CN111944889B - 检测染色体非整倍体数目异常的pcr扩增组合物及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测染色体非整倍体数目异常的PCR扩增组合物及检测试剂盒，本发明的组合物能同时对16和22号染色体上19个STR位点进行复合扩增；本发明开发的人染色体数目异常的检测试剂盒，具体为针对产前诊断和自然流产分析的常见数目异常的染色体，即16和22号染色体，应用定量荧光PCR结合毛细管电泳技术，开发出适用中国人群的STR基因分析的一种自动化，高通量，低成本的快速检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，多重荧光PCR技术结合毛细管电泳法对特异性STR位点实现对常见的16和22号染色体数目异常进行检测。
背景技术
自然流产是妊娠常见并发症，导致自然流产的原因较多，如遗传、免疫、内分泌异常、感染、解剖异常、环境等因素。50％以上的早期自然流产是由于胚胎染色体异常造成的，其中染色体数目异常占96％，结构异常仅3％左右，常染色体三体和性染色体单体占胚胎染色体异常86％以上。染色体异常中，以16、22、21、13和18三体多见，其次为X单体、多倍体和镶嵌体。分析绒毛染色体核型可找到半数以上自然流产原因，避免孕妇不必要的检查和治疗，同时有效地提供生育指导。
细胞遗传学染色体核型分析是目前产前诊断的金标准，通过妊娠不同时期采取绒毛、羊水及胎儿血细胞为标本，制备染色体核型进行分析。然而，染色体核型分析存在细胞培养周期时间长，有培养失败的风险。
荧光原位杂交(FISH)不需细胞培养，利用已知核酸序列作为探针，以荧光素直接标记或以非放射性物质标记后与靶DNA进行杂交。再通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物，最后在荧光显微镜下观察杂交信号从而对标本中待测核酸进行定性、定位和定量分析。该方法成本较高，周期长，对操作人员要求较高的特点，同时结果为图片，需要人工判读或干预，难以实现自动化和高通量分析。
QF-PCR技术是通过荧光引物对样本DNA的不同区域进行PCR扩增，采用毛细管电泳对扩增片段进行分离，通过荧光检测系统确定扩增片段的长度并实现对多态性位点的分型，通过对扫描软件对预期大小的扩增产物对应等面积定量，实验对原始模板的定量。
目前，针对人类染色体16和22号染色体异常的临床检测，专利CN 201810732477主要针对4、13、15、16、18、21、22、X和Y染色体数目异常检测检测，但是所检测STR位点较少。
发明内容：
本发明的目的是提供检测染色体非整倍体数目异常的PCR扩增组合物，能同时对16和22号染色体STR位点进行复合扩增，对16和22号染色体非整倍体数目异常进行检测。
本发明的另一个目的在于提供一种染色体非整倍体数目异常的检测试剂盒，该试剂盒利用多重定量荧光PCR扩增体系，可实现对样品稳定、准确的检测。
检测染色体非整倍体数目异常的PCR扩增组合物，其特征在于：包括19对特异引物，能同时扩增19个来自16号和22号染色体特异性STR位点，所述位点及其引物对序列如下表：
其中被扩增的19个位点分别由四种颜色的荧光标记组成，相同的荧光标记视为同一组，四组组合分别为：D16S3391、D16S771、D16S2640、D16S2624、D16S537为第一组；D16S768、D16S3253、D16S539、D16S753、D16S3255、D16S767为第二组；D22-GATA198B05、D22S534、D22S685、D22S689为第三组；D22_3、D22_2、D22_4、D22S445为第四组。
所述第一组采用FAM标记，第二组采用HEX标记，第三组采用TAMRA标记，第四组采用ROX标记，所述荧光标记位于特异性引物对中其中一条引物的5’端。
染色体非整倍体数目异常检测试剂盒，包括上述扩增组合物。
所述位点扩增的引物对浓度为：
所述试剂盒中还包括：PCR反应液、引物混合液、酶混合液和无核酸酶纯水。
所述试剂盒中还包含16三体阳性质控品和阴性质控品。
其中检测样本来自供体的羊水、绒毛、组织或血液。
本发明选取19个16和22号染色体STR位点，对16和22号染色体非整倍体数目异常进行检测，所选取的位点经过群体数据筛选，具有高度多态性和遗传稳定性，适用于染色体数目异常检测。
本发明开发出人染色体数目异常的检测试剂盒，具体为针对产前诊断和自然流产分析的常见数目异常的染色体，即16和22号染色体，应用定量荧光PCR结合毛细管电泳技术，开发出适用中国人群的STR基因分析的一种自动化，高通量，低成本的快速检测试剂盒。
本发明的优势在于：
1.检测周期短，获得样本后6个小时可获得结果，采用羊水/绒毛/组织/血液样本基因组DNA提取后进行PCR扩增，扩增加检测时间共计6小时，能够在12-24个小时内出具报告。
2.灵敏度高，每次检测只需纳克级别DNA，因此需要的样本量少。
3.可清晰判断样本污染情况，体系中位点多态性高，可以指示样本是否来源于同一个体，避免母血污染的问题。
(一)STR位点的确定
本发明共调查了42个16和22号染色体上STR位点在人群中的遗传多态性，最后确定了多个具有高度遗传多态性的STR位点，包括D16S3391、D16S771、D16S2640、D16S2624、D16S537、D16S768、D16S3253、D16S539、D16S753、D16S3255、D16S767、D22-GATA198B05、D22S534、D22S685、D22S689、D22_3、D22_2、D22_4、D22S445共19个位点。
(二)四色荧光标记的确定
本发明采用了四色荧光标记技术，将上述19个位点分成四组，D16S3391、D16S771、D16S2640、D16S2624、D16S537用FAM标记；D16S768、D16S3253、D16S539、D16S753、D16S3255、D16S767用HEX标记；D22-GATA198B05、D22S534、D22S685、D22S689用TAMRA标记；D22_3、D22_2、D22_4、D22S445用ROX标记。
本发明进一步提供了19个16和22号染色体STR位点的特异性寡核苷酸扩增引物对：D16S3391、D16S771、D16S2640、D16S2624、D16S537、D16S768、D16S3253、D16S539、D16S753、D16S3255、D16S767、D22-GATA198B05、D22S534、D22S685、D22S689、D22_3、D22_2、D22_4、D22S445。
(三)19个位点染色体定位、核心重复序列见下表：
| 位点 | 染色体定位 | 核心重复序列 |
| D16S3391 | 16q12.1 | TCTA |
| D16S771 | 16q12.2 | AAGG |
| D16S2640 | 16p13.13 | ATCT |
| D16S2624 | 16q22.2 | ATCT |
| D16S537 | 16p12.1 | TTCC |
| D16S768 | 16p13.2 | TATC |
| D16S3253 | 16q12.2 | TAGA |
| D16S539 | 16q24.1 | GATA |
| D16S753 | 16p11.2 | CCTT |
| D16S3255 | 16q12.2 | ATCC |
| D16S767 | 16q21 | TATC |
| D22-GATA198B05 | 22q11.1 | TCTA |
| D22S534 | 22q13.1 | ATAC |
| D22S685 | 22q12.3 | TATC |
| D22S689 | 22q12.1 | TAGA |
| D22_3 | 22q11.21 | CCTT |
| D22_2 | 22q11.21 | AAAT |
| D22_4 | 22q11.21 | TTCT |
| D22S445 | 22q12.3 | ATGG |
扩增相应STR位点的引物对有特定的序列，这些引物在扩增体系中有一定的浓度，所述各个引物浓度见下表。
本发明的有益效果和优点：
本发明所提供的D16S3391、D16S771、D16S2640、D16S2624、D16S537、D16S768、D16S3253、D16S539、D16S753、D16S3255、D16S767、D22-GATA198B05、D22S534、D22S685、D22S689、D22_3、D22_2、D22_4、D22S445这19个位点包含16和22号染色体上特异性STR位点，保障16和22号染色体数目异常检测的准确性。本发明采用四色荧光技术。
兼容性好，包含19个特异性STR位点D16S3391、D16S771、D16S2640、D16S2624、D16S537、D16S768、D16S3253、D16S539、D16S753、D16S3255、D16S767、D22-GATA198B05、D22S534、D22S685、D22S689、D22_3、D22_2、D22_4、D22S445，包含16和22号染色体上特异性STR位点，具有高杂合度。
快速高效，24-48h完成扩增。
本发明的优势：
(1)高效分析人16和22号染色体数目异常情况，将染色体特异性STR位点进行防污染多重荧光PCR扩增，应用毛细管电泳技术进行扩增片段的分析。
(2)特异性强
应用该体系对16和22号染色体外染色体数目异常检测，均未检测出相应的染色体16和22号染色体数目异常。
(3)母血污染样本的检测
将两个DNA模板按比例混合，当比例为5％时可检测出存在外源DNA污染，可有效判断检测样本中是否存在母亲血液细胞的污染。
附图说明
图1正常人检测结果
图2 16三体综合征检测结果
图3 22三体综合征检测结果
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1本实施例优选具有汉族人群多态性STR位点
本发明的试剂盒针对中国人群进行开发，通过下述的实施步骤筛选获得具有中国汉族人群多态性STR位点，并对STR位点进行引物设计、优化引物。
1.STR位点初筛
选择中国知网以及NCBI等文献库中得到的16和22号染色体的STR基因座，在NCBI中查找STR位点的核苷酸序列，利用Primer Premier 5软件进行引物设计。通过以下原则进行筛选获得备选STR位点：同一染色体STR位点尽量分布在整条染色体；STR位点为4碱基重复及以上。
2.汉族人群STR位点的杂合度分析
初筛获得的STR位点，通过正常汉族人群样本进行杂合度实验，筛选出杂合度较高的STR位点，STR位点杂合度尽量保证大于0.7。
| STR位点 | 杂合度 | STR位点 | 杂合度 |
| D16S3391 | 0.78 | D22S534 | 0.71 |
| D16S771 | 0.70 | D22S417 | 0.83 |
| D16S2640 | 0.72 | D22S685 | 0.85 |
| D16S2624 | 0.75 | D22S686 | 0.71 |
| D16S537 | 0.83 | D22S689 | 0.83 |
| D16S768 | 0.74 | D22S533 | 0.75 |
| D16S3253 | 0.70 | D22S1045 | 0.76 |
| D16S539 | 0.79 | D22_3 | 0.73 |
| D16S753 | 0.74 | D22_2 | 0.76 |
| D16S3255 | 0.71 | D22_4 | 0.79 |
| D16S767 | 0.74 | D22S445 | 0.70 |
| D22-GATA198B05 | 0.84 |
3.STR位点引物设计
在STR位点上下游设计引物序列，单对引物进行扩增实验，确保不会引起非特异扩增后，进行引物复合扩增，调整引物位置，排除非特异性峰、加A不完全峰、复制滑脱峰等，对最终的引物组进行多重体系优化。
实施例2本发明的检测试剂盒具体使用方法
1.DNA提取
采用基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，操作步骤依照试剂盒说明书，DNA提取完毕后用紫外分光光度计进行定量，并稀释成2-10ng/μl
2.多重PCR扩增
2.1按照下表进行PCR反应体系配制，涡旋振荡混匀后短暂离心，使液体聚集在管底
2.2PCR反应条件：
2.3在PCR反应中，必须有一个16三体阳性质控品，1个阴性质控品和1个无核酸酶纯水阴性对照。
2.4毛细管电泳检测
在检测前，对产物进行变性处理并与分子量内标混合，1μl产物+0.5μl分子量内标+8.5μl的HIDI(去离子甲酰胺)，混匀后短暂离心，95℃变性5min后立即冰浴10min，用ABI系列遗传分析仪进行电泳检测。
2.5质控标准
(1)无核酸酶纯水检测结果为无PCR产物扩增
(2)16三体阳性质控品检测结果为16三体阳性，STR阴性质控品检测结果16和22号染色体STR与正常人一致。
以上(1)和(2)同时满足时，表示PCR扩增成功，否则需要重新实验
3.结果分析
毛细管电泳得到的数据，使用GeneMapper软件进行数据分析，由于扩增引物标记了荧光，可以通过峰面积表示扩增产物量的多少，通过STR位点出峰个数，峰面积比值判断样本是否存在16和22号染色体数目异常。参照ACC/CMGS年会(2012)关于应该QF-PCR方法诊断非整倍体染色体病的实验指南，规定判断标准如下：正常位点(表现为双峰，峰面积比值在0.8-1.4之间)；异常位点(表现为三峰，峰面积比值接近于1:1:1，或表现为双峰，峰面积比值在0.45-0.65或1.8-2.4之间)；无效位点(峰面积比值介于正常位点和异常位点区间之外)。
3.1正常结果判定：
至少两个STR位点为正常位点(表现为双峰，峰面积比值在0.8-1.4之间)，其余位点为无效位点。
3.2 16和22号染色体非整倍体结果判定：
染色体上STR位点，至少两个位点表现为异常位点(表现为三峰，峰面积比值接近于1:1:1，或表现为双峰，峰面积比值在0.45-0.65或1.8-2.4之间)，其余位点为无效位点。
实施例3本实施例应用本试剂盒检测正常人样本
来自供体的羊水、绒毛、组织或血液样本，按照血液细胞组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取纯化。每个样本DNA溶液浓度用1×TE缓冲液调整到2-10ng/μL，按照试剂盒说明书进行扩增反应及产物分析。本试剂盒同时扩增16号D16S3391、D16S771、D16S2640、D16S2624、D16S537、D16S768、D16S3253、D16S539、D16S753、D16S3255、D16S767位点，22号染色体的D22-GATA198B05、D22S534、D22S685、D22S689、D22_3、D22_2、D22_4、D22S445位点。上样结果的分析图谱如图1(正常人)所示，16号染色体上STR位点D16S3391、D16S2640、D16S537、D16S768、D16S3253、D16S539、D16S753、D16S3255、D16S767，22号染色体上STR位点D22-GATA198B05、D22S534、D22S685、D22S689、D22_3、D22_2、D22_4均显示双峰，峰面积比值在0.8-1.4之间，符合正常结果判定。说明本试剂盒可根据所选择的STR位点对16和22号染色体非整倍体的情况进行判定。
实施例4本实施例应用本试剂盒检测16号三体或22号三体样本
来自供体的羊水、绒毛、组织或血液样本，按照血液细胞组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取纯化。每个样本DNA溶液浓度用1×TE缓冲液调整到2-10ng/μL，按照试剂盒说明书进行扩增反应及产物分析。本试剂盒同时扩增16号D16S3391、D16S771、D16S2640、D16S2624、D16S537、D16S768、D16S3253、D16S539、D16S753、D16S3255、D16S767位点，22号染色体的D22-GATA198B05、D22S534、D22S685、D22S689、D22_3、D22_2、D22_4、D22S445位点。上样结果的分析图谱如图2(16三体)所示，D16S3391、D16S2624、D16S537、D16S3253、D16S753有明显的三峰，D16S771、D16S768、D16S539、D16S3255、D16S767峰面积比值在0.45-0.65或1.8-2.4之间，说明该样本为16三体；如图3(22三体)所示，D22-GATA198B05、D22S689、D22S445有明显的三峰，D22S685、D22_2峰面积比值在0.45-0.65或1.8-2.4之间，说明该样本为22三体。通过上述阳性样本的检测，说明本试剂盒可有效检出16和22号染色体的染色体数目异常。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变性和改进，这些都是本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 北京阅微基因技术有限公司
<120> 检测染色体非整倍体数目异常的PCR扩增组合物及检测试剂盒
<141> 2020-08-06
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgaacttac caagcctcca c 21
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaggcaatta ctcttaggac agtat 25
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagtagatca gtcatcttgc tgc 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtccaaaaca ccaccctcta 20
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtcattgtca ttggtttatt acctg 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gagctttaac aacatagcaa gacct 25
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaaagtgaat cttccaggcc ta 22
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtatggtttg agtgaggaaa ttaag 25
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aggttccagg tccatcacct 20
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gctgtacact taggatttag gcac 24
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggctcctgtt ggttccatat 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggttgggagg atatgacgta 20
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggtaaaaagg tatgcatata catctc 26
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gttatagttt cttgagtatc cttctaga 28
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgctcgttgt gcacaaatct a 21
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gatctgtaag catgtatcta tcatcc 26
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaaaacaact ccgtccactt g 21
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gacagtgagc tatgatttca cctgt 25
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gtctgcagta taggtatgtg ttcat 25
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcatctggct catagcagtt 20
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gttgactcaa actgaattac accac 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gcatgaaaat cttaataggc tggtt 25
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ccataatcac gtggagccaa t 21
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gacagaacct atagcatgca ggt 23
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gacagggcaa gactccataa t 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ggagttcaga tcttcccaag a 21
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ggttgagttt gatgtttttg agag 24
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gttttggaga attcttcctg ga 22
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ggttgattgt ggtgggatgc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gatctcaatc tgcctgcctg 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tatgttgtgg gggtgcagtt 20
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cctatttcaa aaacgaaaaa ggaagg 26
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
agtctgtgtg acagagtgac agc 23
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gagtggaatc tgacctcctc at 22
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
atcctgctcc attccaggtc 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ttatctgccc tgtcaccaag 20
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ggtgaatgga aaatggactg at 22
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gttaggtctt gggacctgca c 21
Claims (8)
1.检测染色体非整倍体数目异常的PCR扩增组合物，其特征在于：包括19对特异引物，能同时扩增19个来自16号和22号染色体特异性STR位点，所述位点及其引物对序列如下表：
2.根据权利要求1所述的PCR扩增组合物，其中被扩增的19个位点分别由四种颜色的荧光标记组成，相同的荧光标记视为同一组，四组组合分别为：D16S3391、D16S771、D16S2640、D16S2624、D16S537为第一组；D16S768、D16S3253、D16S539、D16S753、D16S3255、D16S767为第二组；D22-GATA198B05、D22S534、D22S685、D22S689为第三组；D22_3、D22_2、D22_4、D22S445为第四组。
3.根据权利要求2所述的PCR扩增组合物，所述第一组采用FAM标记，第二组采用HEX标记，第三组采用TAMRA标记，第四组采用ROX标记，所述荧光标记位于特异性引物对中其中一条引物的5’端。
4.染色体非整倍体数目异常检测试剂盒，包括权利要求1-3任一所述的PCR扩增组合物。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其中各位点引物对浓度为：
6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，还包括：PCR反应液、引物混合液、酶混合液和无核酸酶纯水。
7.根据权利要求4所述的检测试剂盒，所述试剂盒中还包含16三体阳性质控品和阴性质控品。
8.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其中检测样本来自供体的羊水、绒毛、组织或血液。
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Non-Patent Citations (2)
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Denomination of invention: PCR amplification composition and detection kit for detecting abnormal number of chromosomal aneuploidy Granted publication date: 20220506 Pledgee: Zhongguancun Branch of Bank of Beijing Co.,Ltd. Pledgor: Beijing Yuewei Gene Technology Co.,Ltd. Registration number: Y2024110000027 |