加0.1％的Tween20。后一氟表面活性剂从Zonyl FSO-100中提取。
FITC标记BSA的储存液滴的荧光图相示于18A、18B、18C和18D中。首先用100nM的BSA溶液测试PFO/Tween20组合(图18A)。未观察到明显的到液滴界面的吸附，因为荧光强度朝着液滴的边缘逐渐变弱。接着，对使用相同载流体但没有Tween20的BSA溶液成像，并且使用相同的照相机曝光和增益设定几乎检测不到荧光。需要将BSA浓度增加10倍至1μM以获得可比较的荧光强度(图18B)，提供在包封到液滴中之前BSA吸附到PDMS通道壁的证据。此外，到液滴界面的吸附以在液滴边缘处增加的荧光强度的环形式而在图18B中清楚可见。图18A和图18B之间的对比表明包含Tween20防止蛋白吸附到液滴界面。使用另一装置，测试OEG封端的氟表面活性剂/Tween20组合，再次使用1μM的BSA溶液(图18C)。未观察到明显的到液滴界面的吸附。然而，该氟表面活性剂在输送和储存期间在防止液滴附着到PDMS壁上方面明显不如PFO有效。在输送期间，其导致卫星液滴的偶尔分裂。然后对没有Tween20的BSA溶液成像(图18D)，且液滴的荧光强度相对于具有Tween20的溶液降低，再次证实Tween20防止吸附到PDMS通道壁。与使用PFO的测试情况对比，未看到BSA吸附到液滴界面。
使用Alexa488标记的纤维蛋白原获得与以上表明活性剂组合相似的结果。虽然仅测试了BSA和纤维蛋白原，但是这些结果表明对于两种测试的氟表面活性剂，在水相中包含0.1％的Tween20防止蛋白吸附到PDMS表面和氟/水液滴界面两者。考虑到在防止不需要的液滴附着到通道壁方面观察到PFO优于OEG封端的氟表面活性剂，得出以下结论：将PFO添加到载体相并将Tween20添加到水相防止不需要的蛋白吸附，同时保持期望的基于液滴的流体处理功能。
1.8配制的模板稀释物的芯片上定量PCR(qPCR)。基于液滴的微流体在基因组学应用中受到大量关注，其中小体积区室化已经显示出增加分析灵敏度和精密度(38)。为了验证储存元件用于核酸处理的有效性，对不同模板浓度的90个储存液滴进行芯片上配制的模板稀释物的qPCR。在室中合并人类基因组DNA(gDNA)或水的100个泵增量(约13.3nL)以配制每个反应44.33(133pg,N＝4)、11.08(33.25pg,N＝4)、2.66(7.98pg,N＝39)、0.89(2.66pg,N＝39)和0(N＝4)单倍体基因组拷贝(假设3pg/单倍体基因组)的模板稀释物。然后，通过将PCR主混合物的液滴分配到每一保存室来组装PCR反应，所述保存室包含引物和设计为用于检测以单个拷贝/单倍体基因组存在的核糖核酸酶P基因的水解探针。在反应组装后，在微流体qPCR仪器上对装置进行热循环，并在每一循环获取荧光图像。在最后循环后液滴阵列的最后荧光图像示于图19中。在左侧表明预期的单倍体当量/液滴。矩形指出芯片外混合的对照反应。基准尺表示1mm。在最低的两个模板浓度中可以看到扩增的数字图案。储存液滴的形状由于PCR溶液到室壁上的润湿而是非球形的。
使用定制图像分析软件处理图像以产生如图20所报道的每一液滴的实时扩增曲线。测量的循环阈值(CT)的值在图21报道，误差棒表示全部重复实验的标准差。两个最高稀释物的CT值分别为22.56(SD＝0.12)和24.49(SD＝0.14)，对应于9.4％的浓度测量的绝对精度，这接近qPCR的极限。发现对应于4倍稀释的CT差(ΔCT)为1.93±0.18，表明96.5％的PCR效率。在两个最低稀释物处，观察到扩增的数字图案，在每室2.66基因组当量下，37/39(95％)的阳性室，且在每室0.89基因组当量下，18/39(46％)阳性室。假设通过泊松统计确定的每室占据的二项分布，每室2.66和0.89基因组拷贝的预期频率分别为93％和59％。观察到的频率落在围绕以下这些频率构建的对称的95％二项置信区间内：对于每室2.66拷贝为79％至98％，且对于每室0.89拷贝为42％至74％。这些结果表明装置适于具有高的效率和单分子灵敏度的基于PCR的有限样品分析。
1.9配制和洗脱期间交叉污染的定量
以上qPCR分析用于定量连续装载室之间的交叉污染。以棋盘图案交替装载50个室，每一个都接受100个泵增量(约13.3nL)的与基因组DNA(约1476个基因组当量)或无模板对照(NTC)预混合的PCR试剂。该棋盘图案使到具有不同内含物的储存室的共享流体路径长度最大化，从而使该交叉污染的测试尽可能严格。图22为在40次PCR循环后的终点荧光图像的显微图，其示出所有阳性室都成功地扩增，而没有NTC室扩增，表明在装载期间没有出现可检测的交叉污染。基于经证实的检测靶标基因的单拷贝的能力，交叉污染的上边界被确定为1/1476。
接着，测量储存液滴洗脱期间的交叉污染。在交替的水和PCR液滴的棋盘图案中，首先用100个泵增量的水装载47个室，然后用等体积的包含DNA模板(18个基因组当量)的qPCR溶液装载另外47个室。在芯片上PCR扩增的40次循环后，PCR产物和水液滴的对交替地从装置洗脱到单独的microfuge管中。然后每一样品稀释到在20μL水中，且2μL该稀释物用作芯片外qPCR反应中的模板以评估洗脱模板的相对量。计算PCR和水反应之间的ΔCT，且以2ΔCT计算相对浓度差倍数，其对应于孔之间遗留的程度。包含扩增的模板和水的液滴的洗脱对中模板的浓度差倍数示于图23中，水平线表示平均值。所有洗脱对的绝对平均浓度差倍数为4.84×105，标准差为19.8。即使对于最严格的下游分析，包括测序、克隆或基因表达谱，该低水平的交叉污染也是可接受的。
通过在用约500nL水洗脱之前和之后获取5μM荧光素标记的40个碱基(40-mer)寡核苷酸的40nL储存液滴的荧光图像来测试储存室的洗脱。然后，对用水填充至等体积的单独的室进行成像。从洗脱室的通过ImageJ软件测量的平均荧光强度中减去水填充室的通过ImageJ软件测量的平均荧光强度以扣除背景荧光，发现结果为洗脱前寡核苷酸填充室的0.16％，表明99.84％的样品回收。还对等体积的三个其它水填充室成像以测量成像测量的噪音。发现差异系数为1.7％。
在另一实施方案中，可以使用至少5μL的水来洗脱每一室，以确保储存室内含物不保持附着到洗脱喷嘴外部，而是沉到轻矿物油填充的microfuge管的底部。因为这是相对于用于上述洗脱测试的体积的10倍增加，所以基本上保证室内含物的完全洗脱。
1.10单细菌分选和培养
因为单细胞水平的遗传变异和表达变异分析已经显示为产生显著的生物洞察，所以分离和实施多种单细胞分析方案的能力在任何可编程微流体系统中是非常需要的。液滴特别良好地适合于细菌的分离和操作(39；40)，否则所述细菌由于其小的尺寸而难以使用芯片上的流体动力学捕捉机构来操作。在本实施方案中的集成细胞分选器使得能够将单细胞基于形态学或荧光而分类到可以被引导至任何室的液滴中。该能力用于实施经分选的单细菌的多种实验。
1.10.1基于表型的单细胞的分选
为了证实装置用于从混合的群体和单克隆细菌培养物中基于表型而分选出单细胞的能力，对来自包含表达绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(RFP)的鼠伤寒沙门氏菌SL1344(41)的两种菌株的悬浮液的单细菌进行分选和培养。
在芯片上细菌培养之前，具有氨苄西林抗性基因的鼠伤寒沙门氏菌SL1344的表达GFP和RFP的菌株首先各自在具有100μg/mL氨苄西林的2mL的LB肉汤(Sigma AldrichTM)中在37C有氧地培养约18小时以达到静止生长期(约109细胞/mL)。然后，对于每一菌株，2mL的新鲜培养基用6μL细胞培养物接种，并再孵育2小时以产生指数生长期培养物，其在芯片上单细胞分选之前以1:1的比例混合并稀释至约1个细胞/10nL的浓度，以确保在通道交叉点中在任何给定时间不存在多于一个的细胞，所述通道交叉点具有约300pL的体积。两种菌株的静止生长期培养物的浓度通过吸光度(OD600)测量为相等的，然后培养基中这些培养物的10×稀释物用于接种芯片上的多个细胞培养物。所使用的K12大肠杆菌细菌(ATCC10798)的悬浮液如上那样来进行培养和制备，但是在培养基中没有氨苄西林，所述悬浮液在芯片上使用之前用SYTO9DNA染色剂(InvitrogenTM)染色。对于芯片上的PCR和WGA实验，细菌培养物在PBS中再悬浮3次以在芯片上使用之前从悬浮液流体中移去游离的DNA。
用于检测GFP和RFP的滤光立方体用于鉴定每一菌株的细胞。使用细胞分选器，将每一菌株的20个单细胞分选到单独的储存元件中以在阵列上以棋盘图案接种单克隆培养物。图24为储存液滴中单个表达RFP的沙门氏菌的重叠的亮视场和荧光显微图的图。箭头尖端的亮点为细菌。还将每一菌株的单细胞分选到相同的储存元件中以接种20个单细胞共培养物。单菌株培养物还接种有大约100个细胞(N＝5)，以及共培养物接种有两种菌株的大约10(N＝5)、100(N＝5)和1000(N＝5)个细胞。在将细胞装载到储存元件中时，用从单独的试剂入口分配至约40nL最终体积的液滴中的生长培养基填充所述储存元件。然后，将装置放置在如上所述的微流体qPCR仪器上，且温度设定为25℃，每10分钟获取一次GFP和RFP通道荧光图像，持续23.3小时。图像使用定制图像分析软件进行处理以对于每一培养物产生基于测量的GFP和RFP表达的生长曲线。表达GFP和RFP的细胞的生长曲线分别示于图25和图26中。
在孵育周期后，利用共聚焦扫描仪对液滴阵列成像。在孵育后阵列中所有培养物的GFP和RFP通道共聚焦扫描示于图27中。基准尺为1mm。培养物接种有：(1)单细胞(阵列的暗的部分为不成功的培养物)。每一行中的储存元件交替地用表达GFP或RFP的菌株接种，使得每一成功的培养物有不同读数或为绿色；(2)每一菌株的单细胞。单细胞共培养物表现出随机分布，其中一种菌株或另一种菌株偶然地在培养物中占主导地位，使得培养物为纯红色或纯绿色；(3)每一菌株的约1000个细胞。培养物不由一种菌株或另一种菌株主导，使得没有培养物是纯红色或纯绿色；(4)每一菌株的约100个细胞。培养物不由一种菌株或另一种菌株主导，使得没有培养物是纯红色或纯绿色；(5)每一菌株的约10个细胞。培养物不由一种菌株或另一种菌株主导，使得没有培养物是纯红色或纯绿色；(6)约100个表达GFP的细胞。每一培养物都是纯绿色；(7)约100个表达RFP的细胞。每一培养物都是纯绿色。
20个表达GFP的单克隆培养物中的17个(85％)和20个表达RFP的单克隆培养物中的16个(80％)(分别地)成功地生长。在表达RFP的单克隆培养物中检测不到GFP荧光，反之亦然，表明无污染的细胞分选。将每一菌株不同数量的细胞装载到相同培养物中的能力使得能够检查竞争性共培养物中的随机性。图28为示出用于接种有不同数量的两种细胞的共培养物的GFP和RFP通道的标准化终点强度的散点图。如可以看到的，单细胞共培养物表现出随机分布，其中一种菌株或另一种菌株偶然地在培养物中占主导地位。然而，随着每一菌株的接种细胞数量增加，该随机性效果削弱，且数据点收敛于对角线。
1.10.2基于PCR的单细菌的基因分型
单细胞的遗传分析成为理解复杂生物体系的必要事务。可能这在任何地方都不比在微生物领域中重要，在所述微生物领域中每个细胞都是一个独特的生物体，且用于克隆扩散的体外培养物通常是不可能的。为了证实该装置用于单细菌的遗传分析的用途，进行从悬浮液分选的单个K12大肠杆菌细菌的基于PCR的基因分型。62个储存元件用单细胞装载，5个储存元件用大约100个指数生长期的细胞装载，且10个储存元件不装载细胞(如在细胞分选期间确定的)。然后，所有储存元件用PCR主混合物装载，所述PCR主混合物包含设计为用于检测16S rRNA基因(在大肠杆菌中以每基因组7拷贝存在)的菌株特异片段的引物以及嵌入染料。在反应组装后，在微流体qPCR仪器上对装置进行热循环，并对每一液滴产生qPCR曲线。qPCR曲线示于图29中。示于图30中的CT值通过qPCR曲线来计算(误差棒表示标准差)。62个单细胞中的60个(97％)、5个多细胞反应中的4个(80％)成功地扩增靶标序列，且无细胞对照反应中没有一个成功扩增靶标序列，证实装置允许单细菌分析而没有反应之间的污染。发现单细胞和100个细胞反应之间的ΔCT为6.52±2.06，表明98％的分析效率。
在qPCR后，来自每一芯片上反应的扩增子被洗脱，在标准微升规模反应中进一步扩增，并进行凝胶纯化以获得足以用于测序的DNA质量。随机选择单细胞反应扩增子中的十个用于毛细管测序，其结果验证了对于所有十个反应已经获得正确的序列。
在许多应用中，鉴定混合群体中存在的细菌物种会是重要的。尽管可以采用如以上使用的物种特异的分析来检测在大背景中单个靶标物种的存在(39)，但是有时需要检测多个物种或鉴定样品的未知成员。对于这类应用，物种特异的分析是无效的。较好的策略是使用单个分析来扩增其序列可以用于鉴定的基因组区域。作为此点的证明，对从大肠杆菌(E.coli)和表达RFP的鼠伤寒沙门氏菌的混合群体中分选的单细菌进行基于PCR扩增和16S rRNA基因测序的基因分型实验。大肠杆菌细胞用荧光SYTO9DNA染色剂染色，所述染色剂在GFP通道发荧光，以通过荧光显微镜将其与表达RFP的鼠伤寒沙门氏菌区分开。储存元件用单鼠伤寒沙门氏菌(N＝30)、单大肠杆菌(N＝29)、约50个鼠伤寒沙门氏菌(N＝5)和约50个大肠杆菌(N＝5)装载，并与包含嵌入染料和靶向16S rRNA基因的144-bp片段的引物的PCR试剂混合。该片段的序列在两个物种之间的不同之处为四个单碱基对错配。进行芯片上的qPCR，包括最初在95C的3分钟加热步骤以进行细菌的热溶解，且根据获取的图像建立所有反应的qPCR曲线(图31)。
如通过每一反应的qPCR曲线所测定的，在30个单鼠伤寒沙门氏菌中的16个(53％)和29个单大肠杆菌中的25个(86％)中扩增了靶标序列。单细胞反应和约50个细胞反应之间的平均CT的差对于鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌分别为1.96和7.24(图32)，分别表明71.7％和636％的次优PCR效率。在PCR之后，洗脱来自每一反应的扩增子，且随机选择来自每一物种的六个成功的单细胞反应以用于进一步的芯片外扩增和毛细管测序。基于144-bp扩增子的四个错配位置处的序列数据，正确地鉴定了所有六个单大肠杆菌细胞和六个单鼠伤寒沙门氏菌细胞中的五个。不能鉴定的单鼠伤寒沙门氏菌扩增子也不匹配预期的大肠杆菌序列。这些结果证实使用该方法通过使用单次分析和扩增子测序来鉴定来自混合群体的单个分选细菌的能力。
1.10.3单细胞全基因组扩增
作为该方法的细胞处理能力的灵活性和可编程性的进一步证明，使用两个装置对127个单大肠杆菌细胞进行多步全基因组扩增(WGA)过程。还进行了无细胞对照反应(N＝20)以及大约10个细胞(N＝10)和1000个细胞(N＝10)的反应。
通过将装置放到平台式热循环仪上并将装置捆扎到加热表面以确保良好的热接触，从而进行用于芯片上WGA的热循环步骤。使用制造商推荐的热循环方案。为了定量芯片上WGA扩增的大肠杆菌DNA，将洗脱样品稀释到20μL水中，2μL该稀释物在使用上述K12大肠杆菌特异分析的芯片外qPCR反应中使用。将CT值与来自标准曲线的值比较，所述标准曲线由具有已知16S rRNA拷贝数(每基因组7个)的纯化大肠杆菌gDNA(ATCC)的稀释物的qPCR反应产生(图33)。考虑装置洗脱期间的稀释因数以定量芯片上扩增。不包含细胞、包含单细胞、约10个细胞和约1000个细胞的反应分别产生220、2.5×106、3.2×106和4.3×106的平均拷贝数。所有单细胞反应中拷贝数的差异系数为507％，且127个单细胞反应中的72个(57％)导致16S rRNA基因相对于单细胞中存在的7个拷贝至少100倍的扩增。考虑到WGA化学中已知的偏差可能导致与我们的分析靶向的基因组区域不同的基因组区域的扩增，这种对于成功单细胞WGA的衡量标准是严格的衡量标准。
选择来自六个成功单细胞反应、两个无细胞对照反应和一个约1000个细胞的反应的产物以用于通过使用Illumina GenomeAnalyzerTM2平台的焦磷酸测序来进一步分析。还对作为阳性对照的纯化的未扩增gDNA进行测序。用于每一单细胞的测序库由直接从芯片上洗脱的反应产物以及在微升规模反应中的进一步扩增后的反应产物构建。
来自每一芯片上反应的细菌PCR扩增子首先被洗脱，并稀释到20μL水中，2μL该稀释物用作芯片外PCR反应的模板。然后，该扩增子在琼脂糖凝胶上跑动，将带剪出，并使用Qiagen QiaguickTM GelExtraction试剂盒提取DNA。然后，DNA使用具有POP-7Terminator v3.1测序化学的Applied BiosystemsTM3730S48-毛细管DNA分析仪进行测序。测序数据使用CLC Bio Main WorkbenchTM软件进行分析。通过大肠杆菌和沙门氏菌中的大肠杆菌/沙门氏菌16SrRNA分析扩增的片段的预期序列(分别)为：
TCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTA
和
TCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTA
两个扩增子都是144bp长，在51、67、68和87位置处的两个序列之间具有错配。
待测序的来自每一芯片上WGA反应的反应产物首先被芯片外洗脱，并稀释到30或40μL水中。将5μL该稀释物添加到包含31.25μL扩增缓冲剂、37.75μL水和1μL扩增酶的第2芯片外再扩增反应。WGA产物的所有测序以Illumina Genome Analyzer IIx方案进行。大肠杆菌样品使用对于1轮和2轮WGA扩增分别为75和50个bp的双端读数来进行测序。所有口腔样品数据使用双端读数进行测序。
测序统计概述于表1中。单细胞反应的>＝1x的基因组覆盖度对于芯片上WGA产物在15.2％至64.6％的范围内，且在第二轮扩增后在24.5％至62.77％的范围内，而无细胞对照与参照基因组未显示显著的对齐。大约1000个细胞的反应具有与具有最高覆盖度的单细胞反应相当的覆盖度，表明扩增是偏差限制的而不是模板限制的。
表1.用于单个大肠杆菌测序的统计
1.10.4从人类口腔中分离的微生物聚集体的全基因组扩增
为了证实装置对来自环境样品的微生物进行遗传分析的能力，对在PBS中再悬浮并用荧光DNA染色剂染色的从口腔生物膜样品分离的单个微生物进行WGA。对70个分选的单细胞以及5个无细胞对照反应进行WGA。随机选择单细胞反应中的二十二个和一个无细胞对照反应以用于第二轮的芯片外扩增和焦磷酸测序。然后，将测序数据与编目的人类口腔微生物组的宏基因组(http://www.homd.org)进行比较，表明多个生物体被分选到每一储存元件中，或者在反应中存在污染的DNA。然而，该证明说明了装置和方法用于来自环境样品的微生物的遗传质证的用途。
1.10.5基于MDA的单微生物的全基因组扩增
可商购的基于MDA的WGA方案(Repli-G,Qiagen)也使用相同的大肠杆菌菌株来评价。最初，按照制造商推荐的方案，其使用包含二硫苏糖醇(DTT)的碱性溶解缓冲剂使细胞溶解并使基因组DNA变性，然后添加中和缓冲剂和phi29DNA聚合酶以及用于MDA反应的随机引物。然而，如上所述，如通过16s rRNA基因的菌株特异片段的qPCR所测定的，单细胞反应是不成功的。测试对推荐方案的修改，发现在碱性溶解缓冲剂中省去DTT对于成功的单细胞MDA是关键的。
为了直接比较使用和不使用DTT的反应，在单个装置上使用包含DTT的溶解缓冲剂或其中用水代替DTT的另一种溶解缓冲剂进行总共90个反应。对于每一溶解缓冲剂，对单细胞(N＝30)、约400个细胞(N＝5)和约4000个细胞(N＝5)进行MDA反应。还使用不含DTT的溶解缓冲剂进行十个无细胞对照反应。在MDA反应完成后，产物被洗脱并进行扩增。定量每一反应中的16S rRNA拷贝数(图34)。
在溶解缓冲剂中使用DTT的MDA反应产生依赖于起始模板数量的可变16S rRNA基因扩增。由单细胞反应产生的平均拷贝数可以比得上无细胞对照反应的平均拷贝数(分别为61和95)，而400个细胞和4000个细胞的反应分别产生1.5×104和5.5×107的平均拷贝数。与此相反，不使用DTT进行的MDA反应对于所有起始模板量都产生可以比得上分别具有2.2×107、6.9×107和4.5×107的平均值的单细胞、400个细胞和4000个细胞的扩增拷贝数。因为MDA反应的DNA产量应独立于起始原料的量，所以这些结果从而表明，在本装置中，DTT对依赖于起始模板数量的MDA反应具有抑制效果。
由不使用DTT进行的单细胞MDA反应得到的平均16S rRNA拷贝数为基于单细胞PCR的WGA反应的拷贝数的8.8倍，且差异系数为205％，其是基于单细胞PCR的WGA反应的差异系数的2.5分之一。这些结果表明MDA可以是比之前使用的基于PCR的方案更稳定的用于单细胞WGA的方案。因此，qPCR分析用于定量在溶解缓冲剂中不含DTT进行的2个无细胞对照反应和30个单细胞反应中横跨大肠杆菌基因组的10个单拷贝位点的拷贝数(图35)，作为MDA反应中代表性偏差的最初标准。对于全部30个单细胞反应，全部10个位点的平均拷贝数的差异系数为84％，比Marcy等报道的低。
为了更完整地评价代表性偏差，进行对来自这些反应之一的产物的测序，这次使用Ion Torrent PGM测序仪器。还进行常规的微升体积MDA反应，并对其产物进行测序以将其性能与微流体反应比较。对纳升体积的微流体单细胞反应、对该微流体反应的产物进行的第二微升体积MDA反应、微流体无细胞对照反应、单FACS分选细胞的常规微升体积MDA反应进行测序，且未扩增的纯化大肠杆菌基因组DNA作为阳性对照。测序结果和组装重叠群与大肠杆菌参照基因组对齐，以产生每一样品的覆盖度统计，其概述于表2中。
表2：用于单大肠杆菌的基于MDA的WGA的测序统计
如从表2中可以看到的，相对于其它测序样品，纳升体积的MDA产物包含与预期的参照基因组对齐的非常小部分的测序数据，表明存在一些污染。
1.10.6纳升MDA中特别低的代表性偏差
为了比较所有MDA反应的代表性偏差，首先在1×至16×范围内的平均覆盖深度下对与来自每一反应类型的大肠杆菌对齐的测序数据进行随机二次抽样，以比较等量的每一反应的数据。显示在16×的平均覆盖深度下覆盖大肠杆菌参照基因组的每一位置的测序结果的数量的每一反应类型的覆盖度图示于图37中。根据这些覆盖度图，可以定量地看到，单细胞MDA反应的纳升体积反应具有最小的覆盖度差异，按照差异增加的顺序然后是组合的纳升/微升反应和微升反应。经测序的两个纳升单细胞反应的显示最小覆盖度至最大覆盖度的重叠标准化覆盖度图示于图38中。
为了更定量地评价每一MDA反应类型的偏差，发现在1×至16×范围内的平均覆盖深度下覆盖的参照的分数如图39所示。还显示了如泊松统计预测的会从完全无偏差样品获得的理想覆盖度。单细胞纳升反应和组合的纳升/微升反应在所有平均覆盖深度下都具有与未扩增基因组DNA的参照覆盖度非常相似的参照覆盖度，而单细胞微升反应的参照覆盖度明显较低，证实偏差通过进行纳升体积的MDA而大幅降低。对于所有平均覆盖深度，纳升反应实际上具有比组合的纳升/微升反应的参照覆盖度稍高的参照覆盖度，表明单独的微流体反应相对于组合的纳升/微升反应可以以千分之一的试剂消耗实现等同或稍低的代表性偏差。如可以预期的，该差别在较低的平均覆盖深度下最明显，且在较高的深度下降低。在2×的平均覆盖深度下，未扩增的基因组DNA、纳升反应、组合的纳升/微升反应和微升反应分别具有84.4％、83.1％、81％和72.2％的参照覆盖度。在8×的平均覆盖深度下，单细胞纳升反应覆盖99.1％的参照。据发明人所知，这些结果代表迄今报道的从单细胞WGA反应获得的最高参照覆盖度和最低代表性偏差。
为了进一步描绘每一反应类型的偏差，作出在16×的平均覆盖深度的各个深度下覆盖的参照基因组的分数的柱状图(图40)。还示出了如泊松统计预测的对于理想无偏差样品获得的结果。代表性偏差的数值测量为参照的每一位置的覆盖度的差异系数(CV)。理想样品、未扩增基因组DNA、纳升单细胞MDA反应、组合的纳升/微升单细胞MDA反应和微升单细胞MDA反应的CV值分别为25％、36％、45％、57％和90％，再次说明纳升MDA反应具有三种单细胞反应的最低代表性偏差。
经证实的使用每反应的纳升试剂以高通量进行具有迄今最低报道代表性偏差的单细胞WGA的能力对未来单细胞基因组研究具有重大意义。除了WGA试剂成本的显著降低之外，降低的代表性偏差允许具有减少的测序工作量的基因组覆盖度，从而还降低测序成本。因此，该能力具有实现目前棘手的大量单细胞的基因组研究的潜力。
1.9.7环境基因组学
基于PCR的WGA化学应用于环境样品中微生物的WGA和测序，以探索天然微生物群体内的基因组关系。样品选自代表不同水平的结构复杂度的三种环境。环境1(ENV1)为来自选择为代表低复杂度环境的海水的细菌富集培养物。环境2(ENV2)为选择为代表高复杂度微环境的人类口腔生物膜。环境3(ENV3)为来自与甲烷渗流有关的深海沉积物的3至8μm的部分。基于每一环境的复杂度和聚集状态，使用交替的芯片上分选策略。单细胞从ENV1中分离，单个延长的纤维状聚集体从ENV2中分离，且单个球形聚集体从ENV3中分离。进行总计203个使用前述基于PCR的方案的芯片上WGA反应(ENV1中50个、ENV2中60个，ENV3中93个)，包括5个由等体积的不含可见细胞的细胞悬浮流体构成的无细胞对照。
随机选择总计74个代表每一环境的样品，用于下一轮在微升体积中的芯片外扩增和测序库构建，得到72个成功的库：24个来自ENV1的单细胞，22个来自ENV2的纤维状聚集体，23个来自ENV3的球形聚集体，和3个无细胞对照样品。由于在库筹备期间的疑似污染或误标记排出两个其余样品。在Illumina Genome Analyzer II的单行道上对样品编索引，使其合并，并对其测序，产生六千四百万个读数中的总计四十八亿个碱基。对每一样品进行组装，且长度大于200bp的重叠群用于进一步的分析。每一样品的重叠群的数量在环境之间改变，其中，ENV1组装体产生最高的每样品平均数量(1998个覆盖70％读数的重叠群的平均值)，然后是ENV2(659个覆盖76％读数的平均值)和ENV3(431个覆盖70％读数的重叠群的平均值)。这与样品之间的重叠群长度差有关，其中对于ENV1、ENV2和ENV3，平均重叠群长度分别为471bp、424bp和324bp。单个组装体受测序深度限制，且ENV1中较高数量的重叠群可能是归因于降低的样品复杂度。无细胞对照产生每样品7至20个重叠群，其覆盖小于30％的读数。
经编索引的样品的基因组复杂度首先通过对GC组合物的核密度函数作图来分析。所有ENV1样品表现出单个特征峰，与非常相关的供体基因型的靶向扩增一致(41A)。通过比较，由ENV2样品表现出的GC成分为单峰和多峰曲线的混合物，与单细胞基因组和附着细胞混合物两者的靶向扩增一致(图41A)。最后，ENV3样品也表现多峰曲线和单扩展峰，与多细胞聚集体的扩增一致(图41A)。然后，每一样品的分类学结构使用三等级分装法(tripartite binning approach)来确定。最初，基于使用MLTreeMap映射到进化树上的40个保守种系基因组学标记物，采纳严格的分装标准。然而，由于低测序深度，仅识别了少量的这些标记物。为了增加分类学分辨率，使用对来自每一经编索引的样品的重叠群预测的开放阅读框架(ORF)来查询eggNOG和NCBIref_seq数据库。然后，来自ref_seq检索的结果使用MetagenomeAnalyzer(MEGAN)映射到NCBI分类学等级上以对每一查询序列限定最可能的祖先。由MEGAN分配到分类学节点的开放阅读框架通过每一样品内的部分来标准化，并按等级聚群，对于ENV1、ENV2和ENV3样品得到三种不同的聚簇。三种聚簇的每一种内的分支长度与基因组复杂度的增加水平一致，其中ENV1样品表现出最小复杂度，接着是ENV3和ENV2(图41B)。
在ENV1样品中预测的ORF的分类学起源主要隶属于γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)内的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)属。基于等级聚群结果，解析出两种基因型变异，与富集培养物内存在非常相关的亚群一致。来自ENV2样品的ORF由已知的人类口腔微生物组学成分主导，包括拟杆菌门(Bacteroidetes)内的二氧化碳噬纤维菌属(Capnocytophaga)和黄杆菌属(Flavobacterium)，放线菌门(Actinobacteria)内的棒状杆菌属(Corynebacterium)、罗思氏菌属(Rothia)、考克氏菌属(Kocuria)和放线菌属(Actinomyces)，梭杆菌门(Fusobacteria)内的梭杆菌属(Fusobacterium)，以及硬壁菌门(Firmicutes)内的梭菌属(Clostridium)和链球菌属(Streptococcus)(图41C)。还观察到候选分区TM7的低水平表现。不同的样品包含重叠但不相同的这些分类组的子集，其中链球菌属、棒状杆菌属和二氧化碳噬纤维菌属为最常见的重叠分类。在ENV2样品中观察到的分类构型中的许多之前已在口腔内的共聚集和生物膜形成的上下文中进行描述(135-138)，并且一些已经直接使用组合的标记和光谱成像技术显现(139)。来自ENV3样品的ORF由硫酸盐还原菌(SRB)主导，其隶属于δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)内的Desulfatibacillum、脱硫杆菌属(Desulfobacterium)和脱硫球菌属(Desulfococcus)。对于除产甲烷古生菌之外的非隶属γ-变形菌和β-变形菌观察到中等水平的表现。在特定ENV3样品中观察到其它分类组的低水平表现，包括隶属于α-变形菌纲、拟杆菌门、硬壁菌门、绿弯菌门(Chloroflexi)和梭菌属的ORF。
此处，已经证实基于表型的分选和基于液滴的WGA以及之后进行测序如何可以用于坚定具有特殊形态学的单个微生物和微生物聚集体的成员。在后一种情况中，这理想地允许检查聚集体内构成成员的整个基因组，仅超过少量基因的共定位(5,16)，并实现对可以更精确地表征物理聚集体内潜在的共生关系的代谢路径分析。
i)基于PCR的单个人类肿瘤细胞核的基因分型
细胞异质性越来越多地被显示为涉及诊断和治疗两者的人类疾病特征。例如，在癌症中，个体肿瘤内不同空间区域的遗传分析已经揭示肿瘤“进化”的分支模式，得到可以基于基因畸变如基因组位点拷贝数变异、等位基因失衡和作为推定的疾病“驱动器”的突变来分组的不同亚种群。这意味着从单个活检中获得的试样仅可以揭示整个肿瘤的畸变的子集，并不可以识别普遍存在并由此为治疗的重要靶标的那些。还已经显示，遗传克隆多样性可以预测从癌变前病况到癌症的发展，表明增加的多样性提供更广的基础，在所述基础上自然选择作用为产生肿瘤。
为了以更高的空间分辨率研究癌症发展，可以在单细胞水平分析克隆性。荧光原位杂交(FISH)已经用于计数个体细胞中8个遗传位点的拷贝数变异，使得能够基于这些变异的频率推断进化树。FACS分选的单细胞肿瘤核的基于PCR的WGA和测序已经用于分析来源于两种不同肿瘤的200个细胞中整个基因组上的位点拷贝数变异，以确定肿瘤在“间断的”克隆扩充中发展，所述克隆扩充产生不同的肿瘤亚种群，每一种都远离其根源(root)。相似地，来自通过手动微操作而分离的单肿瘤的25个单细胞的基于MDA的WGA和测序表明肿瘤可能不由该癌症典型的突变产生，并且与以上研究相反，没有不同的克隆亚种群。
已经通过对来自来源于肿瘤的主体DNA的PCR扩增子进行测序来估计乳癌中体细胞突变的克隆频率。然而，为了更准确地确定肿瘤内突变的分布，目标位点必须在单肿瘤细胞内扩增并进行测序。这可以通过如本文对单细菌所证实的基于单细胞PCR的基因分型而在本微流体装置中完成。
因为难以从实体肿瘤组织中得到单细胞悬浮，所以可以从肿瘤样品中提取出细胞核。然而，得到的核样品在形态方面是高度异质性的，这是因为核自身可以改变尺寸，且提取过程在样品中留下多种细胞残渣(图42)。使用本装置对核进行基于形态的分选的能力由此有显著的优势。
作为原发乳癌胸腔积液细胞核的基因组PCR的第一严格测试，对单核(N＝80)、纯化人类gDNA的约50个单倍体基因组拷贝(N＝5)和如通过基于显微镜的分选而确定的不包含核的悬浮流体(N＝5)进行芯片上qPCR，所述芯片上qPCR靶向以一个拷贝/单倍体基因组(每细胞2个)存在的核糖核酸酶P基因。细胞分选模块和储存液滴中的细胞核的显微图分别示于图43A和图43B中。95C的3分钟PCR热起动用于溶解核。qPCR曲线表明靶标序列在80个单核中的78个(98％)、所有5个gDNA反应和5个无核对照反应中的2个中成功地扩增(图44A)。后者的结果最可能是由于来自悬浮液流体中核样品的游离gDNA。发现包含单核(包含2基因拷贝)和50个单倍体基因组拷贝的反应之间的平均CT的差(图44B)为4.59个循环，表明101.6％的分析效率。这种近乎理想的分析效率表明，通过所使用的方案使核内的gDNA可到达PCR试剂，并且如在单细菌的PCR实验中，显示利用优化的分析和有效率的溶解，可以从单个人类细胞核中获得稳定的PCR扩增。
已经确定，对于芯片上PCR，细胞核的gDNA可以被访问，然后在单核(N＝3)和无核对照(N＝10)的多重qPCR反应中测试靶向6个基因组位点的引物对，所述多重qPCR反应包括嵌入染料以用于实时的反应监控。6个位点中的5个包含目标体细胞突变：FGA、GOLGA4、KIAA1468、KIF1C和MORC1，并且第6个位点为多拷贝种系对照NOTCH2NL。所有反应的qPCR曲线示于图45中。尽管这些qPCR曲线提供扩增的一些指示，但是应注意，它们在指示反应进展方面不如单重PCR反应中的qPCR曲线，这是由于不同分析的引物对之间的相互作用。观察到CT值对于所有单核反应都相当晚。然而，这些值用作对选择单核反应的子集以用于进一步分析的指导。在芯片上6重PCR之后，洗脱反应产物，并对具有最低芯片上qPCR CT值的7个芯片上单核反应以及2个无核对照反应的产物进行5个体细胞突变位点中每一个的芯片外单重PCR。然后，通过毛细管电泳可视化这些单重PCR反应的每一扩增子。单核反应中的4个和两个无核对照反应的图示于图46中。总而言之，来自所分析的7个单核反应的35个可能的扩增子中的33个(94％)成功地扩增，如通过具有预期尺寸的带的存在所确定的。还看到无核对照中3个扩增子的带。
所有45个单重PCR扩增子(7个单核和2个无核对照，各具有5个位点)通过在Ion Torrent PGM仪器上测序来进一步分析。将来自每一核的扩增子和来自两个无核对照的所有扩增子合并，且编上条形码用于测序。为了比较，20ng从数百万细胞中提取的主体gDNA也进行多重PCR且然后是单重PCR的相同方案，但是在常规微升体积中以大约10倍于芯片上单核反应的模板浓度的模板浓度下进行。通过来自代表性的单核和主体gDNA的染色体覆盖度分装的扩增子测序数据表明芯片上多重PCR以与对主体gDNA进行的微升规模的反应相似的代表性偏差扩增靶标位点。染色体3的较高覆盖度是由于位点中的两个位于该染色体上。从每一扩增子获得的读数的数量、读数匹配文献中报道的突变的分数、所有单核的这些统计的平均值和差异系数以及从主体DNA的分析获得的突变频率未示出。
在单核中观察到的突变频率对于所有位点都相当多变，除了MORC1之外差异系数都在0.4以上，表明异质性群体。对于大部分，频率接近于0、0.5和1的预期理论比，分别对应于对未突变变异体为纯合的核，对突变为杂合的核和对突变为纯合的核。这些比的偏移可能通过导致多于2个等位基因的位点拷贝数变异来解释。
本申请说明之前对微生物证实的单细胞基因组分析如何同样地适用于真核细胞。该工作会允许准确地测定空前数量的单癌症细胞中突变的克隆频率，这最终会实现以不平行的分辨率和尺寸检查克隆进化。
ii)单细胞全转录组扩增
尽管疾病如癌症的典型的遗传畸变是细胞异质性的来源，但是即使基本上共享相同的基因组的健康生物体的细胞也清楚地表现出允许过多生理功能的表型多样性。这些差异是由于转录组中细胞与细胞的差异，所述转录组为包括基因组的功能输出的全部RNA分子的集合。通常认为在基因相同的细胞中持续的变异是由基因表达的随机性质造成的，这是由于基因的小拷贝数以及存在多个亚稳转录状态。为了完全理解作为该细胞与细胞的异质性的原因的转录机制(对于确定细胞命运或对于基于转录状态鉴定少数细胞群体是重要的)，必须分析单细胞的转录组。新的用于扩增单细胞中存在的RNA量的方法与现代测序仪器的高通量的组合现提供了对许多单细胞的完整转录组(RNA-seq)测序的可能性。重要地，转录组的测序允许鉴定和发现RNA分子的转录后修饰，所述RNA分子的转录后修饰可以改变由基因组编码的蛋白，这可以在疾病中发挥作用。
如在全基因组扩增中一样，代表性偏差的最小化在RNA-seq顺序的全转录组扩增(WTA)中是重要的，以既使测序工作量最小化，又允许精确测量RNA分子的相对丰度。除了降低的试剂成本的明显优点之外，纳升体积中的单细胞WTA可以受益于相对于微升体积的降低的代表性偏差，如本文之前对单细胞多重置换扩增所示的。
作为RNA定量的第一测试，对来自人类k562细胞系的纯化RNA进行靶向GAPDH mRNA的定量逆转录PCR(qRT-PCR)。qRT-PCR反应在包含0.2pg(N＝32)、2pg(N＝15)、20pg(N＝9)、200pg(N＝9)和0pg(N＝4)的纯化RNA以及含有引物和用于检测GAPDH基因的水解探针的RT-PCR主混合物的储存液滴中组装。单哺乳动物细胞中存在的RNA总量为约20pg。在反应组装之后，如之前描述的那样进行芯片上qRT-PCR，进行50次循环，在每一循环获取液滴阵列的荧光图像。荧光图像使用定制软件进行分析以产生每一储存液滴的qPCR曲线(图47A)，从这些曲线中提取出CT值(图47B)。根据通过CT相对于log10(模板量)的数据点的拟合线的斜率测定的PCR效率为98.6％，表明在该装置中可以进行RNA丰度的定量测量。
接着，对纯化RNA测试可商购的WTA方案(Omniplex,Sigma)。多步方案由以下组成：通过由随机六聚体和通用序列构成的引物引发所有RNA，然后逆转录，其产生位于通用序列侧面的cDNA片段的库，并且使用通用引物对片段库进行PCR扩增。对0.2pg(N＝10)、2pg(N＝10)、20pg(N＝10)、200pg(N＝10)和0pg(N＝5)的来源于k562细胞的纯化RNA测试该方案，以度量在单个哺乳动物细胞中预期的RNA量的范围。在芯片上WTA之后，来自所有液滴的反应产物都被洗脱，且cDNA丰度通过qPCR来分析。
GAPDH cDNA，一种常见的参照基因，通过WTA产物中的常规微升体积qPCR来定量。来自每一起始RNA量的WTA产物的qPCR曲线示于图48A中。2pg、20pg和200pg的WTA反应产物的qPCR曲线紧紧地聚群，而0.2pg的WTA反应产物的qPCR曲线具有大的展开，并具有可以与NTC WTA反应的CT值相比的CT值。0.2pg RNA的WTA由此被认为是不可靠的。在图48B中对2pg、20pg和200pg的WTA反应产物的平均CT值和标准差作图。对于所有起始RNA量都异常低的标准差使芯片上WTA反应和洗脱过程两者的高重现性得到突出。根据通过CT相对于log2(模板量)的数据点的拟合线的斜率测定的扩增效率为97.6％，表明RNA量的高度定量的芯片上WTA在单个哺乳动物细胞中预期的量之上和之下跨过一个数量级。
为了进一步评估WTA性能，将靶向内源性对照基因的48个qPCR分析的板使用商购的微流体qPCR装置(48.48Dynamic Array,Fluidigm)应用于来自每一芯片上反应的WTA产物，所述装置允许在纳升体积反应中针对48个样品应用最多48个分析。描绘所有反应的CT值的热图示于图50中。对于每一基因，CT值相对于log2(模板量)作图，并计算PCR效率。对于表现出85％至115％的PCR效率的基因，这些图示于图51中。基于这些结果，可以得出结论，芯片上WTA至少对于图51中所示的基因是定量的。为了比较微流动形式和常规形式中的WTA性能，还以微升体积反应对100ng纯化RNA进行WTA，并且产物再次通过在动态阵列装置中的qPCR进行定量。以上10个基因相对于发现具有所有定量基因中最低CT的18S rRNA基因的丰度通过比较对于所有起始RNA量的平均CT值来测定，并在芯片上和常规WTA反应产物两种中都以2ΔCT计算(图52)。微流体形式和常规形式中基因丰度的相似性进一步证明芯片上WTA方案是定量的。
可以利用可编程的基于液滴的反应组装的灵活性来测试其它可商购的WTA方案，所述WTA方案使用模板切换化学以扩增全长度RNA分子，并使用基于MDA的cDNA扩增。在已经进行所有上述反应以实现并验证具有低代表性偏差的微流体WTA方案后，其会应用于单细胞。该工具可以用于目标生物体系中数百个细胞的转录分析(其为在常规形式中目前棘手的问题)，以用于诸如阐明转录机制的应用，所述转录机制是干细胞分化和更新或发现在人类疾病中发挥作用的转录后修饰的原因。
操作
尽管已经描述和举例说明了本发明的具体实施方案，但是这类实施方案应被认为仅是说明本发明，而非限定如根据所附权利要求而解释的本发明。
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Claims (25)

1.测定分散相液滴润湿具有均匀润湿性的通道的表面所处的第一位置的方法，所述方法包括：
(a)使所述分散相液滴浸入连续相流体中，其中所述连续相流体与所述分散相液滴不混溶；
(b)使连续相中的所述分散相液滴以分散相液滴速度流过所述通道，其中所述分散相液滴通过具有膜厚度的所述连续相流体的膜与所述表面分开；以及
(c)使所述第一位置处的膜破裂，其中所述液滴润湿所述第一位置处的所述表面。
2.测定分散相液滴润湿通道表面所处的第一位置的方法，所述方法包括：
(a)使所述分散相液滴浸入连续相流体中，其中所述连续相流体与所述分散相液滴不混溶；
(b)使连续相中的分散相以分散相液滴速度流过所述通道，其中所述分散相液滴通过具有膜厚度的所述连续相流体的膜与所述表面分开；以及
(c)减小所述膜厚度以使所述第一位置处的膜破裂，其中所述液滴润湿所述第一位置处的所述表面。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中使所述膜破裂包括降低所述分散相液滴速度以减小所述膜厚度。
4.如权利要求2或3所述的方法，其中减小所述膜厚度还包括在所述分散相液滴接近所述第一位置时从所述通道移除所述连续相流体的一部分。
5.合并多个分散相液滴的方法，所述方法包括：
a.维持第一分散相液滴润湿到第一位置处的通道表面，
b.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，使第二分散相液滴润湿所述第一位置处的所述通道表面，以及
c.使所述第一分散相液滴与所述第二分散相液滴接触足以使所述第一分散相液滴和所述第二分散相液滴合并的时间。
6.从分散相保存室中移除浸入连续相流体中的分散相的第一部分的方法，其中所述连续相流体与所述分散相不混溶，所述分散相保存室在所述第一部分的体积小于所述室的体积的前提下可操作地配置为保存所述部分，所述方法包括：
a.将一个或多个分散相液滴浸入到所述连续相流体中，以形成所述分散相的第二部分；
b.使所述分散相的第二部分流入到所述分散相保存室中，其中分散相部分的总体积超过所述分散相保存室的体积，
c.使所述第一分散相部分与所述第二分散相部分接触足以使所述第一分散部分和第二分散相部分合并以形成包封在所述连续相流体中的洗脱流的时间，以及
d.使所述洗脱流流过分散相保存室出口。
7.用于减小包封分散相液滴的连续相流体的膜的厚度的微流体装置，其中所述分散相液滴在所述连续相流体中不混溶，所述装置包括：
(a)用于使所述分散相液滴流动的通道；以及
(b)可操作地配置为从所述通道中转移出所述连续相流体的一部分以减小所述膜的厚度的筛元件系列，其中每一筛元件的直径小于所述分散相液滴的直径。
8.用于降低包封在连续相流体中的分散相液滴的速度的微流体装置，其中所述分散相液滴与所述连续相流体不混溶，所述装置包括：
(a)用于使所述分散相液滴流动的通道；以及
(b)可操作地配置为从所述通道中永久转移出所述连续相流体的一部分以降低所述分散相液滴的速度的筛元件系列，其中每一筛元件的直径小于所述分散相液滴的直径。
9.如权利要求7或8所述的微流体装置，其中所述筛元件大致垂直于所述通道。
10.如权利要求7至9中任一项所述的微流体装置，其还包括与所述通道流体连通以用于接收所述分散相液滴的分散相保存室。
11.如权利要求10所述的微流体装置，其中所述筛元件可操作地配置为在到达所述分散相保存室之前从所述通道中转移出所述连续相流体的所述部分。
12.如权利要求10或11所述的微流体装置，其中所述微流体装置还包括与所述筛元件系列流体连通的旁路通道，其中所述旁路通道可操作地配置为接收所述部分并维持所述部分在储存室外部。
13.处理微流体装置中的分散相液滴的方法，所述方法包括：
(a)使第一分散相液滴浸入连续相流体中以形成分散相的第一部分，其中所述连续相流体与所述第一分散相液滴不混溶；
(b)使所述第一分散相液滴以第一分散相液滴速度流入到所述装置的储存元件中，其中所述储存元件包括
主通道和用于接收来自所述主通道的分散相液滴的分散相保存室，其中所述主通道可操作地配置为在所述分散相液滴接近所述保存室时降低分散相液滴速度，且其中所述保存室在所述保存室内的所述分散相的总体积小于所述保存室的体积的前提下可操作地配置为保存所述储存元件内的所述分散相液滴，
其中所述第一分散相液滴通过具有第一膜厚度的所述连续相流体的第一膜与所述储存元件的表面分开；以及
(c)使所述储存元件内第一位置处的所述第一膜破裂，其中所述第一分散相液滴润湿所述第一位置处的所述表面。
14.如权利要求13所述的方法，其中使所述第一位置处的所述第一膜破裂包括减小所述第一膜厚度以使所述第一位置处的所述第一膜破裂。
15.如权利要求14所述的方法，其中减小所述第一膜厚度包括降低所述第一分散相液滴速度。
16.如权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述表面具有均匀的润湿性。
17.如权利要求13至16中任一项所述的方法，其还包括：
(a)使第二分散相液滴浸入所述连续相流体中以形成所述分散相的第二部分，其中所述连续相流体与所述第二分散相液滴不混溶；
(b)使所述第二分散相液滴以第二分散相液滴速度流入到所述储存元件中，其中所述第二分散相液滴通过具有第二膜厚度的所述连续相流体的第二膜与所述储存元件的表面分开；以及
(c)使所述储存元件内第二位置处的所述第二膜破裂，其中所述第二液滴润湿所述第二位置处的所述表面。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述第一位置与所述第二位置基本相同，且其中所述方法还包括使所述第一分散相液滴与所述第二分散相液滴接触足以使所述第一分散相液滴和所述第二分散相液滴合并的时间。
19.如权利要求17所述的方法，其还包括：
(a)使第三分散相液滴浸入所述连续相流体中以形成所述分散相的第三部分，其中所述连续相流体与所述第三分散相液滴不混溶；
(b)使所述第三分散相液滴以第三分散相液滴速度流入到所述储存元件中，其中所述第三分散相液滴通过具有第三膜厚度的所述连续相流体的第三膜与所述储存元件的表面分开；以及
(c)使所述储存元件内第三位置处的所述第三膜破裂，其中第三液滴润湿所述第三位置处的所述表面。
20.如权利要求19所述的方法，其中：
(a)所述第三位置与所述第一位置基本相同，且其中所述方法还包括使所述第三分散相液滴与所述第一分散相液滴接触足以使所述第一分散相液滴和所述第三分散相液滴合并的时间；或
(b)所述第三位置与所述第二位置基本相同，且其中所述方法还包括使所述第三分散相液滴与所述第二分散相液滴接触足以使所述第二分散相液滴和所述第三分散相液滴合并的时间。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述第三位置位于所述第一位置和所述第二位置之间。
22.如权利要求19所述的方法，其中所述第三位置充分接近所述第一位置和所述第二位置，且其中所述方法还包括使所述第三分散相液滴与所述第一分散相液滴和所述第二分散相液滴两者接触足以使所述第三分散相液滴与所述第一分散相液滴和所述第二分散相液滴合并的时间。
23.如权利要求13至22中任一项所述的方法，其还包括：
(a)使第四分散相液滴浸入所述连续相流体中以形成所述分散相的第四部分，其中所述连续相流体与所述第四分散相液滴不混溶；
(b)使所述第四分散相液滴流入到所述分散相保存室中，其中所述储存元件内的分散相的总体积超过所述分散相保存室的体积；
(c)使所述储存元件内的所述分散相液滴与所述第四分散相液滴接触足以使所述第四分散相液滴和所述分散相液滴合并以形成包封在载流体中的洗脱流的时间；以及
(d)使所述洗脱流流过分散相保存室出口。
24.用于储存和处理分散相液滴的微流体系统，所述系统包括：
(a)至少两个平行的可独立访问的储存元件的阵列，其中每个储存元件包括：
主通道和用于接收来自所述主通道的至少一个分散相液滴的分散相保存室，其中所述至少一个分散相液滴形成所述储存元件内分散相的一部分，且其中所述主通道可操作地配置为在所述至少一个分散相液滴接近所述分散相保存室时降低所述至少一个分散相液滴的速度，且其中所述分散相保存室在所述分散相保存室内的所述分散相的总体积小于所述保存室的体积的前提下可操作地配置为保存所述储存元件内的所述至少一个分散相液滴；
(b)由所述至少两个储存元件共享的用于使所述至少一个分散相液滴流动到选定的储存元件的入口通道；以及
(c)由所述至少两个储存元件共享的用于使所述分散相从所述选定的储存元件流出的洗脱通道。
25.测定分散相液滴润湿微流体装置的分散相润湿表面所处的第一位置的方法，所述润湿表面具有均匀的润湿性，所述方法包括：
(a)使所述分散相液滴浸入连续相流体中，其中所述连续相流体与所述分散相液滴不混溶；
(b)使浸入的所述分散相液滴以分散相液滴速度流过所述微流体装置，其中所述分散相液滴通过具有膜厚度的载液的膜与管道的表面分开；和
(c)减小膜厚度以使在所述第一位置处的膜破裂。
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