CN112080806A - 一种毛细管96孔板的血浆游离dna建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种毛细管96孔板的血浆游离DNA建库方法，包括以下步骤：将反应物加入样品池内，将盖板盖于孔板上，使电极置于反应池内，对反应池上的电极依次通电，利用毛细管电泳原理使样品依次通过样品池、末端修复与加A反应池、接头连接反应池、恒温扩增反应池、扩增产物回收池，从而获得cfDNA文库。本发明还提供了一种用于血浆游离DNA建库的毛细管96孔板。本发明血浆游离DNA建库方法利用毛细管96孔板，设备简单，仅需毛细管96孔板以及每行或者每列能够单独温控的PCR仪或者金属浴即可满足实验需求；本发明方法实验通量高，单次能够完成8或者12个样品的cfDNA建库过程。
Description
技术领域
本发明涉及基因高通量测序技术领域，具体地，涉及一种毛细管96孔板的血浆游离 DNA建库方法。
背景技术
测序法已经成为一种常规的实验技术，不过最近新一代测序技术的显著优势，比如大规模平行信号(MPSS，Brenner et al.2000)和焦磷酸测序法(也称454测序，Margulieset al.2005，Langaee and ronaghi2005)已经使测序技术发生了彻底的变革，它们可以同时对数百万个短序列读长进行测序。尽管面临着来自生物信息学方面的挑战，但是这些技术为探索更多生态学与进化问题提供了更多的机会，其中包括对生物多样性的分析(Venter etal.2004)。此外，二代测序技术是最不可能由于操作不当、缺失、稀有转录及克隆细菌不稳定的原因而产生错误的。技术进步使得这一方法变得不断可靠 (Hamady etal.2008)，绝大多数的转录表达(包括那些表达量极少的转录本)都能够被精准地定量(StoloⅦitzky etal.2005)。随着序列读长的增加，454焦磷酸测序法的使用频率将大增，能进一步增加在非模式物种中鉴定基因的概率(Hudson2008)。由于测序的读长较短，这项技术最初只能用于已测序的模式物种。
根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，测序方法主要有以下几种：大规模平行签名测序(Massively Parallel Signature Sequencing，MPSS)、聚合酶克隆(Polony Sequencing)、454焦磷酸测序(454pyrosequencing)、Illumina(Solexa)sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序(Ion semiconductor sequencing)、DNA纳米球测序(DNA nanoball sequencing)等。
高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generationsequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。
高通量测序技术的诞生可以说是基因组学研究领域一个具有里程碑意义的事件。该技术使得核酸测序的单碱基成本与第一代测序技术相比急剧下降，以人类基因组测序为例，上世纪末进行的人类基因组计划花费30亿美元解码了人类生命密码，而第二代测序使得人类基因组测序已进入万(美)元基因组时代。如此低廉的单碱基测序成本使得我们可以实施更多物种的基因组计划从而解密更多生物物种的基因组遗传密码。同时在已完成基因组序列测定的物种中，对该物种的其他品种进行大规模地全基因组重测序也成为了可能。
在测序自动化多年后的今天，测序之前的样品制备的核心环节——自动化文库制备平台应运而生。例如，Hamilton公司生物样品自动处理工作站、TECAN帝肯全自动化液体处理工作站、华大肿瘤自动化建库系统MGISP-100等。虽然市场上各大高通量建库设备缤纷呈现，但是，基本上都是基于移液器的移液工作站，必然不可避免移液过程中产生的气溶胶，导致批量建库过程中的交叉污染，并且，上述各种工作站体积及其庞大，笨重、使用不方便。虽然国产化独立化建库平台也有出现，例如杰毅公司的建库平台，但是其通量太低。
随着高通量测序技术的成熟发展，对文库构建技术提出更加苛刻的要求：通量更高、质量更好。
毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)又称高效毛细管电泳(highperformance capillary electrophoresis，HPCE)，是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，它使分析化学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。长期困扰我们的生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机。毛细管电泳技术，目前在核酸检测方面，有Agilent公司的2100、4200等系列，中国台湾生产的Qseq1、100等系列，这两个公司的毛细管电泳设备，均应用在核酸片段大小质控方面；另一方面的应用，毛细管电泳在核酸片段分选方面，例如Sage公司的bluepippin 系列；最后一个方面的应用，毛细管电泳在Sanger测序中应用，ABI公司的3700系列等。但是，毛细管电泳技术在高通量建库方面的应用，尤其是在cfDNA的小型化、便捷的建库方法，尚未报到。
血中cfDNA简称循环核酸(circulating free DNA)，是指循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA。在这里，循环核酸不可顾名思义为循环血中的核酸类物质，所有细胞内的核酸，血中游离的内源性脱氧核糖核酸和外源性DNA与RNA，如真菌血症、细菌血症和病毒血症等病理情形下的血中外源核酸。cfDNA有两个明显的特征：首先，浓度极低，通常1ml血浆中只能提取出1-100ng cfDNA；其次，血浆或血清中的循环DNA大多以短片段存在，在180bp左右。无须有创肿瘤活检，而是从常规抽血中分析来自肿瘤的DNA，这一能力代表了潜在转化性临床应用的一个关键进展。特别是 cfDNA分析属于微创，为活检困难或不安全的肿瘤提供了一种分子谱分析方法，并提供了一种能够随时间推移连续监测肿瘤DNA的实用方法，而没有标准肿瘤活检的风险和潜在并发症。此外，与单个肿瘤病变的针吸活检相比，cfDNA分析可以更好地检测患者肿瘤中多个不同克隆群所具有的分子异质性。最后，cfDNA分析为无临床明显疾病的患者提供了肿瘤检测或监测的可能性。
NGS建库可以按照接头加入目的片段的不同分为5种，其中TA克隆连接接头建库法应用最广泛，适用于绝大多数样本建库，是目前商业化建库方式的主流；Swift法与TA 克隆连接接头法类似，操作上相对繁琐，P5接头和P7接头是分两步连接上的；转座酶法只需1h40min即可完成文库构建，可以节省大量的人力，但是在应用上只适用于cDNA 和全基因组等文库的构建，且转座酶本身具有偏好性，对后续的测序质量会有一定的影响；PCR扩增子建库是捕获建库的一种，适用于临床背景下靶向基因的研究，平末端连接接头建库适用于Ion Torrent平台，Ion Torrent市场占有率相对较低，所以此建库方法应用范围相对较少。
如上所述，cfDNA建库，其流程众多，但也复杂，包含数个操作步骤，当然必不可少一个cfDNA提取纯化过程。
发明内容
技术问题：为了解决现有技术的缺陷，本发明提供了一种毛细管96孔板的血浆游离 DNA建库方法，该建库方法结合96孔板的毛细管电泳设施，从血浆/血清中直接对cfDNA进行分离、建库，方便、快捷、高通量地获得高质量文库。
技术方案：本发明提供一种毛细管96孔板的血浆游离DNA建库方法，包括以下步骤：
96孔板以横向十二孔为工作流形成八条工作流，或以纵向八孔为工作流形成十二条工作流；每工作流取前五孔作为反应池，反应池依次为样品池、末端修复与加A反应池、接头连接反应池、恒温扩增反应池、扩增产物回收池；
样品池的内含物为空，用于加样；
末端修复与加A反应池的内含物为完成文库构建过程中末端修复与加A反应的必要成分(buffer、酶mix、dNTP等)组成的反应混合物；
接头连接反应池的内含物为完成文库构建过程中连接接头反应的必要成分(buffer、酶mix、文库接头等)组成的反应混合物；
恒温扩增反应池的内含物为完成文库构建过程中文库扩增反应的必要成分(buffer、酶mix、index引物等)组成的反应混合物；
扩增产物回收池用于回收反应产物；
将反应物加入样品池内，将盖板盖于孔板上，使电极置于反应池内，对反应池上的电极依次通电，利用毛细管电泳原理使样品依次通过样品池、末端修复与加A反应池、接头连接反应池、恒温扩增反应池、扩增产物回收池，从而获得cfDNA文库。
作为改进，样品池的最大加样体积为200μL；加入的样品类型为血浆、血清、细胞积液、灌洗液。
作为另一种改进，所述扩增方式采用恒温PCR的方式进行文库扩增。
本发明还提供了一种用于血浆游离DNA建库的毛细管96孔板，包括孔板(1)、盖板(2)、注胶孔(3)、毛细管(4)、反应孔(5)、电极(6)；所述孔板(1)上间隔地设置有多组反应孔(5)；同一横排方向的反应孔(5)通过横向毛细管(4)连通，横向毛细管(4)通过竖向毛细管(8)连通；所述注胶孔(3)固定安装在竖向毛细管(8)的通路上；所述盖板(2)活动盖设在孔板(1)上表面，盖板(2)侧面固定安装有多组电极(6)，其中，当孔板(1)和盖板(2)相对时，盖板(2)上每组电极(6)放置于孔板(1)上反应孔(5)内；孔板(1)上还包括多组辅助电极孔(7)，每组单独地固定安装在孔板(1)的端部一侧，每一组均与竖向毛细管(8)相连通。
作为优选，所述孔板(1)上的反应孔(5)在排布结构上设置为96孔板结构，其中十二组横排，一排八组反应孔。
本发明还提供了一种用于血浆游离DNA建库的毛细管96孔板，所述96孔板以横向十二孔为工作流形成八条工作流，或以纵向八孔为工作流形成十二条工作流；每工作流取前五孔作为反应池，反应池依次为样品池、末端修复与加A反应池、接头连接反应池、恒温扩增反应池、扩增产物回收池；
样品池的内含物为空，用于加样；
末端修复与加A反应池的内含物为完成文库构建过程中末端修复与加A反应的必要成分(buffer、酶mix、dNTP等)组成的反应混合物；
接头连接反应池的内含物为完成文库构建过程中连接接头反应的必要成分(buffer、酶mix、文库接头等)组成的反应混合物；
恒温扩增反应池的内含物为完成文库构建过程中文库扩增反应的必要成分(buffer、酶mix、index引物等)组成的反应混合物；
扩增产物回收池用于回收反应产物。
有益效果：本发明提供的毛细管96孔板的血浆游离DNA建库方法，相对于现有技术，具有以下突出的优势：
1、本发明血浆游离DNA建库方法利用毛细管96孔板，设备简单，仅需毛细管96 孔板以及每行或者每列能够单独温控的PCR仪或者金属浴即可满足实验需求；
2、本发明方法实验通量高，单次能够完成8或者12个样品的cfDNA建库过程；
3、本发明方法试剂兼容性强，可根据实验需求自行调整每一个反应池的酶、buffer 等反应体系；
4、本发明方法自动化强，实现样品进、文库出的全流程；
5、本发明设备操作十分简单，可使得含有cfDNA的血浆、血清、脑脊液、灌洗液等样品直接进行检测，无须提取。
附图说明
图1为本发明毛细管96孔板的孔板的结构示意图。
图2为本发明毛细管96孔板的盖板的结构示意图。
图3为本发明毛细管96孔板的使用状态图。
图4为本发明对Test1、Test2、Test3三个样品建库结果2100毛细管电泳图。
图5为本发明对Test1、Test2、Test3三个样品常规建库结果Control1、Control2、Control3的2100毛细管电泳图。
图6为本发明对Test1、Test2、Test3三个样品的两种方法建库结果的合并展示图。
具体实施方式
下面对本发明作出进一步说明。
利用毛细管96孔板的血浆游离DNA建库方法：
采用血浆游离DNA建库的毛细管96孔板建库，所述96孔板以横向十二孔为工作流形成八条工作流，或以纵向八孔为工作流形成十二条工作流；每工作流取前五孔作为反应池，反应池依次为样品池、末端修复与加A反应池、接头连接反应池、恒温扩增反应池、扩增产物回收池；
样品池的内含物为空，用于加样；
末端修复与加A反应池的内含物为完成文库构建过程中末端修复与加A反应的buffer、酶mix、dNTP组成的反应混合物；
接头连接反应池的内含物为完成文库构建过程中连接接头反应的buffer、酶mix、文库接头组成的反应混合物；
恒温扩增反应池的内含物为完成文库构建过程中文库扩增反应的buffer、酶mix、index引物组成的反应混合物；
扩增产物回收池用于回收反应产物。
96孔板以横向十二孔为工作流形成八条工作流，或以纵向八孔为工作流形成十二条工作流；每工作流取前五孔作为反应池，反应池依次为样品池、末端修复与加A反应池、接头连接反应池、恒温扩增反应池、扩增产物回收池；
样品池的内含物为空，用于加样；样品池的最大加样体积为200μL；加入的样品类型为血浆、血清、细胞积液、灌洗液；
末端修复与加A反应池的内含物为完成文库构建过程中末端修复与加A反应的buffer、酶mix、dNTP等必要成分组成的反应混合物；
接头连接反应池的内含物为完成文库构建过程中连接接头反应的buffer、酶mix、文库接头等必要成分组成的反应混合物；
恒温扩增反应池的内含物为完成文库构建过程中文库扩增反应的buffer、酶mix、index引物等必要成分组成的反应混合物；所述扩增方式采用恒温PCR的方式进行文库扩增；
扩增产物回收池用于回收反应产物；
利用毛细管96孔板的血浆游离DNA建库方法，步骤如下：将反应物加入样品池内，将盖板盖于孔板上，使电极置于反应池内，对反应池上的电极依次通电，利用毛细管电泳原理使样品依次通过样品池、末端修复与加A反应池、接头连接反应池、恒温扩增反应池、扩增产物回收池，且，样品经过末端修复与加A反应池、接头连接反应池、恒温扩增反应池三个反应池时，分别提供适合的反应温度，即20℃维持15min、65℃维持 15min、30℃维持20min，从而获得cfDNA文库。
实施例1
选取临床名为Test1、Test2、Test3三个临床血浆样品，按照“毛细管96孔板的血浆游离DNA建库方法”进行cfDNA文库构建，步骤如下：将Test1、Test2、Test3三个临床血浆样品各200ul，分别加入样品池内，将盖板盖于孔板上，使电极置于反应池内，对反应池上的电极依次通电，利用毛细管电泳原理使样品依次通过样品池、末端修复与加A反应池、接头连接反应池、恒温扩增反应池、扩增产物回收池，且，样品经过末端修复与加A反应池、接头连接反应池、恒温扩增反应池三个反应池时，分别提供适合的反应温度，即20℃维持15min、65℃维持15min、30℃维持20min，从而获得cfDNA 文库，命名为Test1、Test2、Test3。
所得文库，经过Agilent 2100毛细管电泳设备的Agilent DNA 6000kit进行文库质控，获得图4结果。
实施例2
选取临床名为Test1、Test2、Test3三个临床血浆样品各200ul，按照现场常规方法进行cfDNA的提取及文库构建，具体步骤如下：
1、将Test1、Test2、Test3三个临床血浆样品分别命名为Control1、Control2、Control3，按照
Circulating Nucleic Acid kit说明进行cfDNA提取，获得样品全部用于文库构建；
2、将获得的cfDNA样品按照KAPA Hyper Prep Kits进行末端修复与加A反应、接头连接反应、接头连接产物磁珠纯化、纯化产物PCR扩增反应、PCR产物磁珠纯化，获得文库，命名为Control1、Control2、Control3。
所得文库，经过Agilent 2100毛细管电泳设备的Agilent DNA 6000kit进行文库质控，获得图5结果。
实施例3
实施例1和2所得文库，经过Agilent 2100毛细管电泳设备的Agilent DNA6000kit 进行文库质控，所得结果经过重叠分析，获得图6结果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (6)
1.一种毛细管96孔板的血浆游离DNA建库方法，其特征在于：包括以下步骤：
96孔板以横向十二孔为工作流形成八条工作流，或以纵向八孔为工作流形成十二条工作流；每工作流取前五孔作为反应池，反应池依次为样品池、末端修复与加A反应池、接头连接反应池、恒温扩增反应池、扩增产物回收池；
样品池的内含物为空，用于加样；
末端修复与加A反应池的内含物为完成文库构建过程中末端修复与加A反应的必要成分(buffer、酶mix、dNTP等)组成的反应混合物；
接头连接反应池的内含物为完成文库构建过程中连接接头反应的必要成分(buffer、酶mix、文库接头等)组成的反应混合物；
恒温扩增反应池的内含物为完成文库构建过程中文库扩增反应的必要成分(buffer、酶mix、index引物等)组成的反应混合物；
扩增产物回收池用于回收反应产物；
将反应物加入样品池内，将盖板盖于孔板上，使电极置于反应池内，对反应池上的电极依次通电，利用毛细管电泳原理使样品依次通过样品池、末端修复与加A反应池、接头连接反应池、恒温扩增反应池、扩增产物回收池，从而获得cfDNA文库。
2.根据权利要求1所述一种毛细管96孔板的血浆游离DNA建库方法，其特征在于：样品池的最大加样体积为200μL；加入的样品类型为血浆、血清、细胞积液、灌洗液。
3.根据权利要求1所述一种毛细管96孔板的血浆游离DNA建库方法，其特征在于：所述扩增方式采用恒温PCR的方式进行文库扩增。
4.一种用于血浆游离DNA建库的毛细管96孔板，其特征在于：包括孔板(1)、盖板(2)、注胶孔(3)、毛细管(4)、反应孔(5)、电极(6)；所述孔板(1)上间隔地设置有多组反应孔(5)；同一横排方向的反应孔(5)通过横向毛细管(4)连通，横向毛细管(4)通过竖向毛细管(8)连通；所述注胶孔(3)固定安装在竖向毛细管(8)的通路上；所述盖板(2)活动盖设在孔板(1)上表面，盖板(2)侧面固定安装有多组电极(6)，其中，当孔板(1)和盖板(2)相对时，盖板(2)上每组电极(6)放置于孔板(1)上反应孔(5)内；孔板(1)上还包括多组辅助电极孔(7)，每组单独地固定安装在孔板(1)的端部一侧，每一组均与竖向毛细管(8)相连通。
5.根据权利要求1所述孔板内毛细连续反应装置，其特征在于：所述孔板(1)上的反应孔(5)在排布结构上设置为96孔板结构，其中十二组横排，一排八组反应孔。
6.一种用于血浆游离DNA建库的毛细管96孔板，其特征在于：
96孔板以横向十二孔为工作流形成八条工作流，或以纵向八孔为工作流形成十二条工作流；每工作流取前五孔作为反应池，反应池依次为样品池、末端修复与加A反应池、接头连接反应池、恒温扩增反应池、扩增产物回收池；
样品池的内含物为空，用于加样；
末端修复与加A反应池的内含物为完成文库构建过程中末端修复与加A反应的必要成分(buffer、酶mix、dNTP等)组成的反应混合物；
接头连接反应池的内含物为完成文库构建过程中连接接头反应的必要成分(buffer、酶mix、文库接头等)组成的反应混合物；
恒温扩增反应池的内含物为完成文库构建过程中文库扩增反应的必要成分(buffer、酶mix、index引物等)组成的反应混合物；
扩增产物回收池用于回收反应产物。
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