CN103820559A - 21个短串联重复序列的复合扩增体系及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及“21个短串联重复序列的复合扩增体系及试剂盒”，用于检测人类基因组中具有多态性的遗传标记基因，属于生物技术领域。本发明涉及在一个PCR体系中同时扩增多个短串联重复序列，具体基因座为20个具有高度遗传多态性的短串联重复序列及1个性别决定位点，分别设计引物并标记荧光基团，该体系具有极高的个体识别率和非父排除率，本发明可用于法医个体识别、亲子鉴定以及群体遗传学分析，准确性更高，灵敏度好。

Description

21个短串联重复序列的复合扩增体系及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种荧光标记的复合PCR扩增体系，该体系同时扩增多个人类基因组DNA短串联重复序列（STR），可以快速准确地进行人类STR分型，进而对法医个体识别和亲子鉴定等提供判断依据。
背景技术
真核细胞基因组中充满了各种重复的DNA序列，广泛存在于染色体着丝粒周围。其中包含2～6个碱基重复单位的DNA区域称为简单序列重复或短串联重复序列（STR）。STR重复单位小，在整个基因组中分布广泛，平均每10000个碱基有一个，并且杂合子个体的两个等位基因在大小上相似，因而易于进行PCR扩增，两个等位基因之间没有差异扩增问题，所以成为广泛使用的DNA重复遗传标记。STR遗传标记的核心序列重复次数在个体间有很大的差异，所以使得STR可以有效地进行人类个体识别。许多学术和商业实验室对大量的STR遗传标记进行了分析，将其应用于疾病基因定位研究、法医个体识别及亲子鉴定等多个方面。
在法医DNA分型中，使用变异性较高的DNA遗传标记，或联合使用大量多态性较低的DNA遗传标记来获得足够的样本识别能力，都可以进行人类个体识别判断。但是小片段的STR等位基因（100-400bp）更适合于法医领域特殊检材的需求。所以基于生物学和技术方面的原因，STR在法医鉴定方面更有优势。
为了保证法医DNA分型标记在司法体系中具有有效性，从1996年开始由美国FBI实验室发起倡议，构建CODIS（Combined DNA Index System）,选出了13个核心STR基因座（CSF1PO、FGA、TH01、TPOX、vWA、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11）作为通用的标准遗传标记。在过去的十多年间，一些商业化的STR试剂盒相继面世，为法庭科学提供了可用的STR遗传标记检测方法，并且随着检测技术的飞速发展，检测STR等位基因的方法也更加灵敏、快速、准确。
发明内容
本发明提供一种21个短串联重复序列的复合扩增体系及试剂盒，具有4色荧光标记，灵敏度极高，低至0.1ng的DNA模板均可检测获得完整的基因分型图谱。本发明所采用的位点组合，均为CODIS基因座，具有极高的个体识别率和非父排除率，本发明可用于法医个体识别、亲子鉴定以及群体遗传学分析，准确性更高，灵敏性更好。
短串联重复序列的复合扩增体系，该复合扩增体系中包括20对引物，可同时扩增20个STR位点：D2S441、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、CSF1PO、FGA、Penta D、Penta E、TH01、TPOX和vWA，所述的20对引物分别为：
引物名称 引物序列
D19S433-f ATTCCCGAATAAAAATCTTCTC
D19S433-r GTGCGAATAAGATTCTGTTGA
D5S818-f ATTGGTGATTTTCCTCTTTGGTA
D5S818-r GTGCTTTTTAGCCAAGTGATT
D21S11-f ATATGTGAGTCAATTCCCCAAG
D21S11-r GTATTAGTCAATGTTCTCCAGA
D18S51-f TTCTTGAGCCCAGAAGGTTA
D18S51-r GTTTCTTACCAGCAACAACACAAATAAA
D6S1043-f ACTCCAGAGAGATAGAAGCAATA
D6S1043-r GTTTGTCTCTTTCTTCTGGAGCTG
D3S1358-f CAAATGATTCCCCCACTGCAGT
D3S1358-r ATGAAATCAACAGAGGCTTGC
D13S317-f ATTACAGAAGTCTGGGATGTG
D13S317-r GTTGGCAGCCCAAAAAGACAGA
D7S820-f ATGTTGGTCAGGCTGACTATG
D7S820-r GATTCCACATTTATCCTCATTG
D16S539-f TGGGGGTCTAAGAGCTTGTAAAAA
D16S539-r GTTTGTGTGTGCATCTGTAAGC
CSF1PO-f CGGAGGTAAAGGTGTCTTAAAG
CSF1PO-r ATTTCCTGTGTCAGACCCTGTT
Penta D-f TCGGTGAAGGTCGAAGCTGAAGTG
Penta D-r ATTAGAATTCTTTAATCTGGACAC
D2S441-f TGTGTGGCTCATCTATGAAAACTTC
D2S441-r GAAGTGGCTGTGGTGTTATGATA
vWA-f TGCCCTAGTGGATGATAAGAATAATC
VWA-r GGACAGATGATAAATACATAGGAT
D8S1179-f ATTGCAACTTATATGTATTTTTGTA
D8S1179-r ACCAAATTGTGTTCATGAGTATA
TPOX-f TTCCTCTGCTTCACTTTTCACC
TPOX-r GTAAGGTCTTACTCCTGTTCCCTTC
Penta E-f ATTGAGGCCGATGCAGGTGTATT
Penta E-r GGCGCATGGAAAGAATTCTCTTAT
TH01-f TGTGATTCCCATTGGCCTGTTC
TH01-r GGAATATTCTTCCGAGTGCAGGTCA
D12S391-f TAACAGGATCAATGGATGCAT
D12S391-r GGGACTGTCATGAGATTTTTCAGC
D2S1338-f TAAAGACTTCATGGTCCTGACTACAG
D2S1338-r GTTTCTTCCATGAGTTATTCAGTAAGTTA
FGA-f ACAAATGCCCCATAGGTTTTG
FGA-r GTTTCTTAATTCTATGACTTTGCGCTT
所述复合扩增体系中还包括1对能扩增性别识别位点Amelogenin的引物，所述引物为：
Amel-f TCCCTGGGCTCTGTAAAGAATA
Amel-r GATCAGAGCTTAAACTGGGAAG
所述扩增体系中的被扩增位点分别由四种颜色的荧光标记，相同荧光标记视为同一组，四组组合分别为：第一组D19S433、D5S818、D21S11、D18S51和D6S1043；第二组Amel、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO和Penta D；第三组D2S441、vWA、D8S1179、TPOX和Penta E；第四组TH01、D12S391、D2S1338和FGA。
四组荧光标记分别为FAM、HEX、TAMRA和ROX。
所述第一组的标记为FAM标记，第二组的标记为HEX标记，第三组的标记为TAMRA标记，第四组的标记为ROX标记。
所述扩增体系还包括PCR缓冲液、模板DNA和Taq DNA聚合酶。
所述PCR缓冲液成分包括：10mM的硫酸铵，10mM的氯化钾，50mM的pH8.3的Tris-HCl，2mM的镁离子和0.2mM的dNTP，所述Taq DNA聚合酶用量为2U。
所述扩增体系扩增时的反应条件为：
第1步：95℃变性11分钟，第2步：94℃变性30秒，第3步60℃退火1分钟，第4步：70℃延伸1分钟，重复2至4步30次，最后60℃延伸60分钟。
所述模板DNA来自于人类的骨骼、唾液、血液、毛发或精斑。
一种试剂盒，包括上述任一扩增体系。
上述扩增体系或试剂盒在个体识别、亲子鉴定中的应用。
本发明通过对STR基因座的遗传多样性研究，选择的21个位点包含13个CODIS位点（CSF1PO、FGA、TH01、TPOX、vWA、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11）的全部位点，另外7个（Penta D、Penta E、D2S441、D2S1338、D6S1043、D12S391、D19S433）属于CODIS及ESS要求的位点。这些位点相互之间独立性好，不存在连锁效应，能够达到更高的系统效能。
本发明采用四色荧光标记系统，将上述的21个基因座分组并进行荧光标记：FAM标记D19S433、D5S818、D21S11、D18S51、D6S1043；HEX标记Amelogenin、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D；TAMRA标记D2S441、vWA、D8S1179、TPOX、PentaE；ROX标记TH01、D12S391、D2S1338、FGA。在各基因座核心序列的上游和下游设计一对引物，将扩增产物按照分子量大小差异分开，两个基因座之间不能重叠。将所有引物混合进行复合扩增实验，确定无非特异扩增的现象。同时本发明的检测组分中标准物采用Orange标记，能够很明确的标记区分出检测样本各个基因座位点的大小。
本发明的PCR反应是在特定的缓冲液环境下进行的，缓冲液成分包括：10mM的硫酸铵，10mM的氯化钾，50mM的Tris-HCl(pH8.3,25℃)，2mM的镁离子和0.2mM的dNTP。
本发明每个反应需要2U的热启动Taq DNA聚合酶。
本发明的扩增产物需经过毛细管电泳，从而进行片段分析。
本发明的荧光标记复合扩增检测系统适用于：人类的骨骼、唾液、血液、毛发、精斑等检材所提取的DNA样本检测。
本发明选择满足CODIS和ESS所要求的位点，一次性扩增21个基因座，适用于所有涉及有人类细胞的物证案件中的法医DNA分析。
本发明的技术方案的设计思路：
1、基因座的选择
目前市场上最广泛使用的身份鉴定试剂盒一般包括15个STR基因座，如美国ABI公司的
Figure BDA0000472708530000041
PCR扩增试剂盒和美国Promega公司的
Figure BDA0000472708530000042
16试剂盒，国内的如公安部二所的DNATyper15。但是，近年来随着应用的越来越广，用户对试剂盒的基因座数量、信息含量和兼容性有了更高的要求。
在某些遗传鉴定中，需要更多的基因座提供更多的信息量。比如亲子鉴定、失踪人口比对，需要18个甚至更多个基因座联合使用。目前的做法通常是选择两个厂家的复合扩增试剂盒作为补充，联合使用以满足日常工作需求，提高了成本并降低了工作效率。因此迫切需要一个kit能够满足更多信息量。
在DNA数据库建设方面，对于试剂盒兼容性也提出了新的要求。我国近年来在DNA数据库建设方面进一步加速，数据库中的数据量激增。数据比对的作用越来越重要。数据比对是需要各个STR试剂盒在基因座位上具有兼容性。目前所用的试剂盒大多以美国的CODIS标准规定的13个核心基因座（vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、THO1、TPOX）为基础，在此基础上选择增加其他基因座，还有部分产品删除了其中部分基因座。因此采用不同生产商的STR试剂盒产生的数据是有基因座差异的。在比对时，只有相同基因座部分的数据可以比对，差异基因座数据无效。例如，试剂盒和
Figure BDA0000472708530000052
16试剂盒之间相同STR基因座为13个，其他两个STR基因座由于不同所以在数据比对时没有作用。并且，这13个可比对基因座数据用于排除的时候是可靠的，但是用于认定的情况下往往是不够的，需要更多的基因座数据。
同时，近年来出现越来越多的特殊的亲缘关系鉴定，比如生物学全同胞关系鉴定。在司法部司法鉴定中心颁布的《生物学全同胞关系鉴定实施规范》中要求，“在进行生物学全同胞关系鉴定时，目前亲缘关系鉴定常用的19个常染色体STR基因座（vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、THO1、TPOX、Penta E、Penta D、D2S1338、D19S433、D12S391、D6S1043）为必检基因座”。本发明采用了上述19个STR基因座，另外加上1个ESS要求的位点D2S441。这些基因座基本涵盖了目前市场上大部分试剂盒所常用的基因座，大大提高了系统效能。
本发明在一个PCR反应体系中扩增20个STR基因位点和一个性别识别位点。所采用的STR基因座为vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、Penta E、Penta D、TH01、TPOX、D2S441，性别识别位点选用的是国际通用的Amelogenin。
本发明能够分析性别和20个STR位点，通过这些信息得到的非父排除率高于0.999999，个体识别率高于0.9999999，可以保证两个无关个体特征重合的可能性小于10-18以上。
2.引物的设计
所述的引物采用Primer Premier5和NCBI Blast等软件设计而成，设计引物时应尽量确保各引物的Tm值在（60±2）℃的范围内，扩增效率类似并确保各对引物的扩增产物大小相差100bp以上。设计完成后，用AutoDimer等软件分析引物二聚体和不同引物之间的相互作用，如果有相互作用可产生非特异产物或者二聚体的需要重新设计，直至得到符合要求的引物序列。
选用人源DNA模板，分别用上述21对引物进行单重扩增，将扩增产物置于1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，根据电泳结果来调整PCR体系及扩增条件以得到21对引物共同的扩增条件。最终期望的效果是：在相同体系及扩增条件下，所有的引物对均能出现明亮且较单一的目的条带。如果有引物满足不了上述条件，则重新设计引物。
3.荧光标记系统建立
所述选择了FAM、HEX、TAMAR、ROX建立四色荧光复合扩增体系，将所设计的21对引物，分为四组进行荧光标记。每组采用一种荧光标记，分别是FAM、HEX、TMR和ROX。得到荧光标记引物后，用其相配对的非荧光引物组合，然后分别进行单重扩增，将扩增产物置于3500遗传分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来评估每对引物的扩增效率。其后，将同一荧光标记的引物混合置于同一管中扩增，将扩增产物置于3500遗传分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来确定每对引物的扩增效率，以及判断该组引物混合扩增是否引起非特异性。最后，根据单重扩增及组合扩增的毛细管电泳结果来初步确定各引物对的加入量，将21对引物混合置于同一管中扩增，再根据复合扩增的电泳结果来调整各自的浓度，使各引物对的扩增效率（反应在电泳结果的峰高上）基本一致为准。最终确定的21对引物序列。
4.扩增反应体系的优化
通过多次反复实验来确定21个基因座复合扩增体系的参数，包括：Taq DNA聚合酶的选择、Mg2+浓度、缓冲液的离子强度、Taq DNA聚合酶用量、DNA模板用量。
5.反应程序的优化
经过大量实验摸索了反应程序的变性、退火及延伸的温度和时间范围，认为在以下条件下（见表1）进行的扩增可以得到较好的结果：
表1聚合酶链式反应扩增条件
Figure BDA0000472708530000061
本发明的优势在于：
1.含有20个STR基因座和1个性别基因座Amelogenin，基本涵盖市场主流试剂盒所用位点，信息量大，兼容性好；
2.模板适应范围广，适用于所有涉及有细胞的物证案件中的法医DNA分析。凡是含有细胞的生物检材，如血迹、精斑、唾液、毛发、指甲、软骨及其它人体组织等均能鉴定。
3.系统特异性和稳定性好，经过反复验证多次，无非特异扩增产物产生，信号强度稳定。
4.灵敏度高，低至0.1ng的DNA模板量可以得到准确分型。
附图说明
图1：样本1的扩增效果图，
图2：样本2的扩增效果图，
图3：父亲样本的扩增效果图，
图4：母亲样本的扩增效果图，
图5：孩子样本的扩增效果图。
具体实施方式
实施例1应用21个短串联重复序列的复合扩增试剂盒检测志愿者基因座分型
1.血液样本的采集（血液样本由志愿者捐赠）
2.DNA提取
采用Chele-100法提取基因组DNA（参考<<Forensic DNA Protocol>>.HumanaPress,1998）取0.5-5μl的抗凝全血或1-3mm×2-5mm的血斑至于500μl离心管中，振荡混匀Chelex溶液使Chelex充分悬浮，每管加入195μl Chelex-100（5%）溶液和5ul蛋白酶K（20mg/ml）振荡混匀，56℃保温两小时或者过夜后，取出振荡2分钟，沸水中加热10分钟后13000rpm离心5分钟，小心移取150μl上清至新离心管中。
3.反应体系：
将各反应试剂（Buffer、Primer Mix、dNTP等）振荡混合后按表体积比（模板除外）配成PCR反应混合液，分装9μl于PCR反应管中，最后往各反应管加入1ul模板，离心后进入下一步。反应体系组成见表2。
表2标准扩增反应体系
Figure BDA0000472708530000071
4.PCR反应程序：
将PCR反应管置于扩增仪上，设计并运行如下程序：
第1步：95℃变性11分钟，第2步：94℃变性30秒，第3步60℃退火1分钟，第4步：70℃延伸1分钟，重复2至4步30次，最后60℃延伸60分钟。运行结束后将产物置于冰箱4℃保存。
5.毛细管电泳检测
将Orange500内标和甲酰胺按比例2.5:100混合，取12.5μl混合物加到96孔板里，再加入扩增产物样品或者是等位基因标准物1μl，混合静置数分钟，95℃变性3min，立即冰浴3min，离心后放入ABI3130xl测序仪上，准备检测。
6.数据分析
导入原始数据，在主页面的File菜单选择Add sample to project，找到样品文件，选中文件夹，点击add to list，点击add，样品文件即显示在Project窗口；选择分析参数。定义analysismethod、panel和size standard。浏览样本电泳的原始数据，任性一样本文件名，在“sample”菜单下选择“raw data”。移动追踪线，使光标停在引物峰右侧（第一个红色的内标峰之前），以此时窗口左下角X轴上显示的数值作为analysis method分析参数中的起始点；点击绿色分析按钮，出现save project对话框，命名后保存，软件即开始处理数据，分析完成后左下角显示analysis completed。采用GeneMapper软件分析得到的数据并生成图谱，见图1和图2。
实施例2应用21个短串联重复序列的复合扩增试剂盒进行亲子鉴定
1.收集亲子鉴定血液样本（血液样本由某遗传检验中心提供）
2.采用Chelex-100法提取基因组DNA（参考<<Forensic DNA Protocol>>.Humana Press,1998）取0.5-5μl的抗凝全血或1-3mm×2-5mm的血斑至于500μl离心管中，振荡混匀Chelex-100溶液使Chelex充分悬浮，每管加入195μl Chelex-100（5%）溶液和5μl蛋白酶K（20mg/ml）振荡混匀，56℃保温两小时或者过夜后，取出振荡2分钟，沸水中加热10分钟后13000rpm离心5分钟，小心移取150μl上清至新离心管中。
3.按照实施例1中的扩增条件进行PCR扩增。
4.按照实施例1中在遗传分析仪上进行检测，扩增效果见图3，图4，图5。
5.结果分析见表3
表3检测结果分析
MR21 father mather child PI
D19S433 13,14 13,14 13,13 3.486988848
D5S818 11,12 9,11 11,11 3.158249158
D21S11 31,33 29,32 31,32 5.043010753
D18S51 12,15 14,17 12,17 13.4
D6S1043 18,19 13,20 19,20 3.126666667
D3S1358 15,17 15,18 15,18 1.17839196
D13S317 9,12 8,8 8,9 3.932773109
D7S820 11,11 11,12 11,12 1.74301676
D16S539 11,12 9,11 11,12 2.455497382
CSF1PO 9,11 9,11 9,11 3.398550725
Penta D 10,11 9,14 11,14 3.025806452
D2S441 12,12 10,11 11,12 4.591133005
vWA 17,18 16,17 17,17 4.225225225
D8S1179 13,16 15,15 13,15 1.922131148
TPOX 8,11 8,8 8,11 1.606164384
Penta E 14,16 10,19 14,19 5.453488372
TH01 7,9 9,9.3 9,9 1.918200409
D12S391 18,18 18,21 18,18 4.206278027
D2S1338 23,23, 20,23 20,23 3.201365188
FGA 24,25 23,24 24,25 4.310344828
CPI 17258146469
本次三联体亲子鉴定共检测了21个基因座，未出现任何矛盾基因座，父权指数达到17258146469，可以对亲子关系做出肯定结论。
Figure IDA0000472708590000021
Figure IDA0000472708590000031
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Claims (9)

1.短串联重复序列的复合扩增体系，该复合扩增体系中包括20对引物，可同时扩增20个STR位点：D2S441、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、CSF1PO、FGA、Penta D、Penta E、TH01、TPOX和vWA，所述的20对引物分别为： 
扩增D19S433的上游引物D19S433-f如SEQ ID NO1所示， 
扩增D19S433的下游引物D19S433-r如SEQ ID NO2所示； 
扩增D5S818的上游引物D5S818-f如SEQ ID NO3所示， 
扩增D5S818的下游引物D5S818-r如SEQ ID NO4所示 
扩增D21S11的上游引物D21S11-f如SEQ ID NO5所示 
扩增D21S11的上游引物D21S11-r如SEQ ID NO6所示 
扩增D18S51的上游引物D18S51-f如SEQ ID NO7所示， 
扩增D18S51的下游引物D18S51-r如SEQ ID NO8所示； 
扩增D6S1043的上游引物D6S1043-f如SEQ ID NO9所示， 
扩增D6S1043的下游引物D6S1043-r如SEQ ID NO10所示； 
扩增D3S1358的上游引物D3S1358-f如SEQ ID NO11所示， 
扩增D3S1358的下游引物D3S1358-r如SEQ ID NO12所示； 
扩增D13S317的上游引物D13S317-f如SEQ ID NO13所示， 
扩增D13S317的下游引物D13S317-r如SEQ ID NO14所示； 
扩增D7S820的上游引物D7S820-f如SEQ ID NO15所示， 
扩增D7S820的下游引物D7S820-r如SEQ ID NO16所示； 
扩增D16S539的上游引物D16S539-f如SEQ ID NO17所示， 
扩增D16S539的下游引物D16S539-r如SEQ ID NO18所示； 
扩增CSF1PO的上游引物CSF1PO-f如SEQ ID NO19所示， 
扩增CSF1PO的下游引物CSF1PO-r如SEQ ID NO20所示； 
扩增Penta D的上游引物Penta D-f如SEQ ID NO21所示， 
扩增Penta D的下游引物Penta D-r如SEQ ID NO22所示； 
扩增D2S441的上游引物D2S441-f如SEQ ID NO23所示， 
扩增D2S441的下游引物D2S441-r如SEQ ID NO24所示； 
扩增vWA的上游引物vWA-f如SEQ ID NO25所示， 
扩增vWA的下游引物vWA-r如SEQ ID NO26所示； 
扩增D8S1179的上游引物D8S1179-f如SEQ ID NO27所示， 
扩增D8S1179的下游引物D8S1179-r如SEQ ID NO28所示； 
扩增TPOX的上游引物TPOX-f如SEQ ID NO29所示， 
扩增TPOX的下游引物TPOX-r如SEQ ID NO30所示； 
扩增Penta E的上游引物Penta E-f如SEQ ID NO31所示， 
扩增Penta E的下游引物Penta E-r如SEQ ID NO32所示； 
扩增TH01的上游引物TH01-f如SEQ ID NO33所示， 
扩增TH01的下游引物TH01-r如SEQ ID NO34所示； 
扩增D12S391的上游引物D12S391-f如SEQ ID NO35所示， 
扩增D12S391的下游引物D12S391-r如SEQ ID NO36所示； 
扩增D2S1338的上游引物D2S1338-f如SEQ ID NO37所示， 
扩增D2S1338的下游引物D2S1338-r如SEQ ID NO38所示； 
扩增FGA的上游引物FGA-f如SEQ ID NO39所示， 
扩增FGA的下游引物FGA-r如SEQ ID NO40所示。 
2.根据权利要求1所述的复合扩增体系，还包括1对能扩增性别识别位点Amelogenin的引物，所述引物为： 
扩增Amel的上游引物Amel-f如SEQ ID NO41所示， 
扩增Amel的下游引物Amel-r如SEQ ID NO42所示。 
3.根据权利要求2所述的复合扩增体系，所述复合扩增体系中的被扩增位点分别由四种颜色的荧光标记，相同荧光标记视为同一组，四组组合分别为：第一组D19S433、D5S818、D21S11、D18S51和D6S1043；第二组Amel、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO和Penta D；第三组D2S441、vWA、D8S1179、TPOX和Penta E；第四组TH01、D12S391、D2S1338和FGA。 
4.根据权利要求3所述的复合扩增体系，所述第一组的标记为FAM标记，第二组的标记为HEX标记，第三组的标记为TAMRA标记，第四组的标记为ROX标记。 
5.根据权利要求1或2所述的复合扩增体系，所述扩增体系还包括PCR缓冲液、模板DNA和Taq DNA聚合酶。 
6.根据权利要求5所述的复合扩增体系，所述PCR缓冲液成分包括：10mM的硫酸铵，10mM的氯化钾，50mM的pH8.3的Tris-HCl，2mM的镁离子和0.2mM的dNTP，所述Taq DNA聚合酶用量为2U。 
7.根据权利要求2所述的复合扩增体系，所述扩增体系扩增时的反应条件为： 
第1步：95℃变性11分钟，第2步：94℃变性30秒，第3步60℃退火1分钟，第4步： 70℃延伸1分钟，重复2至4步30次，最后60℃延伸60分钟。 
8.一种试剂盒，包括权利要求1-7任一复合扩增体系。 
9.权利要求1-7任一扩增体系或权利要求8所述的试剂盒在个体识别、亲子鉴定中的应用。 
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016049877A1 (zh) * 2014-09-30 2016-04-07 深圳华大基因股份有限公司 无创产前亲子鉴定中基于str分型技术的检测方法和系统
CN105969906A (zh) * 2016-07-27 2016-09-28 北京智鉴源技术有限公司 基于高通量测序的30个str等位基因的检测试剂盒
CN106701932A (zh) * 2016-12-08 2017-05-24 江苏苏博生物医学股份有限公司 一种采用新型双荧光标记方法的21个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒
CN107267643A (zh) * 2017-07-28 2017-10-20 公安部物证鉴定中心 检测人类样本的成套试剂与应用
CN107557481A (zh) * 2017-10-10 2018-01-09 苏州绘真医学检验所有限公司 检测痕量混合人源dna样本13个codis str基因座的试剂、试剂盒与其应用
CN114085913A (zh) * 2021-07-02 2022-02-25 苏州鉴达生物科技有限公司 一种用于小鼠细胞株鉴定的str基因座荧光标记复合扩增试剂盒及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101397584A (zh) * 2007-09-25 2009-04-01 阿普里拉股份有限公司 在中国人群中具有改善的鉴别能力的复合str测定方法以及试剂盒
CN101818192A (zh) * 2009-08-27 2010-09-01 基点认知技术(北京)有限公司 20个短串联重复序列的复合扩增试剂盒
CN103298954A (zh) * 2010-11-15 2013-09-11 生命技术公司 用于多重扩增短串联重复基因座的方法和试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101397584A (zh) * 2007-09-25 2009-04-01 阿普里拉股份有限公司 在中国人群中具有改善的鉴别能力的复合str测定方法以及试剂盒
CN101818192A (zh) * 2009-08-27 2010-09-01 基点认知技术(北京)有限公司 20个短串联重复序列的复合扩增试剂盒
CN103298954A (zh) * 2010-11-15 2013-09-11 生命技术公司 用于多重扩增短串联重复基因座的方法和试剂盒

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016049877A1 (zh) * 2014-09-30 2016-04-07 深圳华大基因股份有限公司 无创产前亲子鉴定中基于str分型技术的检测方法和系统
CN105969906A (zh) * 2016-07-27 2016-09-28 北京智鉴源技术有限公司 基于高通量测序的30个str等位基因的检测试剂盒
CN105969906B (zh) * 2016-07-27 2018-06-22 北京智鉴源技术有限公司 基于高通量测序的30个str等位基因的检测试剂盒
CN106701932A (zh) * 2016-12-08 2017-05-24 江苏苏博生物医学股份有限公司 一种采用新型双荧光标记方法的21个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒
CN106701932B (zh) * 2016-12-08 2019-09-27 江苏苏博生物医学股份有限公司 一种采用双荧光标记方法的21个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒
CN107267643A (zh) * 2017-07-28 2017-10-20 公安部物证鉴定中心 检测人类样本的成套试剂与应用
CN107557481A (zh) * 2017-10-10 2018-01-09 苏州绘真医学检验所有限公司 检测痕量混合人源dna样本13个codis str基因座的试剂、试剂盒与其应用
CN114085913A (zh) * 2021-07-02 2022-02-25 苏州鉴达生物科技有限公司 一种用于小鼠细胞株鉴定的str基因座荧光标记复合扩增试剂盒及其应用

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