CN118006748A - 用于检测hla-a*1101等位基因的特异性引物探针组合、试剂盒及其应用 - Google Patents
用于检测hla-a*1101等位基因的特异性引物探针组合、试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于检测HLA‑A*1101等位基因的特异性引物探针组合、试剂盒及其相关应用。具体的，本发明提供的特异性检测HLA‑A*1101等位基因引物探针组合物，包括引物对1101A‑F/R(如SEQ ID NO:1和2所示)、引物对1101B‑F/R(如SEQ ID NO:3和4所示)、探针1101A‑P(如SEQ ID NO:5所示)、探针1101B‑P(如SEQ ID NO:6所示)。进一步的，本发明还提供了基于上述特异性引物探针组合的试剂盒以及HLA‑A*1101等位基因的检测方法。本发明通过调整、优化获得的引物的特异性强，其与其他高度同源A11等位基因也可以完全区分开，能大大减少交叉反应，达到较高的特异性，可用于HLA‑A*1101等位基因的快速定性检测。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种用于检测HLA-A*1101等位基因的特异性引物探针组合、试剂盒及其相关应用。
背景技术
人类白细胞抗原(Human leukocyte antigens，HLA)是人类组织相容性复合体的表达产物，广泛表达于各组织有核细胞表面，在免疫系统中主要负责细胞间的相互识别和诱导免疫反应，调节免疫应答。已观察到A11与家族性耳硬化症肺结核、麻风病、以及巨细胞病毒感染与癫痫之间的关联。这些和其他研究表明A11与某些疱疹病毒感染的继发效应有关。A11还被发现增加声门上癌的发生率，且3年生存率较差。在骨肉瘤中，A11被发现升高。抗抑郁药诱发的肝炎与HLA-A11之间存在密切关联。在自身免疫性肝炎中，A11具有协同作用，与DR4和DR3共同作用，使患病几率增加至300以上。A11也是单倍型A11-Cw4-B35-DR1-DQ1的一部分，这是HIV快速进展的第二个因素。HLA-A11是HLA-A“A”血清型组中的人类白细胞抗原血清型。血清型是通过抗体识别HLA-Aα链的α11子集来确定的。对于A11，α“A”链由HLA-A*11等位基因组编码，β链由B2M基因座编码。该组目前由A*1101主导。
由于人类白细胞抗原的Ⅰ类分子有HLA-A、-B、-C等系列抗原，而A基因座位上也同样存在众多与HLA-A*1101等位基因同源性极高的等位基因，各等位基因与HLA-A*1101等位基因容易发生交叉反应。因此，在检测HLA-A*1101时对特异性要求较高，难以简单通过引物设计软件得到针对HLA-A*1101的特异性引物和探针组合。目前，国内外报道的HLA-A基因座的检测方法有聚合酶链式反应-序列特异性寡核苷酸探针法(PCR-SSO)、聚合酶链式反应-序列特异性引物法(PCR-SSP)、聚合酶链式反应-限制性长度多态性(PCR-RFLP)、基因测序法、荧光PCR熔解曲线法等。上述等方法过程繁琐，操作复杂，并且耗时长。目前很少有用于检测HLA-A*1101等位基因的方法的报道，现有技术中也并无快速简便可靠的HLA-A*1101基因突变检测方法。
发明内容
第一方面，本发明提供了一套基于荧光PCR定性检测HLA-A*1101等位基因的特异性引物探针组合，通过这套特异性引物探针组合可简单快捷且准确的完成HLA-A*1101等位基因的检测。
在本发明的一种具体实施方式中，上述特异性检测HLA-A*1101等位基因引物探针组合物，包括引物对1101A-F/R、引物1101B-F/R、探针1101A-P和探针1101B-P。其中，各引物探针的核苷酸序列分别为：
引物1101A-F：5’-AGGAGACACGGAATGTGAA-3’(SEQ ID NO:1)；
引物1101A-R：5’-CCTCGCTCTGGTTGTAGTA-3’(SEQ ID NO:2)；
探针1101A-P：5’-CTCACAGACTGACCGAGTGGACCTGG-3’(SEQ ID NO:5)；
引物1101B-F：5’-GAGGACCTGCGCTCTTGG-3’(SEQ ID NO:3)；
引物1101B-R：5’-AGCGTCTCCTTCCCGTTC-3’(SEQ ID NO:4)；
探针1101B-P：5’-CACATGGCAGCTCAGATCACCAAGCGG-3’(SEQ ID NO:6)。
第二方面，本发明提供了上述特异性引物探针组合物在检测HLA-A*1101等位基因领域的应用。具体的，本发明提供了上述特异性引物探针组合物在制备检测HLA-A*1101等位基因的相关试剂和/或试剂盒方面的用途。
第三方面，本发明提供了用于检测HLA-A*1101等位基因的试剂盒，该试剂盒包括上述第一方面的特异性引物探针组合。
进一步的，该试剂盒还包括内标相关的引物探针组合，优选的，该内标引物探针组合包括内标引物β-actin-F/R和内标探针β-actin-P，其中，内标引物β-actin-F/R和内标探针β-actin-P的核苷酸序列分别为：
内标引物β-actin-F：5’-ACTGGTTCTCTCTTCTGCC-3’(SEQ ID NO:7)；
内标引物β-actin-R：5’-ACGAGCCAGTGTTAGTACC-3’(SEQ ID NO:8)；
内标探针β-actin-P：5’-TCCGTAGGACTCTCTTCTCTGACCTGA-3’(SEQ ID NO:9)。
在本申请的一种具体实施方式中，上述试剂盒包含反应液1和反应液2，反应液1用以检测1101A和内标，其包括特异性引物对1101A-F/R、特异性探针1101A-P、内标引物对β-actin-F/R和内标探针β-actin-P。反应液2用以检测1101B和内标，其包括特异性引物对1101B-F/R、特异性探针1101B-P、内标引物对β-actin-F/R和内标探针β-actin-P。
第三方面，本发明提供了一种HLA-A*1101等位基因的检测方法，该方法包括：
1)提取待测样本的基因组DNA；
2)采用第一方面的特异性引物标记组合物对DNA进行实时定量荧光PCR检测，并分别采集探针1101A-P和探针1101B-P所在荧光通道的荧光数据；
3)通过计算探针1101A-P和探针1101B-P所在荧光通道的扩增曲线和Ct值，判断HLA-A*1101等位基因型情况：当探针1101A-P和探针1101B-P所在荧光通道的Ct值小于设定值且扩增曲线正常，则判断样本HLA-A*1101阳性。
在本申请的一种具体实施方式中，上述检测方法中还包括内标，通过加入内标引物探针组合物，在特异性实时定量荧光PCR检测时进行内标检测，当内标探针所在荧光通道的Ct值小于设定值且扩增曲线正常，则判断样本检测正常。该方法利用针对HLA-A基因座第一和第二外显子区域设计特异性引物探针，并选择β-actin作为内标，整个检测方法具有操作流程简单、检测时间短、交叉反应少、特异性高、灵敏度高以及成本低等优点。
本发明的有益效果在于：本发明提供的特异性引物和探针组合物是以HLA-A*1101等位基因为模板设计的高度特异的，可以对HLA-A*1101等位基因进行特异性扩增，而不产生其余等位基因的非特异性扩增，达到检测的高特异性和高灵敏度。
同时，与DNA测序相比，本发明提供的检测方法极大的简化了操作过程，降低了检测成本和技术复杂性，缩短了检测时间。而本发明所述方法与传统的PCR-SSO、PCR-SSP、PCR-RFLP等方法学相比，节省了在PCR后处理操作繁琐的琼脂糖凝胶电泳等步骤。
综上所述，本发明提供的试剂盒及检测方法不仅具有检测时间短和成本低的优点，且本发明通过调整、优化获得的引物和探针的特异性强，其与其他高度同源A11等位基因也可以完全区分开，能大大减少交叉反应，达到较高的特异性，可用于HLA-A*1101等位基因的快速定性检测。
附图说明
图1为实施例1中的阳性的扩增曲线示意图，其中，A图为1101A和内标的荧光曲线，B图为1101B和内标的荧光曲线；
图2为实施例1中的阴性的扩增曲线示意图，其中，A图为1101A和内标的荧光曲线，B图为1101B和内标的荧光曲线。
具体实施方式
针对现有技术中关于HLA-A*1101检测技术上的缺陷与不足，本发明通过反复研究和实验，开发出一组能够用于检测HLA-A*1101等位基因的特异性引物和探针组合物，并基于该特异性的引物探针组合物进一步开发出了相应的试剂盒和检测方法。
需要特别说明的是，由于A基因座位上存在众多与HLA-A*1101等位基因同源性极高的等位基因，各等位基因与HLA-A*1101等位基因容易发生交叉反应，因此，常规的软件设计无法得到满足特异性要求的针对HLA-A*1101的特异性引物和探针组合。事实上，本发明在研究过程中发现，以HLA-A*1101等位基因的序列为模板设计的许多引物以及高度特异的荧光探针，在实际的检测试验中其检测效果差异非常大，大多无法满足特异性检测的要求。本发明通过大量的实验和验证，对引物和探针进行反复调整和优化，获得了检测特异性和灵敏度均能满足检测要求的引物和探针组合物。采用本发明公开的上述引物和探针组合物可以特异性扩增HLA-A*1101等位基因，且不产生其余等位基因的非特异性扩增，达到检测的高特异性和高灵敏度。
同时，为了进一步提高检测的准确性，本发明提供的检测HLA-A*1101等位基因的试剂盒中不仅采用了上述特异性引物探针组合物，还添加了内标。关于内标，在本发明的一种具体实施方式中优选采用的是β-actin。应理解，除β-actin外，其他基因例如RNase P、GADPH、TBP、PRKG1也可以作为内标进行使用。
基于上述特异性引物和探针组合物以及内标，本发明提供了相应的检测试剂盒以及检测方法。本发明的检测方法的原理是利用两对特异性的扩增HLA-A*1101等位基因的引物探针组合，对待测样本进行荧光PCR扩增，并通过荧光扩增曲线分析结果进行判断。因此，本发明提供的探针上标记有不同的荧光基团，包括荧光发光基团(标记于探针的5’端)和荧光淬灭基团(标记于探针的3’端)。适用于本发明的荧光发光基团包括但不限于：FAM、HEX、VIC、ROX、TAMRA或CY5。适用于本发明的荧光淬灭基团包括但不限于：TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB、DABCYL或BHQ3。
需要说明的是，本发明中的检测分两管进行独立扩增检测(即1101A、1101B分别独立扩增)，因此，探针1101A-P和探针1101B-P可使用相同的荧光信号。例如在本发明的一个具体实施方式中，设计的试剂盒包含反应液1和反应液2，反应液1用以检测1101A和内标，其包括特异性引物对1101A-F/R、特异性探针1101A-P、内标引物对β-actin-F/R和内标探针β-actin-P。反应液2用以检测1101B和内标，其包括特异性引物对1101B-F/R、特异性探针1101B-P、内标引物对β-actin-F/R和内标探针β-actin-P。此时，探针1101A-P 5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有BHQ1淬灭基团。探针1101B-P 5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有BHQ1淬灭基团。内标探针β-actin-P 5’端标记有VIC荧光基团，3’端标记有BHQ1淬灭基团。
同时，本发明提供的试剂盒中除引物、探针外，还包括PCR反应所需的其他试剂，例如PCR反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和酶稀释液等。应理解，关于试剂盒的具体组成方式，可以各种引物和探针独立包装，也可以按照上述反应液1和反应液2的方式，进行组合包装，这并不构成对本发明的限制。
在本发明的一种具体实施方式中，采用1101A、1101B分别检测的方法进行，其检测具体步骤包括：
1)提取待测全血样本的基因组DNA；
2)将反应体系配置到8连管或者96孔板中，注意标记和区分反应液1和反应液2，即1101A和1101B分别独立检测；
3)通过计算反应液1/反应液2中1101A/1101B的Ct值来判断HLA-A*1101等位基因型情况。
其中具体的判断标准为：
1)反应液1孔中1101A Ct值小于32且扩增曲线正常，内标Ct值小于35且扩增曲线正常，则判断反应液1孔阳性。反应液2孔中1101B Ct值小于32且扩增曲线正常，内标Ct值小于35且扩增曲线正常，则判断反应液2孔阳性。
2)当反应液1和反应液2孔均为阳性则判断该样本HLA-A*1101阳性。
3)当反应液1和反应液2孔有1孔阴性，或两孔均为阴性，则判断该样本HLA-A*1101阴性。
此外，适用于本发明的样本包括但不限于全血样本、鼻咽拭子、FFPE样本、新鲜手术组织样本。
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
实施例1：
1、引物探针的设计与筛选
1)本例中以HLA-A*1101等位基因的序列为模板，通过对引物和探针进行调整和优化，获得了一组检测特异性和灵敏度均更优的引物和探针组合物(引物对1101A-F/R、特异性探针1101A-P；引物对1101B-F/R、特异性探针1101B-P)，在本例中采用β-actin作为内标。同时，作为对照，本例中例举了一组常规采用软件设计的引物和探针组合物作为对照(引物对1101A-F/R-1、探针1101A-P-1；引物对1101B-F/R-1、探针1101B-P-1)，相关序列如表1所示。
表1引物探针序列信息
| 名称 | 序号 | 序列 |
| 引物1101A-F | SEQ ID NO:1 | AGGAGACACGGAATGTGAA |
| 引物1101A-R | SEQ ID NO:2 | CCTCGCTCTGGTTGTAGTA |
| 引物1101B-F | SEQ ID NO:3 | GAGGACCTGCGCTCTTGG |
| 引物1101B-R | SEQ ID NO:4 | AGCGTCTCCTTCCCGTTC |
| 探针1101A-P | SEQ ID NO:5 | CTCACAGACTGACCGAGTGGACCTGG |
| 探针1101B-P | SEQ ID NO:6 | CACATGGCAGCTCAGATCACCAAGCGG |
| 内标引物β-actin-F | SEQ ID NO:7 | ACTGGTTCTCTCTTCTGCC |
| 内标引物β-actin-R | SEQ ID NO:8 | ACGAGCCAGTGTTAGTACC |
| 内标探针β-actin-P | SEQ ID NO:9 | TCCGTAGGACTCTCTTCTCTGACCTGA |
| 对照引物1101A-F-1 | SEQ ID NO:10 | CCCACTCCATGAGGTATTTCTA |
| 对照引物1101A-R-1 | SEQ ID NO:11 | GTGTCTCCTGGTCCCAATA |
| 对照引物1101B-F-1 | SEQ ID NO:12 | CATCGCCCTGAACGAGGA |
| 对照引物1101B-R-1 | SEQ ID NO:13 | CCCTCCAGGTAGGCTCTC |
| 对照探针1101A-P-1 | SEQ ID NO:14 | CCTCCTGCTCTATCCACGGCG |
| 对照探针1101B-P-1 | SEQ ID NO:15 | CGGACATGGCAGCTCAGATCACCA |
2)通过扩增实验对表1中的引物探针组合进行筛选，各不同引物探针组合对相同样本的扩增结果如表2所示。实验结果显示，本例中引物和探针组合物得以特异性扩增HLA-A*1101等位基因，不产生其余等位基因的非特异性扩增，可达到检测的高特异性和高灵敏度。而对照引物探针组合则显然无法满足检测需要。
表2不同引物探针组合扩增结果
2、对引物、探针及酶试剂组分优化，确定最优体系，优化体系如表3所示。其中相关探针的荧光标记为：探针1101A-P 5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有BHQ1淬灭基团。探针1101B-P 5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有BHQ1淬灭基团。内标探针β-actin-P 5’端标记有VIC荧光基团，3’端标记有BHQ1淬灭基团。
表3引物、探针及相关试剂优化体系
3、DNA样品的提取与纯化
本例中收集全血样本(包括阳性样本和阴性样本)作为待测样本进行检测。本例中提取或纯化样本核酸所用试剂为核酸提取或纯化试剂，具体的操作步骤详见试剂说明书即可。
4、样本检测
取步骤3中提取纯化的DNA样本与步骤2中配置好的反应液1/2按照表4所示的反应体系进行配置后放入荧光定量PCR仪中，按照表5所示扩增程序进行扩增，并进行FAM、VIC通道荧光采集。
表4实时荧光PCR反应体系(反应体系体积设置为25μl)
| 成分 | 体积(μl) |
| 反应液1/反应液2 | 15 |
| 基因组DNA | 1 |
| 纯化水 | 9 |
表5实时荧光PCR扩增程序
5、结果分析
根据扩增曲线计算各样本1101A/1101B及内标基因的Ct值，并根据Ct值差判定HLA-A*1101等位基因的阴阳性情况。根据实验数据，1101A的相对荧光单位(RFU)阈值参考值设定为20，1101B的相对荧光单位(RFU)阈值参考值设定为40，内标的相对荧光单位(RFU)阈值参考值设定为20，荧光仪基线参考值为：3～15。本例中的部分检测结果参考图1和图2，其中，阳性样本的扩增曲线示意图见图1，图1中A图为1101A(蓝色)和内标(绿色)的荧光曲线，B图为1101B(蓝色)和内标(绿色)的荧光曲线，图1中1101A、1101B、内标的扩增曲线均正常，该样本携带HLA-A*1101等位基因，为阳性。阴性样本的扩增曲线示意图见图2，图2中A图为1101A(蓝色)和内标(绿色)的荧光曲线，B图为1101B(蓝色)和内标(绿色)的荧光曲线，图2中内标的扩增曲线正常，但1101A和1101B均无扩增曲线，则该样本并不携带HLA-A*1101等位基因。上述扩增曲线正常是指荧光通道内出现扩增曲线，且扩增曲线具有基数期和指数增长期。同时，采用内标作为质控时，内标必须出现对应的荧光扩增曲线，否则，实验失败。应理解，由于采用不同的荧光仪，其荧光仪基线参考值将有所不同，故对应的1101A、1101B及内标基因的相对荧光单位(RFU)阈值参考值也会有所变化。因此，在实际检测中1101A、1101B及内标基因对应的Ct值的设定值可以参考不同实验条件进行具体设定，即该扩增曲线在一定的循环数内超过相应的荧光阈值。
结合上述实验结果，适用于本例的具体的判断标准为：
1)反应液1孔中1101ACt值小于32且扩增曲线正常，内标Ct值小于35且扩增曲线正常，则判断反应液1孔阳性。反应液2孔中1101B Ct值小于32且扩增曲线正常，内标Ct值小于35且扩增曲线正常，则判断反应液2孔阳性。应理解，若内标的扩增曲线不正常或无内标情况则说明实验失败，应重新进行检测，不进行阴阳性结果判断。
2)当反应液1和反应液2孔均为阳性则判断该样本HLA-A*1101阳性。
3)当反应液1和反应液2孔有1孔阴性，或两孔均为阴性，则判断该样本HLA-A*1101阴性。
通过本例中的上述判断方式对待测样本进行判断的结果与实际结果完全一致，说明本发明具有极高的特异性和准确性，可用于HLA-A*1101等位基因的快速定性检测。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
Claims (10)
1.用于检测HLA-A*1101等位基因的特异性引物探针组合物，包括：引物对1101A-F/R、引物1101B-F/R、探针1101A-P和探针1101B-P；
所述引物对1101A-F/R的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和2所示；
所述引物对1101B-F/R的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和4所示；
所述探针1101A-P的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述探针1101B-P的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2.如权利要求1所述的特异性引物探针组合物，其特征在于，所述探针上标记有荧光基团；
优选的，所述荧光基团包括：标记于探针5’端的荧光发光基团和标记于探针3’端的荧光淬灭基团；
优选的，所述荧光发光基团为FAM、HEX、VIC、ROX、TAMRA或CY5中的至少一种；
优选的，所述荧光淬灭基团为TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB、DABCYL或BHQ3中的至少一种；
优选的，所述探针1101A-P 5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有BHQ1淬灭基团；
优选的，所述探针1101B-P 5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有BHQ1淬灭基团。
3.如权利要求1或2所述的特异性引物探针组合物在检测HLA-A*1101等位基因领域的应用。
4.如权利要求1或2所述的特异性引物探针组合物在制备检测HLA-A*1101等位基因的试剂和/或试剂盒方面的用途。
5.一种用于检测HLA-A*1101等位基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的特异性引物探针组合物。
6.如权利要求5中所述的试剂盒，其特征在于，还包括内标引物探针组合物；
优选的，所述内标为β-actin、RNase P、GADPH、TBP或PRKG1中的至少一种；
优选的，所述内标引物探针组合物包括内标引物对β-actin-F/R和内标探针β-actin-P；其中，所述内标引物对β-actin-F/R的核苷酸序列如SEQ ID NO:7和8所示，所述内标探针β-actin-P的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
优选的，所述内标探针标记有荧光基团；
优选的，所述荧光基团包括：标记于探针5’端的荧光发光基团和标记于探针3’端的荧光淬灭基团；
优选的，所述荧光发光基团为FAM、HEX、VIC、ROX、TAMRA或CY5中的至少一种；
优选的，所述荧光淬灭基团为TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB、DABCYL或BHQ3中的至少一种；
优选的，所述内标探针5’端标记有VIC荧光基团，3’端标记有BHQ1淬灭基团。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括反应液1和反应液2，所述反应液1包括特异性引物对1101A-F/R、特异性探针1101A-P、内标引物对β-actin-F/R和内标探针β-actin-P；所述反应液2包括特异性引物对1101B-F/R、特异性探针1101B-P、内标引物对β-actin-F/R和内标探针β-actin-P。
8.如权利要求5-7中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和酶稀释液。
9.一种HLA-A*1101等位基因的检测方法，包括：
提取待测样本的基因组DNA；
采用如权利要求2所述的特异性引物标记组合物对DNA进行实时定量荧光PCR检测，分别采集探针1101A-P和探针1101B-P所在荧光通道的荧光数据；
通过计算探针1101A-P和探针1101B-P所在荧光通道的扩增曲线和Ct值，判断HLA-A*1101等位基因型情况；
当探针1101A-P和探针1101B-P所在荧光通道的Ct值小于设定值且扩增曲线正常，则判断样本HLA-A*1101阳性。
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述实时定量荧光PCR检测时还包括采用内标引物标记组合物进行内标检测，当内标探针所在荧光通道的Ct值小于设定值且扩增曲线正常，则判断样本检测正常。
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