CN107267643A - 检测人类样本的成套试剂与应用 - Google Patents

检测人类样本的成套试剂与应用 Download PDF

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CN107267643A CN201710630906.5A CN201710630906A CN107267643A CN 107267643 A CN107267643 A CN 107267643A CN 201710630906 A CN201710630906 A CN 201710630906A CN 107267643 A CN107267643 A CN 107267643A
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江丽
马新
孙敬
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Abstract

本发明公开了检测人类样本的成套试剂与应用。本发明公开的成套试剂，基于基因座位点Amelogenin、D5S818、D21S11、D7S820、CSF1PO、D2S1338、D3S1358、vWA、D8S1179、D16S539、Penta E、TPOX、TH01、D19S433、D18S51、FGA、D6S1043、D13S317、D12S391、Penta D、D1S1656和DYS448，由序列表中序列1‑44中的至少42条引物组成。实验证明，本发明的成套试剂具有高特异性和灵敏度，可以检测案发现场取到的少量样本以及血卡样本，具有很强的适用性。

Description

检测人类样本的成套试剂与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，检测人类样本的成套试剂与应用。
背景技术
目前，法医DNA STR检测工作在我国开展广泛，市场上也有不少产品，但是这些产品在解决实际问题是还有一些不足之处。如其核心位点在中国人群中的适用性仍偏弱(试剂盒不包含D6S1043),或是其扩增产物的片段较大在案件检材检验中存在不足(扩增大片段产物达到450bp-500bp)。另外，目前常染色体试剂盒中添加的用于印证的Y-STR位点多为DYS391，该位点在中国人群中的特异性也不高。因此研制包含更多高特异性的、适合中国人群的、扩增片段较小的STR试剂盒仍有很大必要。
发明内容
本发明的目的是提供检测人类样本的成套试剂。
本发明首先提供了可用于扩增人类基因座位点和检测人类样本的成套试剂，其名称为成套试剂1，所述成套试1由名称依次为Amel-P、D5S818-P、D21S11-P、D7S820-P、CSF1PO-P、D2S1338-P、D3S1358-P、vWA-P、D8S1179-P、D16S539-P、Penta E-P、TPOX-P、TH01-P、D19S433-P、D18S51-P、FGA-P、D6S1043-P、D13S317-P、D12S391-P和Penta D-P的引物对组成；
所述Amel-P由序列表中序列1和2所示的两条单链DNA组成；
所述D5S818-P由序列表中序列3和4所示的两条单链DNA组成；
所述D21S11-P由序列表中序列5和6所示的两条单链DNA组成；
所述D7S820-P由序列表中序列7和8所示的两条单链DNA组成；
所述CSF1PO-P由序列表中序列9和10所示的两条单链DNA组成；
所述D2S1338-P由序列表中序列11和12所示的两条单链DNA组成；
所述D3S1358-P由序列表中序列13和14所示的两条单链DNA组成；
所述vWA-P由序列表中序列15和16所示的两条单链DNA组成；
所述D8S1179-P由序列表中序列17和18所示的两条单链DNA组成；
所述D16S539-P由序列表中序列19和20所示的两条单链DNA组成；
所述Penta E-P由序列表中序列21和22所示的两条单链DNA组成；
所述TPOX-P由序列表中序列23和24所示的两条单链DNA组成；
所述TH01-P由序列表中序列25和26所示的两条单链DNA组成；
所述D19S433-P由序列表中序列27和28所示的两条单链DNA组成；
所述D18S51-P由序列表中序列29和30所示的两条单链DNA组成；
所述FGA-P由序列表中序列31和32所示的两条单链DNA组成；
所述D6S1043-P由序列表中序列33和34所示的两条单链DNA组成；
所述D13S317-P由序列表中序列35和36所示的两条单链DNA组成；
所述D12S391-P由序列表中序列37和38所示的两条单链DNA组成；
所述Penta D-P由序列表中序列39和40所示的两条单链DNA组成。
所述人类基因座位点为p1)：
P1)Amelogenin、D5S818、D21S11、D7S820、CSF1PO、D2S1338、D3S1358、vWA、D8S1179、D16S539、Penta E、TPOX、TH01、D19S433、D18S51、FGA、D6S1043、D13S317、D12S391和Penta D；
所述Amel-P可用于扩增Amelogenin；
所述D5S818-P可用于扩增D5S818；
所述D21S11-P可用于扩增D21S11；
所述D7S820-P可用于扩增D7S820；
所述CSF1PO-P可用于扩增CSF1PO；
所述D2S1338-P可用于扩增D2S1338；
所述D3S1358-P可用于扩增D3S1358；
所述vWA-P可用于扩增vWA；
所述D8S1179-P可用于扩增D8S1179；
所述D16S539-P可用于扩增D16S539；
所述Penta E-P可用于扩增Penta E；
所述TPOX-P可用于扩增TPOX；
所述TH01-P可用于扩增TH01；
所述D19S433-P可用于扩增D19S433；
所述D18S51-P可用于扩增D18S51；
所述FGA-P可用于扩增FGA；
所述D6S1043-P可用于扩增D6S1043；
所述D13S317-P可用于扩增D13S317；
所述D12S391-P可用于扩增D12S391；
所述Penta D-P可用于扩增Penta D。
本发明还提供了可用于扩增人类基因座位点和检测人类样本的成套试剂，其名称为成套试剂A，所述成套试剂A由所述成套试剂1与名称为D1S1656-P的引物对组成，所述D1S1656-P由序列表中序列41和42所示的两条单链DNA组成。
其中，所述人类基因座位点为p2)：
P2)Amelogenin、D5S818、D21S11、D7S820、CSF1PO、D2S1338、D3S1358、vWA、D8S1179、D16S539、Penta E、TPOX、TH01、D19S433、D18S51、FGA、D6S1043、D13S317、D12S391、Penta D和D1S1656。
所述D1S1656-P可用于扩增D1S1656。
本发明还提供了可用于扩增人类基因座位点和检测人类样本的成套试剂，其名称为成套试剂B，所述成套试剂B由所述成套试剂1与名称为DYS448-P的引物对组成，所述DYS448-P由序列表中序列43和44所示的两条单链DNA组成。
其中，所述人类基因座位点为p3)：
P3)Amelogenin、D5S818、D21S11、D7S820、CSF1PO、D2S1338、D3S1358、vWA、D8S1179、D16S539、Penta E、TPOX、TH01、D19S433、D18S51、FGA、D6S1043、D13S317、D12S391、Penta D和DYS448。
所述DYS448-P可用于扩增DYS448。
上述各成套试剂中，每个引物对中均可有一条引物由荧光物质标记。所述荧光物质具体可为FAM、HEX、TAMRA或ROX。
所述荧光物质可标记在引物的5′端。
上述各成套试剂中各引物对的两条单链DNA的摩尔比均可为1:1。所述成套试剂1中所述Amel-P、所述D5S818-P、所述D21S11-P、所述D7S820-P、所述CSF1PO-P、所述D2S1338-P、所述D3S1358-P、所述vWA-P、所述D8S1179-P、所述D16S539-P、所述Penta E-P、所述TPOX-P、所述TH01-P、所述D19S433-P、所述D18S51-P、所述FGA-P、所述D6S1043-P、所述D13S317-P、所述D12S391-P和所述Penta D-P的摩尔比可依次为4:5:5:4:6:5:4:4:4:6:6:5:5:4.5:5:5.5:6:4:5:6，每个引物对均以单条引物计。所述成套试剂A中所述Amel-P、所述D5S818-P、所述D21S11-P、所述D7S820-P、所述CSF1PO-P、所述D2S1338-P、所述D3S1358-P、所述vWA-P、所述D8S1179-P、所述D16S539-P、所述Penta E-P、所述TPOX-P、所述TH01-P、所述D19S433-P、所述D18S51-P、所述FGA-P、所述D6S1043-P、所述D13S317-P、所述D12S391-P、所述Penta D-P和所述D1S1656-P的摩尔比可依次为4:5:5:4:6:5:4:4:4:6:6:5:5:4.5:5:5.5:6:4:5:6:4，每个引物对均可以单条引物计。所述成套试剂B中所述Amel-P、所述D5S818-P、所述D21S11-P、所述D7S820-P、所述CSF1PO-P、所述D2S1338-P、所述D3S1358-P、所述vWA-P、所述D8S1179-P、所述D16S539-P、所述Penta E-P、所述TPOX-P、所述TH01-P、所述D19S433-P、所述D18S51-P、所述FGA-P、所述D6S1043-P、所述D13S317-P、所述D12S391-P、所述Penta D-P和所述DYS448-P的摩尔比可依次为4:5:5:4:6:5:4:4:4:6:6:5:5:4.5:5:5.5:6:4:5:6:4.5，每个引物对均以单条引物计。
上述各成套试剂中各引物对可按照上述比例混合后分装，也可每个引物对独立包装，也可每条引物独立包装。
本发明还提供了用于检测人类样本的系统，所述系统包括所述成套试剂1、所述成套试剂A或所述成套试剂B。
所述系统还可包括上述人类基因座位点p1)、p2)或p3)在人群中的分型。所述系统具体可由所述成套试剂1、所述成套试剂A或所述成套试剂B与上述人类基因座位点p1)、p2)或p3)在人群中的分型组成。各位点的各个分型可作为利用所述成套试剂1、所述成套试剂A或所述成套试剂B检测待测样本时各基因座分型的标准。各位点的各个分型的序列见STRBase数据库，网址为：http://www.cstl.nist.gov/strbase/。
所述成套试剂1与人类基因座位点p1)在人群中的分型配套使用，所述成套试剂A与人类基因座位点p2)在人群中的分型配套使用，所述成套试剂B与人类基因座位点p3)在人群中的分型配套使用。
所述系统还可包括作为标准品的人类样本。所述系统具体可由所述成套试剂1、所述成套试剂A或所述成套试剂B与作为标准品的人类样本组成，还可由所述成套试剂1、所述成套试剂A或所述成套试剂B、上述人类基因座位点p1)、p2)或p3)在人群中的分型以及作为标准品的人类样本组成。
上述系统可为试剂盒。
本发明还提供了下述Ⅰ或Ⅱ的应用：
Ⅰ、所述成套试剂1、所述成套试剂A或所述成套试剂B的下述任一应用：
X1、在制备检测或辅助检测人类样本试剂盒中的应用；
X2、在制备检测或辅助检测人类男性样本试剂盒中的应用；
X3、在制备检测或辅助检测人类女性样本试剂盒中的应用；
X4、在制备扩增人类基因座位点试剂盒中的应用；
X5、在检测或辅助检测人类样本中的应用；
X6、在检测或辅助检测人类男性样本中的应用；
X7、在检测或辅助检测人类女性样本中的应用；
X8、在扩增所述人类基因座位点中的应用；
Ⅱ、检测人类基因座位点的物质的下述任一应用；
Y1、在检测或辅助检测人类样本中的应用；
Y2、在检测或辅助检测人类男性样本中的应用；
Y3、在检测或辅助检测人类女性样本中的应用；
所述人类基因座位点均为上述p1)、p2)或p3)。
本发明还提供了非诊断目的的检测或辅助检测人类样本的方法，所述方法包括：利用所述成套试剂A对待测样本的基因组DNA进行扩增，得到扩增产物，根据下述M1)或M2)确定待测样本是否为人类样本：
M1)如果所述扩增产物符合下述a1)-a21)的全部标准，则所述待测样本为或候选为人类样本；如果所述扩增产物不符合如下a1)-a21)的全部标准，则所述待测样本非或候选非人类样本：
a1)所述Amel-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为93-108bp；
a2)所述D5S818-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为114-150bp；
a3)所述D21S11-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为186-230bp；
a4)所述D7S820-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为248-276bp；
a5)所述CSF1PO-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为288.5-324.5bp；
a6)所述D2S1338-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为341-393bp；
a7)所述D3S1358-P的扩增产物呈绿颜色且大小为99-131bp；
a8)所述vWA-P的扩增产物呈绿颜色且大小为145-177bp；
a9)所述D8S1179-P的扩增产物呈绿颜色且大小为203-247bp；
a10)所述D16S539-P的扩增产物呈绿颜色且大小为259-299bp；
a11)所述Penta E-P的扩增产物呈绿颜色且大小为305-381bp；
a12)所述TPOX-P的扩增产物呈黑颜色且大小为80-108bp；
a13)所述TH01-P的扩增产物呈黑颜色且大小为129-168bp；
a14)所述D19S433-P的扩增产物呈黑颜色且大小为180-232bp；
a15)所述D18S51-P的扩增产物呈黑颜色且大小为245-309bp；
a16)所述FGA-P的扩增产物呈黑颜色且大小为333-385bp；
a17)所述D6S1043-P的扩增产物呈红颜色且大小为89-140bp；
a18)所述D13S317-P的扩增产物呈红颜色且大小为164-188bp；
a19)所述D12S391-P的扩增产物呈红颜色且大小为198-250bp；
a20)所述Penta D-P的扩增产物呈红颜色且大小为334-384bp；
a21)所述D1S1656-P的扩增产物呈红颜色且大小为255-302bp；
M2)对所述扩增产物进行STR分型，如果所述扩增产物的STR分型符合人类样本中上述p2)的全部人类基因座的分型，所述待测样本为或候选为人类样本；如果所述扩增产物的STR分型不符合人类样本中上述p2)的全部人类基因座的分型，则所述待测样本非或候选非人类样本。
利用所述成套试剂A在进行PCR扩增时，反应体系中Amel-P、D5S818-P、D21S11-P、D7S820-P、CSF1PO-P、D2S1338-P、D3S1358-P、vWA-P、D8S1179-P、D16S539-P、Penta E-P、TPOX-P、TH01-P、D19S433-P、D18S51-P、FGA-P、D6S1043-P、D13S317-P、D12S391-P、Penta D-P和D1S1656-P的两条引物的浓度分别可为0.25与0.25μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.25与0.25μmol/L、0.38与0.38μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.25与0.25μmol/L、0.25与0.25μmol/L、0.25与0.25μmol/L、0.38与0.38μmol/L、0.38与0.38μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.28与0.28μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.34与0.34μmol/L、0.38与0.38μmol/L、0.25与0.25μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.38与0.38μmol/L、0.25与0.25μmol/L。所述PCR扩增的退火温度可为59℃。
本发明还提供了非诊断目的的检测或辅助检测人类样本的方法，所述方法包括：利用所述成套试剂B对待测样本的基因组DNA进行扩增，得到扩增产物，根据下述N1)或N2)确定待测样本是否为人类样本：
N1)如果所述扩增产物符合下述b1)-b21)的全部标准，则所述待测样本为或候选为人类样本；如果所述扩增产物不符合如下b1)-b21)的全部标准，则所述待测样本非或候选非人类样本：
b1)所述Amel-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为93-108bp；
b2)所述D5S818-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为114-150bp；
b3)所述D21S11-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为186-230bp；
b4)所述D7S820-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为248-276bp；
b5)所述CSF1PO-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为288.5-324.5bp；
b6)所述D2S1338-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为341-393bp；
b7)所述D3S1358-P的扩增产物呈绿颜色且大小为99-131bp；
b8)所述vWA-P的扩增产物呈绿颜色且大小为145-177bp；
b9)所述D8S1179-P的扩增产物呈绿颜色且大小为203-247bp；
b10)所述D16S539-P的扩增产物呈绿颜色且大小为259-299bp；
b11)所述Penta E-P的扩增产物呈绿颜色且大小为305-381bp；
b12)所述TPOX-P的扩增产物呈黑颜色且大小为80-108bp；
b13)所述TH01-P的扩增产物呈黑颜色且大小为129-168bp；
b14)所述D19S433-P的扩增产物呈黑颜色且大小为180-232bp；
b15)所述D18S51-P的扩增产物呈黑颜色且大小为245-309bp；
b16)所述FGA-P的扩增产物呈黑颜色且大小为333-385bp；
b17)所述D6S1043-P的扩增产物呈红颜色且大小为89-140bp；
b18)所述D13S317-P的扩增产物呈红颜色且大小为164-188bp；
b19)所述D12S391-P的扩增产物呈红颜色且大小为198-250bp；
b20)所述Penta D-P的扩增产物呈红颜色且大小为334-384bp；
b21)所述DYS448-P的扩增产物呈红颜色且大小为266-320bp；
N2)对所述扩增产物进行STR分型，如果所述扩增产物的STR分型符合人类样本中上述p3)的全部人类基因座的分型，所述待测样本为或候选为人类样本；如果所述扩增产物的STR分型不符合人类样本中上述p3)的全部人类基因座的分型，则所述待测样本非或候选非人类样本。
利用所述成套试剂B在进行PCR扩增时，Amel-P、D5S818-P、D21S11-P、D7S820-P、CSF1PO-P、D2S1338-P、D3S1358-P、vWA-P、D8S1179-P、D16S539-P、Penta E-P、TPOX-P、TH01-P、D19S433-P、D18S51-P、FGA-P、D6S1043-P、D13S317-P、D12S391-P、Penta D-P和DYS448-P的两条引物的浓度分别可为0.25与0.25μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.25与0.25μmol/L、0.38与0.38μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.25与0.25μmol/L、0.25与0.25μmol/L、0.25与0.25μmol/L、0.38与0.38μmol/L、0.38与0.38μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.28与0.28μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.34与0.34μmol/L、0.38与0.38μmol/L、0.25与0.25μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.38与0.38μmol/L、0.28与0.28μmol/L。所述PCR扩增的退火温度可为59℃。
上述各方法中，在所述待测样本为或候选为人类样本时，根据所述Amel-P的扩增产物进一步确定待测样本为女性样本还是男性样本。具体可为根据Amel-P的扩增产物的STR分型与Amelogenin基因座位点的分型进行比较：如果Amel-P的扩增产物的STR分型为X型和Y型，所述待测样本为或候选为人类男性样本；如果Amel-P的扩增产物的STR分型为X型，所述待测样本为或候选为人类女性样本。
本发明中，所述样本和所述待测样本均可为离体样本。所述样本和所述待测样本具体均可为血液、唾液、骨骼、毛发、组织或脱落细胞检材。
实验证明，本发明的成套试剂1、成套试剂A和成套试剂B不仅可用于扩增人类基因座位点(Amelogenin、D5S818、D21S11、D7S820、CSF1PO、D2S1338、D3S1358、vWA、D8S1179、D16S539、Penta E、TPOX、TH01、D19S433、D18S51、FGA、D6S1043、D13S317、D12S391、Penta D、D1S1656和DYS448)，还可以用于检测人类样本。利用本发明的成套试剂A和成套试剂B在检测待测样本时，可以特异检测出人类样本，还可以进一步确定检测到的人类样本为女性样本还是男性样本，并且还具有高灵敏度，可以检测案发现场取到的少量样本以及血卡样本，最低可检测到浓度为0.1ng/μL的人类样本基因组DNA。表明，本发明的成套试剂A和成套试剂B具有很强的适用性。
附图说明
图1为包含D1S1656位点的ladder的结果。
图2为成套试剂A检测9947A的STR分型结果。
图3为成套试剂A检测猴、牛、猪的结果。
图4为包含DYS448位点的ladder的结果。
图5为成套试剂B检测9948的STR分型结果。
图6为Typer500图谱。
图7为血卡样本的STR分型结果。
图8为案件样本的STR分型结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、用于检测人类样本的成套试剂的制备
本实施例提供的用于检测人类样本的成套试剂，为基于20个常染色体STR基因座的成套试剂1、基于20个常染色体STR基因座和1个性别标识位点的成套试剂A和基于19个STR常染色体基因座、1个Y染色体STR基因座和1个性别标识位点的成套试剂B，成套试剂1由名称为Amel-P、D5S818-P、D21S11-P、D7S820-P、CSF1PO-P、D2S1338-P、D3S1358-P、vWA-P、D8S1179-P、D16S539-P、Penta E-P、TPOX-P、TH01-P、D19S433-P、D18S51-P、FGA-P、D6S1043-P、D13S317-P、D12S391-P和Penta D-P的引物对组成，成套试剂A由成套试剂1与名称为D1S1656-P的引物对组成，成套试剂B由成套试剂1与名称为DYS448-P的引物对组成，每个引物对均由两条单链DNA组成。
上述各成套试剂中各引物对的两条单链DNA的摩尔比均为1:1，成套试剂1中Amel-P、D5S818-P、D21S11-P、D7S820-P、CSF1PO-P、D2S1338-P、D3S1358-P、vWA-P、D8S1179-P、D16S539-P、Penta E-P、TPOX-P、TH01-P、D19S433-P、D18S51-P、FGA-P、D6S1043-P、D13S317-P、D12S391-P和Penta D-P的摩尔比依次为4:5:5:4:6:5:4:4:4:6:6:5:5:4.5:5:5.5:6:4:5:6(每个引物对均以单条引物计)，成套试剂A中Amel-P、D5S818-P、D21S11-P、D7S820-P、CSF1PO-P、D2S1338-P、D3S1358-P、vWA-P、D8S1179-P、D16S539-P、Penta E-P、TPOX-P、TH01-P、D19S433-P、D18S51-P、FGA-P、D6S1043-P、D13S317-P、D12S391-P、Penta D-P和D1S1656-P的摩尔比依次为4:5:5:4:6:5:4:4:4:6:6:5:5:4.5:5:5.5:6:4:5:6:4(每个引物对均以单条引物计)，成套试剂B中Amel-P、D5S818-P、D21S11-P、D7S820-P、CSF1PO-P、D2S1338-P、D3S1358-P、vWA-P、D8S1179-P、D16S539-P、Penta E-P、TPOX-P、TH01-P、D19S433-P、D18S51-P、FGA-P、D6S1043-P、D13S317-P、D12S391-P、Penta D-P和DYS448-P的摩尔比依次为4:5:5:4:6:5:4:4:4:6:6:5:5:4.5:5:5.5:6:4:5:6:4.5(每个引物对均以单条引物计)。
上述各成套试剂中每个引物对中均有一条单链DNA的5′端由荧光物质标记(表1)。
上述各成套试剂中各引物对按照上述比例混合后分装。
各引物对的具体信息如表1所示，每个引物对能扩增相应的基因座。
表1、用于检测人类样本的成套试剂
实施例2、用于检测人类样本的成套试剂的成套试剂的特异性
一、实施例1的成套试剂A
供试样本：代表人类样本的细胞标准品9947A(女性)以及猴、牛、猪三类常见的动物物种的血液，利用无菌水作为阴性对照。
检测方法：提取各样本的基因组DNA，向基因组DNA中加入成套试剂A及扩增缓冲液(扩增缓冲液由溶质和溶剂组成，其中溶剂为Tris缓冲液(0.05mol/L,pH为7.5)，溶质及其浓度分别为0.1mol/L牛血清白蛋白、0.08mol/L dATP、0.08mol/L dTTP、0.08mol/L dGTP、0.08mol/L dCTP、0.1mol/L吐温-20、0.3mol/L氯化镁、0.25mol/L氯化钾、0.01mol/L叠氮化钠、0.3mol/L甘油、0.05mol/LTaq酶、0.1mol/L硫酸铵，溶质中的Taq酶、dATP、dTTP、dGTP、dCTP和牛血清白蛋白均为罗氏公司产品，其余组分均为sigma公司产品)混合均匀，将配置好的反应体系置于PCR仪中进行PCR扩增。
10μl反应体系中含有4.5μl成套试剂A的溶液，4.5μL扩增缓冲液以及1μl基因组DNA。该反应体系中，成套试剂A中所有引物的总浓度为12.88μmol/L(即各引物在反应体系中的浓度之和),Amel-P、D5S818-P、D21S11-P、D7S820-P、CSF1PO-P、D2S1338-P、D3S1358-P、vWA-P、D8S1179-P、D16S539-P、Penta E-P、TPOX-P、TH01-P、D19S433-P、D18S51-P、FGA-P、D6S1043-P、D13S317-P、D12S391-P、Penta D-P和D1S1656-P的两条引物的浓度分别为0.25与0.25μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.25与0.25μmol/L、0.38与0.38μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.25与0.25μmol/L、0.25与0.25μmol/L、0.25与0.25μmol/L、0.38与0.38μmol/L、0.38与0.38μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.28与0.28μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.34与0.34μmol/L、0.38与0.38μmol/L、0.25与0.25μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.38与0.38μmol/L、0.25与0.25μmol/L。
反应条件为：95℃变性10分钟，之后运行28个循环的(94℃30秒，59℃2分钟，72℃1分钟)，接着60℃延伸60分钟，最终4℃保温。
检测时使用AB公司的3130、3500系列测序仪或公安部第一研究所的GA118测序仪，采用G5通道，具体检测流程依据相关仪器36cm毛细管5色通道检测方法进行。
检测过程中采用包含D1S1656的ladder(记为ladder1)确定各扩增产物大小。其中ladder1包括各位点(Amel，D5S818，D21S11，D7S820，CSF1PO，D2S1338，D3S1358，vWA，D8S1179，D16S539，Penta E，TPOX，TH01，D19S433，D18S51，FGA，D6S1043，D13S317，D12S391，D1S1656和Penta D)在人群中的常见分型，具体分型如下：
Amel包括X和Y共2个分型(X为99bp，Y比X大6bp)；
D5S818包括7-16共10分型，分别记为7、8、9、10、11、12、13、14、15和16(其中7大小为114bp，后面依次增大4bp)；
D21S11包括26-37中共计13个分型，分别记为26、27、28、29、30、30.3、31、32、33、34、35、36和37(其中26大小为186bp，后面每个整数依次增大4bp，30.3比30多3bp)；
D7S820包括7-14共计8个分型，分别记为7、8、9、10、11、12、13和14(其中7大小为248bp，后面依次增大4bp)；
CSF1PO包括6-15共计10个分型，分别记为6、7、8、9、10、11、12、13、14和15(其中6大小为288.5bp，后面依次增大4bp)；
D2S1338包括15-28共计14个分型，分别记为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27和28(其中15大小为341bp，后面依次增大4bp)；
D3S1358包括12-20共计9个分型，分别记为12、13、14、15、16、17、18、19和20(其中12大小为99bp，后面依次增大4bp)；
vWA包括13-21共计9个分型，分别记为13、14、15、16、17、18、19、20和21(其中13大小为145bp，后面依次增大4bp)；
D8S1179包括7-18共计12个分型，分别记为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18(其中7大小为203bp，后面依次增大4bp)；
D16S539包括5-15共计9个分型，分别记为5、8、9、10、11、12、13、14和15(其中5大小为259bp，8大小为271bp，后面依次增大4bp)；
Penta E包括5-24共计18个分型，分别记为5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24(其中5大小为305bp，8大小为320bp，后面依次增大5bp)；
TPOX包括6-13共计8个分型，分别记为6、7、8、9、10、11、12和13(其中6大小为80bp，后面依次增大4bp)；
TH01包括4-13.3共计10个分型，分别记为4、5、6、7、8、9、9.3、10、11和13.3(其中4大小为129bp，后面每个整数依次增大4bp，9.3比9多3bp，13.3比11多11bp)；
D19S433包括5.2-18.2共计20个分型，分别记为5.2、6.2、8、9、10、11、12、12.2、13、13.2、14、14.2、15、15.2、16、16.2、17、17.2、18和18.2(其中5.2大小为180bp，6.2大小为184bp，8大小为190bp，后面每个整数依次增大4bp，12.2、13.2、14.2、15.2、16.2、17.2和18.2分别比12、13、14、15、16、17和18多2bp)；
D18S51包括10-26共计17个分型，分别记为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26(其中10大小为245bp，后面依次增大4bp)；
FGA包括17-30共计14个分型，分别记为17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30(其中17大小为333bp，后面依次增大4bp)；
D6S1043包括9-21.3共计14个分型，分别记为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21和21.3(其中9大小为89bp，后面每个整数依次增大4bp，21.3比21多3bp)；
D13S317包括8-14共计7个分型，分别记为8、9、10、11、12、13和14(其中8大小为164bp，后面依次增大4bp)；
D12S391包括14-27共计15个分型，分别记为14、15、16、17、18、19、19.3、20、21、22、23、24、25、26和27(其中14大小为198bp，后面每个整数依次增大4bp，19.3比19多3bp)；
D1S1656包括9-20.3共计15个分型，分别记为9、10、11、12、13、14、15、16、16.3、17、17.3、18、18.3、19.3和20.3(其中9大小为255bp，后面每个整数依次增大4bp，16.3比15多7bp，18.3、19.3和20.3分别比18多3bp，7bp和10bp)；
Penta D包括6-16共计11个分型，分别记为6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16(其中6大小为334bp，后面依次增大5bp)。
各位点的各个分型的序列见STRBase数据库，网址为：http://www.cstl.nist.gov/strbase/。Amel，D5S818，D21S11，D7S820，CSF1PO，D2S1338的各分型均由FAM标记，D3S1358，vWA，D8S1179，D16S539，Penta E的各分型均由HEX标记，TPOX，TH01，D19S433，D18S51，FGA的各分型均由TAMRA标记，D6S1043，D13S317，D12S391，D1S1656和Penta D的各分型均由ROX标记。
在检测待测样本时，根据下述M1)或M2)确定待测样本是否为人类样本：
M1)如果成套试剂A的扩增产物符合如下a1)-a21)的全部标准，则待测样本为人类样本；如果成套试剂A的扩增产物不符合如下a1)-a21)的全部标准，则待测样本非人类样本，该标准具体如下：
a1)Amel-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为93-108bp；
a2)D5S818-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为114-150bp；
a3)D21S11-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为186-230bp；
a4)D7S820-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为248-276bp；
a5)CSF1PO-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为288.5-324.5bp；
a6)D2S1338-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为341-393bp；
a7)D3S1358-P的扩增产物呈绿颜色且大小为99-131bp；
a8)vWA-P的扩增产物呈绿颜色且大小为145-177bp；
a9)D8S1179-P的扩增产物呈绿颜色且大小为203-247bp；
a10)D16S539-P的扩增产物呈绿颜色且大小为259-299bp；
a11)Penta E-P的扩增产物呈绿颜色且大小为305-381bp；
a12)TPOX-P的扩增产物呈黑颜色且大小为80-108bp；
a13)TH01-P的扩增产物呈黑颜色且大小为129-168bp；
a14)D19S433-P的扩增产物呈黑颜色且大小为180-232bp；
a15)D18S51-P的扩增产物呈黑颜色且大小为245-309bp；
a16)FGA-P的扩增产物呈黑颜色且大小为333-385bp；
a17)D6S1043-P的扩增产物呈红颜色且大小为89-140bp；
a18)D13S317-P的扩增产物呈红颜色且大小为164-188bp；
a19)D12S391-P的扩增产物呈红颜色且大小为198-250bp；
a20)Penta D-P的扩增产物呈红颜色且大小为334-384bp；
a21)D1S1656-P的扩增产物呈红颜色且大小为255-302bp；
M2)对扩增产物进行STR分型，如果扩增产物的STR分型符合人类样本中下述p2)的全部人类基因座的分型，待测样本为人类样本；如果扩增产物的STR分型不符合人类样本中下述p2)的全部人类基因座的分型，则待测样本非人类样本；
p2)Amelogenin、D5S818、D21S11、D7S820、CSF1PO、D2S1338、D3S1358、vWA、D8S1179、D16S539、Penta E、TPOX、TH01、D19S433、D18S51、FGA、D6S1043、D13S317、D12S391、PentaD和D1S1656。
利用AB公司9700型PCR仪、3500测序仪以及IDX分析软件对ladder1与成套试剂A的扩增产物进行分析与分型，ladder1的分型结果如图1所示(图1中15和16.3两个峰间的峰为16的峰)，9947A的各基因座位点的STR分型结果如图2所示。结果显示，与图1中ladder1的各位点的分型相比，9947A的各基因座位点中，Amel-P得到的95.6bp的基因片段分型为X，D5S818-P得到的127.2bp的基因片段分型为11，D21S11-P得到的198.6bp的基因片段分型为30，D7S820-P得到的257.7bp,261.8bp的基因片段分型为10和11，CSF1PO-P得到的304.5bp,312.5bp的基因片段分型为10和12，D2S1338-P得到的354.3bp,369.9bp的基因片段分型为19和23，D3S1358-P得到的102.3bp,106.3bp的基因片段分型为14和15，vWA-P得到的166.5bp,170.5bp的基因片段分型为17和18，D8S1179-P得到的222.7bp的基因片段分型为13，D16S539-P得到的279bp,283bp的基因片段分型为11和12，Penta E-P得到的338.5bp,343.5bp的基因片段分型为12和13，TPOX-P得到的94.5bp的基因片段分型为8，TH01-P得到的145bp,152bp的基因片段分型为8和9.3，D19S433-P得到的215bp,219bp的基因片段分型为14和15，D18S51-P得到的265bp,281bp的基因片段分型为15和19，FGA-P得到的358bp,362bp的基因片段分型为23和24，D6S1043-P得到的106bp,130bp的基因片段分型为12和18，D13S317-P得到的176.5bp的基因片段分型为11，D12S391-P得到的216bp,224bp的基因片段分型为18和20，Penta D-P得到的364bp的基因片段分型为12，D1S1656-P得到的294bp的基因片段分型为18.3。9947A的各位点的STR分型结果均符合ladder1的分型。
因此，利用成套试剂A检测9947A可以确定该细胞为人类细胞，由于Amel-P中仅有X分型，表明该细胞为人类女性细胞，该结果与其实际情况一致。而利用成套试剂A对猴、牛、猪的样本进行检验时，均无扩增产物出现(图3，图3中从上至下依次为猴、牛和猪的样本)，说明成套试剂A在检验人类样本时各位点均会出现扩增产物，而检测非人源样本时则无扩增产物，表明成套试剂A的种族特异性较好，能用于人类STR检验。
二、实施例1的成套试剂B
供试样本：代表人类样本的细胞标准品9948(男性)以及猴、牛、猪三类常见的动物物种的血液；利用无菌水作为阴性对照。
检测方法：提取各样本的基因组DNA，向基因组DNA中加入成套试剂B及步骤一的扩增缓冲液混合均匀，将配置好的反应体系置于PCR仪中进行PCR扩增。
10μl反应体系中含有4.5μl成套试剂B的溶液，4.5μL扩增缓冲液以及1μl基因组DNA。该反应体系中，成套试剂B中所有引物的总浓度为12.94μmol/L(即各引物在反应体系中的浓度之和)Amel-P、D5S818-P、D21S11-P、D7S820-P、CSF1PO-P、D2S1338-P、D3S1358-P、vWA-P、D8S1179-P、D16S539-P、Penta E-P、TPOX-P、TH01-P、D19S433-P、D18S51-P、FGA-P、D6S1043-P、D13S317-P、D12S391-P、Penta D-P和DYS448-P的两条引物的浓度分别为0.25与0.25μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.25与0.25μmol/L、0.38与0.38μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.25与0.25μmol/L、0.25与0.25μmol/L、0.25与0.25μmol/L、0.38与0.38μmol/L、0.38与0.38μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.28与0.28μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.34与0.34μmol/L、0.38与0.38μmol/L、0.25与0.25μmol/L、0.31与0.31μmol/L、0.38与0.38μmol/L、0.28与0.28μmol/L。
扩增流程为：95℃变性10分钟，之后运行28个循环的(94℃30秒，59℃2分钟，72℃1分钟)，接着60℃延伸60分钟，最终4℃保温。
检测时使用AB公司的3130、3500系列测序仪或公安部第一研究所的GA118测序仪，采用G5通道，具体检测流程依据相关仪器36cm毛细管5色通道检测方法进行。
采用包含DYS448位点的ladder(记为ladder2)确定各扩增产物大小。其中ladder2包括各位点(Amel，D5S818，D21S11，D7S820，CSF1PO，D2S1338，D3S1358，vWA，D8S1179，D16S539，Penta E，TPOX，TH01，D19S433，D18S51，FGA，D6S1043，D13S317，D12S391，DYS448，Penta D)在人群中的常见分型。其中Amel，D5S818，D21S11，D7S820，CSF1PO，D2S1338，D3S1358，vWA，D8S1179，D16S539，Penta E，TPOX，TH01，D19S433，D18S51，FGA，D6S1043，D13S317，D12S391，DYS448，Penta D的分型同步骤一，DYS448包括15-24共计10个分型，分别记为15、16、17、18、19、20、21、22、23和24(其中15大小为266bp，后面依次增大6bp)，图4。
各位点的各个分型的序列见STRBase数据库，网址为：http://www.cstl.nist.gov/strbase/。Amel，D5S818，D21S11，D7S820，CSF1PO，D2S1338的各分型均由FAM标记，D3S1358，vWA，D8S1179，D16S539，Penta E的各分型均由HEX标记，TPOX，TH01，D19S433，D18S51，FGA的各分型均由TAMRA标记，D6S1043，D13S317，D12S391，DYS448和PentaD的各分型均由ROX标记。
在检测待测样本时，根据下述N1)或N2)确定待测样本是否为人类样本：
N1)如果成套试剂B的扩增产物符合如下b1)-b21)的全部标准，则待测样本为人类样本；如果成套试剂B的扩增产物不符合如下b1)-b21)的全部标准，则待测样本非人类样本。该标准具体如下：
b1)Amel-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为93bp-108bp；
b2)D5S818-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为114-150bp；
b3)D21S11-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为186-230bp；
b4)D7S820-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为248-276bp；
b5)CSF1PO-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为288.5-324.5bp；
b6)D2S1338-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为341-393bp；
b7)D3S1358-P的扩增产物呈绿颜色且大小为99-131bp；
b8)vWA-P的扩增产物呈绿颜色且大小为145-177bp；
b9)D8S1179-P的扩增产物呈绿颜色且大小为203-247bp；
b10)D16S539-P的扩增产物呈绿颜色且大小为259-299bp；
b11)Penta E-P的扩增产物呈绿颜色且大小为305-381bp；
b12)TPOX-P的扩增产物呈黑颜色且大小为80-108bp；
b13)TH01-P的扩增产物呈黑颜色且大小为129-168bp；
b14)D19S433-P的扩增产物呈黑颜色且大小为180-232bp；
b15)D18S51-P的扩增产物呈黑颜色且大小为245-309bp；
b16)FGA-P的扩增产物呈黑颜色且大小为333-385bp；
b17)D6S1043-P的扩增产物呈红颜色且大小为89-140bp；
b18)D13S317-P的扩增产物呈红颜色且大小为164-188bp；
b19)D12S391-P的扩增产物呈红颜色且大小为198-250bp；
b20)Penta D-P的扩增产物呈红颜色且大小为334-384bp；
b21)DYS448-P的扩增产物呈红颜色且大小为266-320bp；
N2)对扩增产物进行STR分型，如果扩增产物的STR分型符合人类样本中下述p3)的全部人类基因座的分型，待测样本为人类样本；如果扩增产物的STR分型不符合人类样本中下述p3)的全部人类基因座的分型，则待测样本非人类样本；
p3)Amelogenin、D5S818、D21S11、D7S820、CSF1PO、D2S1338、D3S1358、vWA、D8S1179、D16S539、Penta E、TPOX、TH01、D19S433、D18S51、FGA、D6S1043、D13S317、D12S391、Penta D和DYS448。
利用AB公司9700型PCR仪、3500测序仪以及IDX分析软件对ladder2与成套试剂B的扩增产物进行分析与分型，ladder2的分型结果如图4所示，9948的各基因座位点的STR分型结果如图5所示。结果显示，与图4中ladder1的各位点的分型相比，9948的各基因座位点中，Amel-P得到的96bp，102bp的基因片段分型为X和Y，D5S818-P得到的127bp,135bp的基因片段分型为11和13，D21S11-P得到的194.5bp,198.5bp的基因片段分型为29和30，D7S820-P得到的262bp的基因片段分型为11，CSF1PO-P得到的304bp,308bp的基因片段分型为10和11，D2S1338-P得到的370bp的基因片段分型为23，D3S1358-P得到的106bp,114bp的基因片段分型为15和17，vWA-P得到的166bp的基因片段分型为17，D8S1179-P得到的218bp,222bp的基因片段分型为12和13，D16S539-P得到的278bp的基因片段分型为11，Penta E-P得到的333bp的基因片段分型为11，TPOX-P得到的92bp,96bp的基因片段分型为8和9，TH01-P得到的135bp和150bp的基因片段分型为6和9.3，D19S433-P得到的208bp,212bp的基因片段分型为13和14，D18S51-P得到的264bp,276bp的基因片段分型为15和18，FGA-P得到的361bp,369bp的基因片段分型为24和26，D6S1043-P得到的104bp的基因片段分型为12，D13S317-P得到的173bp的基因片段分型为11，D12S391-P得到的214bp,238bp的基因片段分型为18和24，Penta D-P得到的343bp,363bp的基因片段分型为8和12，DYS448-P得到的291bp的基因片段分型为19。9948的各位点的STR分型结果均符合ladder2的分型。
因此，利用成套试剂B检测9948可以确定该细胞为人类细胞，由于Amel-P中有X分型和Y分型，表明该细胞为人类男性细胞，该结果与其实际情况一致。而利用成套试剂B对猴、牛、猪的样本进行检验时，均无扩增产物出现，说明成套试剂B在检验人类样本时各位点均会出现扩增产物，而检测非人源样本时则无扩增产物，表明成套试剂B的种族特异性较好，能用于人类STR检验。
在利用成套试剂A和成套试剂B在检测待测样本时，不仅可以确定待测样本是否为人类样本，还可以根据其中的Amel-P进一步确定人类样本的性别特征，在待测样本为人类样本时，如Amel的扩增产物的分型仅为X型，待测样本为人类女性样本，如Amel的扩增产物的分型为X型和Y型，待测样本为人类男性样本。
图2和图5中，下面标注有方框的峰为有效峰，图1、2、4和5中方框中的数字代表分型，峰的高度代表产物的丰度，峰的颜色为荧光经激发后产生的颜色，其中，蓝色的峰代表经FAM标记的扩增产物，绿色的峰代表经HEX标记的扩增产物，黑色的峰代表经TAMRA标记的扩增产物，红色的峰代表经ROX标记的扩增产物(图1、2、4和图5中每幅图从上到下四行峰的颜色分别为蓝色、绿色、黑色和红色)。
步骤一和步骤二中，采用Typer500作为内标，其图谱如图6所示。
实施例3、用于检测人类样本的成套试剂的灵敏性
一、实施例1的成套试剂A
将实施例2步骤一中9947A的基因组DNA利用无菌水稀释，得到浓度分别为1ng/μL、0.5ng/μL、0.25ng/μL、0.125ng/μL、0.1ng/μL、0.05ng/μL的9947A基因组溶液。
按照实施例2步骤一的方法，利用实施例1的成套试剂A检测上述各9947A基因组溶液。
结果显示，9947A基因组溶液在DNA浓度为0.1ng/μL、0.125ng/μL、0.25ng/μL、0.5ng/μL和1ng/μL时，9947A的STR分型结果均包含全部位点的峰型，均与实施例2步骤一的结果一致。9947A基因组溶液在DNA浓度为0.05ng/μL时，9947A的STR分型结果部分产物峰无法标注，表明，利用实施例1的成套试剂A最低可检测到浓度为0.1ng/μL的人类样本基因组DNA溶液。
二、实施例1的成套试剂B
将实施例2步骤二中9948的基因组DNA利用无菌水稀释，得到浓度分别为1ng/μL、0.5ng/μL、0.25ng/μL、0.125ng/μL、0.1ng/μL、0.05ng/μL的9948基因组溶液。
按照实施例2步骤一的方法，利用实施例1的成套试剂B检测上述各9948基因组溶液。
结果显示，9948基因组溶液在DNA浓度为0.1ng/μL、0.125ng/μL、0.25ng/μL、0.5ng/μL和1ng/μL时，9948的STR分型结果均包含全部位点的峰型，均与实施例2步骤二的结果一致。9948基因组溶液在DNA浓度为0.05ng/μL时，9948的STR分型结果部分产物峰无法标注，表明，利用实施例1的成套试剂B最低可检测到浓度为0.1ng/μL的人类样本基因组DNA溶液。
实施例4、用于检测人类样本的成套试剂的成套试剂的检测血卡样本
利用实施例1的成套试剂A按照实施例2中的方法检测含有一人类男性志愿者血液样本的血卡样本。
结果(图7)显示，该志愿者的STR分型结果包含全部检测位点，满足实施例2的a1)-a21)的全部标准，且可确定该志愿者为男性，与实际样本一致，表明，实施例1的成套试剂A可用于血卡样本的检测。
利用实施例1的成套试剂B按照实施例2中的方法检测含有一人类男性志愿者血液样本的血卡样本。
结果显示，该志愿者的STR分型结果包含全部检测位点，满足实施例2的b1)-b21)的全部标准，且可确定该志愿者为男性，与实际样本一致，表明，实施例1的成套试剂B可用于血卡样本的检测。
实施例5、用于检测人类样本的成套试剂的检测案件样本
将在案发现场取到的一男性遗留烟头一枚，提取基因组DNA，利用实施例1的成套试剂A按照实施例2中的方法进行扩增并进行STR分型。
结果(图8)显示，成套试剂A的扩增产物的STR分型结果满足实施例2的a1)-a21)的全部标准，表明，该待测对象含有人类男性基因组DNA，说明，实施例1的成套试剂A可用于案件样本的检测，确定待测样本是否为人类样本及性别。
将在案发现场取到的人的女性毛发3根，提取基因组DNA，利用实施例1的成套试剂B按照实施例2中的方法进行扩增并进行STR分型。
结果显示，成套试剂B的扩增产物的STR分型结果满足实施例2的b1)-b21)的全部标准，表明，该待测对象含有人类基因组DNA，然后根据Amel的扩增产物的分型确定该待测样本为女性样本，说明，实施例1的成套试剂B可用于案件样本的检测，确定待测样本是否为人类样本及性别。
实施例6、实施例1的成套试剂A与成套试剂B的扩增条件的优化
一、浓度
按照实施例2中步骤一的方法，调整成套试剂A在反应体系中的浓度，成套试剂A的浓度设置包括：0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM和0.35μM，各浓度均以Amel-P的每条引物来计，其余引物的浓度均满足实施例1中成套试剂A中Amel-P与各引物间的比例关系。反应体系中其他物质的浓度及反应条件均不变，以9947A的基因组DNA为模板进行扩增并利用3500测序仪检测扩增结果。结果显示，在0.1μM-0.25μM内，随着成套试剂A的浓度的升高，扩增结果的均衡性更好，但是在高浓度状态(0.3μM-0.35μM)时，单纯的提升引物终浓度无法获得更好的扩增效果，此时Taq酶已经处于饱和状态，因此反应体系中最适宜的成套试剂A的浓度为0.25μM。
按照实施例2中步骤二的方法，调整成套试剂B在反应体系中的浓度，成套试剂B的浓度设置包括：0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM和0.35μM，各浓度均以Amel-P的每条引物来计，其余引物的浓度均满足实施例1中成套试剂B中Amel-P与各引物间的比例关系。反应体系中其他物质的浓度及反应条件均不变，以9948的基因组DNA为模板进行扩增并利用3500测序仪检测扩增结果。结果显示，在0.1μM-0.25μM内，随着成套试剂B的浓度的升高，扩增结果的均衡性更好，但是在高浓度状态(0.3μM-0.35μM)时，单纯的提升引物终浓度无法获得更好的扩增效果，此时Taq酶已经处于饱和状态，因此反应体系中最适宜的成套试剂B的浓度为0.25μM。
二、扩增循环数
按照实施例2中步骤一的方法，利用成套试剂A的反应体系，调整扩增循环数，以9947A的基因组DNA为模板进行扩增并利用3500测序仪测扩增结果，循环数的设置包括26、28、30和32。结果显示，当循环数为26时扩增产物量普遍较少，可能会出现部分位点丢带的现象，当循环数为28、30和32时，扩增产物的量已经达到较高的水平。当案件检材DNA模板量较低的情况下，可以使用高循环数，如30、32来增加扩增产物的量，从而保证检验效果。
按照实施例2中步骤二的方法，利用成套试剂B的反应体系，调整扩增循环数，以9948的基因组DNA为模板进行扩增并利用3500测序仪检测扩增结果，循环数的设置包括26、28、30和32。结果显示，当循环数为26时扩增产物量普遍较少，可能会出现部分位点丢带的现象，当循环数为28、30和32时，扩增产物的量已经达到较高的水平。当案件检材DNA模板量较低的情况下，可以使用高循环数，如30、32来增加扩增产物的量，从而保证检验效果。
三、退火温度
按照实施例2中步骤一的方法，利用成套试剂A的反应体系，调整退火温度，以9947A的基因组DNA为模板进行扩增并利用3500测序仪检测扩增结果，退火温度的设置包括55、56、57、58、59、60、61和62℃。结果显示，随着退火温度变化，扩增扩增效率逐渐提升，到59℃时达到最大效率，但是随着温度的进一步提高，扩增效率急剧下降，因此成套试剂A的最佳退火温度为59℃。
按照实施例2中步骤二的方法，利用成套试剂B的反应体系，调整退火温度，以9948的基因组DNA为模板进行扩增并利用3500测序仪检测扩增结果，退火温度的设置包括55、56、57、58、59、60、61和62℃。结果显示，随着退火温度变化，扩增扩增效率逐渐提升，到59℃时达到最大效率，但是随着温度的进一步提高，扩增效率急剧下降，因此成套试剂B的最佳退火温度为59℃。
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
gaaggtcgaa gctgaagtg 19
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
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ttagcctgtg gcgtgt 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gttcaagcct gtgttgctca ag 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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tgtcaaagag cttcttcgga ga 22
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
tcttccttaa tccgaatttc c 21

Claims (10)

1.成套试剂，由名称依次为Amel-P、D5S818-P、D21S11-P、D7S820-P、CSF1PO-P、D2S1338-P、D3S1358-P、vWA-P、D8S1179-P、D16S539-P、Penta E-P、TPOX-P、TH01-P、D19S433-P、D18S51-P、FGA-P、D6S1043-P、D13S317-P、D12S391-P和Penta D-P的引物对组成；
所述Amel-P由序列表中序列1和2所示的两条单链DNA组成；
所述D5S818-P由序列表中序列3和4所示的两条单链DNA组成；
所述D21S11-P由序列表中序列5和6所示的两条单链DNA组成；
所述D7S820-P由序列表中序列7和8所示的两条单链DNA组成；
所述CSF1PO-P由序列表中序列9和10所示的两条单链DNA组成；
所述D2S1338-P由序列表中序列11和12所示的两条单链DNA组成；
所述D3S1358-P由序列表中序列13和14所示的两条单链DNA组成；
所述vWA-P由序列表中序列15和16所示的两条单链DNA组成；
所述D8S1179-P由序列表中序列17和18所示的两条单链DNA组成；
所述D16S539-P由序列表中序列19和20所示的两条单链DNA组成；
所述Penta E-P由序列表中序列21和22所示的两条单链DNA组成；
所述TPOX-P由序列表中序列23和24所示的两条单链DNA组成；
所述TH01-P由序列表中序列25和26所示的两条单链DNA组成；
所述D19S433-P由序列表中序列27和28所示的两条单链DNA组成；
所述D18S51-P由序列表中序列29和30所示的两条单链DNA组成；
所述FGA-P由序列表中序列31和32所示的两条单链DNA组成；
所述D6S1043-P由序列表中序列33和34所示的两条单链DNA组成；
所述D13S317-P由序列表中序列35和36所示的两条单链DNA组成；
所述D12S391-P由序列表中序列37和38所示的两条单链DNA组成；
所述Penta D-P由序列表中序列39和40所示的两条单链DNA组成。
2.成套试剂，由权利要求1所述的成套试剂与名称为D1S1656-P的引物对组成，所述D1S1656-P由序列表中序列41和42所示的两条单链DNA组成。
3.成套试剂，由权利要求1所述的成套试剂与名称为DYS448-P的引物对组成，所述DYS448-P由序列表中序列43和44所示的两条单链DNA组成。
4.根据权利要求1-3中任一所述的成套试剂，其特征在于：每个引物对中均有一条引物由荧光物质标记。
5.根据权利要求4所述的成套试剂，其特征在于：所述荧光物质为FAM、HEX、TAMRA或ROX。
6.用于检测人类样本的系统，包括权利要求1-5中任一所述的成套试剂。
7.下述Ⅰ或Ⅱ的应用：
Ⅰ、权利要求1-5中任一所述成套试剂的下述任一应用：
X1、在制备检测或辅助检测人类样本试剂盒中的应用；
X2、在制备检测或辅助检测人类男性样本试剂盒中的应用；
X3、在制备检测或辅助检测人类女性样本试剂盒中的应用；
X4、在制备扩增人类基因座位点试剂盒中的应用；
X5、在检测或辅助检测人类样本中的应用；
X6、在检测或辅助检测人类男性样本中的应用；
X7、在检测或辅助检测人类女性样本中的应用；
X8、在扩增所述人类基因座位点中的应用；
Ⅱ、检测人类基因座位点的物质的下述任一应用；
Y1、在检测或辅助检测人类样本中的应用；
Y2、在检测或辅助检测人类男性样本中的应用；
Y3、在检测或辅助检测人类女性样本中的应用；
所述人类基因座位点为下述p1)、p2)或p3)：
p1)Amelogenin、D5S818、D21S11、D7S820、CSF1PO、D2S1338、D3S1358、vWA、D8S1179、D16S539、Penta E、TPOX、TH01、D19S433、D18S51、FGA、D6S1043、D13S317、D12S391和PentaD；
p2)Amelogenin、D5S818、D21S11、D7S820、CSF1PO、D2S1338、D3S1358、vWA、D8S1179、D16S539、Penta E、TPOX、TH01、D19S433、D18S51、FGA、D6S1043、D13S317、D12S391、Penta D和D1S1656；
p3)Amelogenin、D5S818、D21S11、D7S820、CSF1PO、D2S1338、D3S1358、vWA、D8S1179、D16S539、Penta E、TPOX、TH01、D19S433、D18S51、FGA、D6S1043、D13S317、D12S391、Penta D和DYS448。
8.检测或辅助检测人类样本的方法，包括：利用权利要求2或4或5所述成套试剂对待测样本的基因组DNA进行扩增，得到扩增产物，根据下述M1)或M2)确定待测样本是否为人类样本：
M1)如果所述扩增产物符合下述a1)-a21)的全部标准，则所述待测样本为或候选为人类样本；如果所述扩增产物不符合如下a1)-a21)的全部标准，则所述待测样本非或候选非人类样本：
a1)所述Amel-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为93-108bp；
a2)所述D5S818-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为114-150bp；
a3)所述D21S11-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为186-230bp；
a4)所述D7S820-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为248-276bp；
a5)所述CSF1PO-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为288.5-324.5bp；
a6)所述D2S1338-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为341-393bp；
a7)所述D3S1358-P的扩增产物呈绿颜色且大小为99-131bp；
a8)所述vWA-P的扩增产物呈绿颜色且大小为145-177bp；
a9)所述D8S1179-P的扩增产物呈绿颜色且大小为203-247bp；
a10)所述D16S539-P的扩增产物呈绿颜色且大小为259-299bp；
a11)所述Penta E-P的扩增产物呈绿颜色且大小为305-381bp；
a12)所述TPOX-P的扩增产物呈黑颜色且大小为80-108bp；
a13)所述TH01-P的扩增产物呈黑颜色且大小为129-168bp；
a14)所述D19S433-P的扩增产物呈黑颜色且大小为180-232bp；
a15)所述D18S51-P的扩增产物呈黑颜色且大小为245-309bp；
a16)所述FGA-P的扩增产物呈黑颜色且大小为333-385bp；
a17)所述D6S1043-P的扩增产物呈红颜色且大小为89-140bp；
a18)所述D13S317-P的扩增产物呈红颜色且大小为164-188bp；
a19)所述D12S391-P的扩增产物呈红颜色且大小为198-250bp；
a20)所述Penta D-P的扩增产物呈红颜色且大小为334-384bp；
a21)所述D1S1656-P的扩增产物呈红颜色且大小为255-302bp；
M2)对所述扩增产物进行STR分型，如果所述扩增产物的STR分型符合人类样本中下述p2)的全部人类基因座的分型，所述待测样本为或候选为人类样本；如果所述扩增产物的STR分型不符合人类样本中下述p2)的全部人类基因座的分型，则所述待测样本非或候选非人类样本；
p2)Amelogenin、D5S818、D21S11、D7S820、CSF1PO、D2S1338、D3S1358、vWA、D8S1179、D16S539、Penta E、TPOX、TH01、D19S433、D18S51、FGA、D6S1043、D13S317、D12S391、Penta D和D1S1656。
9.检测或辅助检测人类样本的方法，包括：利用权利要求3-5中任一所述成套试剂对待测样本的基因组DNA进行扩增，得到扩增产物，根据下述N1)或N2)确定待测样本是否为人类样本：
N1)如果所述扩增产物符合下述b1)-b21)的全部标准，则所述待测样本为或候选为人类样本；如果所述扩增产物不符合如下b1)-b21)的全部标准，则所述待测样本非或候选非人类样本：
b1)所述Amel-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为93-108bp；
b2)所述D5S818-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为114-150bp；
b3)所述D21S11-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为186-230bp；
b4)所述D7S820-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为248-276bp；
b5)所述CSF1PO-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为288.5-324.5bp；
b6)所述D2S1338-P的扩增产物呈蓝颜色且大小为341-393bp；
b7)所述D3S1358-P的扩增产物呈绿颜色且大小为99-131bp；
b8)所述vWA-P的扩增产物呈绿颜色且大小为145-177bp；
b9)所述D8S1179-P的扩增产物呈绿颜色且大小为203-247bp；
b10)所述D16S539-P的扩增产物呈绿颜色且大小为259-299bp；
b11)所述Penta E-P的扩增产物呈绿颜色且大小为305-381bp；
b12)所述TPOX-P的扩增产物呈黑颜色且大小为80-108bp；
b13)所述TH01-P的扩增产物呈黑颜色且大小为129-168bp；
b14)所述D19S433-P的扩增产物呈黑颜色且大小为180-232bp；
b15)所述D18S51-P的扩增产物呈黑颜色且大小为245-309bp；
b16)所述FGA-P的扩增产物呈黑颜色且大小为333-385bp；
b17)所述D6S1043-P的扩增产物呈红颜色且大小为89-140bp；
b18)所述D13S317-P的扩增产物呈红颜色且大小为164-188bp；
b19)所述D12S391-P的扩增产物呈红颜色且大小为198-250bp；
b20)所述Penta D-P的扩增产物呈红颜色且大小为334-384bp；
b21)所述DYS448-P的扩增产物呈红颜色且大小为266-320bp；
N2)对所述扩增产物进行STR分型，如果所述扩增产物的STR分型符合人类样本中下述p3)的全部人类基因座的分型，所述待测样本为或候选为人类样本；如果所述扩增产物的STR分型不符合人类样本中下述p3)的全部人类基因座的分型，则所述待测样本非或候选非人类样本；
p3)Amelogenin、D5S818、D21S11、D7S820、CSF1PO、D2S1338、D3S1358、vWA、D8S1179、D16S539、Penta E、TPOX、TH01、D19S433、D18S51、FGA、D6S1043、D13S317、D12S391、Penta D和DYS448。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在与：在所述待测样本为或候选为人类样本时，根据所述Amel-P的扩增产物进一步确定待测样本为女性样本还是男性样本。
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