CN110863040A - 用于荧光定量pcr检测cyp3a5基因多态性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于荧光定量PCR检测CYP3A5基因多态性的引物探针组合，核苷酸序列如序列表所示；同时提供一种荧光定量PCR检测CYP3A5基因多态性的方法。本发明采用实时荧光定量PCR Taqman‑MGB探针的方法检测CYP3A5基因多态性，并且采用了野生型与突变型双探针的检测方法，不但提高了特异性，还降低了成本；Taqman‑MGB探针在实验结果的准确性、重复性、特异性、灵敏度等方面均优于普通的探针。因此，本发明建立的CYP3A5基因多态性的方法存在结果准确、特异性灵敏度高、无毒害无污染、成本低廉、快速高效等优点。

Description

用于荧光定量PCR检测CYP3A5基因多态性的方法

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其是涉及用于荧光定量PCR检测CYP3A5基因多态性的引物探针组合及检测方法。

背景技术

他克莫司(tacrolimus，FK506)为大环内酯类免疫抑制剂，临床上广泛用于肝、肾、心、肺、胰等器官移植患者的免疫抑制治疗，其主要不良反应包括继发性感染、肾毒性、神经毒性、胃肠反应、代谢障碍以及淋巴增生性疾病和肿瘤等。器官移植患者应用他克莫司后血药浓度偏低可导致急性排斥反应和药物敏感性降低；血药浓度偏高则容易发生肾毒性、神经毒性、糖尿病、高血脂症、高血压和胃肠道紊乱等不良反应。导致他克莫司毒副作用的发生。CYP3A5在他克莫司的代谢中起重要作用，CYP3A5基因第3内含子内22893位存在c.6986A＞G的突变(rs776746，CYP3A5*3)，该SNP可导致CYP3A5mRNA异常剪接，引起终止密码子过早剪切CYP3A5蛋白，从而使其失去酶的活性，因此CYP3A5*3纯合子个体肝脏和肠道CYP3A5蛋白表达和活性显著下降。其活性降低可导致他克莫司的血药浓度升高，不良反应增加。CPIC指南建议携带CYP3A5*3/*3基因型的移植患者减少他克莫司的用药剂量，以避免发生药物不良反应。

目前，对于CYP3A5*3基因多态性检测的方法有很多种，如限制性长度多态性分析(RFLP)、直接测序法、印记杂交法、Taqman技术、等位基因特异性扩增法(ARMS)等。其中，最常用的测序法能够直接检测突变位点的位置和类型，但该方法操作步骤繁琐，检测周期长，灵敏度低，且扩增产物容易产生污染。

发明内容

为了解决上述缺陷，本发明的技术目的是提供用于荧光定量PCR检测CYP3A5基因多态性的引物探针组合及检测方法，该方法运用引物与双探针组合的检测方法，具有结果准确、特异性灵敏度高、无毒害无污染、成本低廉、快速高效等优点。

为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：一种用于荧光定量PCR检测CYP3A5基因多态性的引物探针组合，所述引物探针的核苷酸序列：上游引物由SEQ IDNO.1所示，下游引物由SEQ ID NO.2所示，荧光探针1由SEQ ID NO.3所示，荧光探针2由SEQID NO.4所示。

本发明的引物探针组合尤其是针对CYP3A5基因的CYP3A5*3位点的检测所特别设计的，可以高效率、高特异性、准确地扩增出CYP3A5基因的CYP3A5*3位点的特异性基因片段。本发明的引物探针组合，所述荧光探针在5′末端区域标记有荧光基团，在3′末端区域标记有淬灭基团，荧光探针1和荧光探针2的荧光基团均不相同。其中所述荧光基团选自FAM、TET、VIC、ROX、Texas Red-X、Cy3、Cy5中的任意一种，更优选是FAM、TET、VIC、ROX中的一种；淬灭基团选自TAMRA、BHQ、DABCYL、NFQ-MGB中的任意一种。根据本发明一种最优选的实施方案，荧光探针的选择是：荧光探针1的5′端标记有FAM的荧光基团，荧光探针2的5′端标记有VIC荧光基团，所有荧光探针的3′端均标记有NFQ-MGB的淬灭基团。

本发明采用实时荧光定量PCR Taqman-MGB探针的方法检测CYP3A5基因多态性，并且采用了野生型与突变型双探针的检测方法，不但提高了特异性，还降低了成本；Taqman-MGB探针在实验结果的准确性、重复性、特异性、灵敏度等方面均优于普通的探针。因此，本发明建立的CYP3A5基因多态性的方法存在结果准确、特异性灵敏度高、无毒害无污染、成本低廉、快速高效等优点。

经过多次试验证明，本发明提供的引物探针组合具有较好的特异性和扩增准确性，可以应用于制备荧光定量PCR检测CYP3A5基因多态性的试剂盒，通过制备成成品试剂盒，可以在采集了样品试验后，快速准确地得出CYP3A5基因多态性的结果。

所述试剂盒，主要是包括本发明提供的引物探针组合，其中引物的终浓度优选为：上游引物和下游引物的终浓度均为0.2-1.0μM；荧光探针的终浓度均为0.05-1.0μM。其他PCR试剂可以根据常规技术选择，例如优选的技术方案是，还包含DNA聚合酶、缓冲液、尿嘧啶DNA糖基酶、dNTPs和超纯水。

在制作成品试剂盒时，还可以根据实际需要，选择性的配置用于提取样品DNA的试剂或者专业的DNA提取试剂盒；可以更方便快捷地得到待检测样品的DNA，增强本发明的检测成品试剂盒的使用方便和快捷性。所述待测样品可以为任何含有基因组DNA的血液、细胞、组织或口腔拭子样品。

在本发明提供的引物探针的基础上，本发明进一步提供一种用于荧光定量PCR检测CYP3A5基因多态性的检测方法，采用所述的引物探针进行荧光定量PCR检测。

根据一种优选的实施方式，所述检测方法的具体步骤是：

(1)从待测样品中提取基因组DNA，作为扩增模板；

(2)配制包含所述引物探针组合和所述扩增模板的荧光定量PCR反应体系，反应体系中，上游引物和下游引物的终浓度均为0.2-1.0μM；荧光探针的终浓度均为0.05-1.0μM；

PCR反应体系包括：2×TaqMan PCR反应混合物(DNA聚合酶、缓冲液、尿嘧啶DNA糖基酶、dNTPs(含dUTP))、扩增CYP3A5*3位点的上下游引物和野生型、突变型特异性荧光探针(荧光探针1和荧光探针2)、超纯水和DNA模板，反应体系体积为10-50μl；

(3)荧光PCR扩增反应，条件：90-98℃，预变性，5-20min；94-98℃变性10-50s；55-69℃，退火60-90s；68-72℃，延伸15-300s；30-50个循环；

(4)基因型判读：

方法一：扩增完成后，根据扩增曲线呈S型或类似S型，且Ct≤30，判断实验是否成功；再根据以下标准判断基因型：纯合型(突变、野生)：一条曲线Ct≤30，且曲线呈S型或类似S型；另外一条曲线Ct＞30，或无曲线产生；杂合型：两条曲线均Ct≤30，且曲线呈S型或类似s型。

方法二：扩增完成后，根据散点图自动读取基因型，每个点代表一个样品，每个数据集代表一种基因型(纯合野生型、杂合突变型、纯合突变型)。

本发明适用任何市面上常见的荧光定量PCR仪，具体包括ABI荧光定量PCR仪(ABI7300，ABI7500，ABI ViiA7、ABI Stepone plus(Stepone))；Roche(罗氏)荧光定量PCR仪LightCycler480；Bio-rad(伯乐)荧光定量PCR仪CFX96TM等。可根据不同PCR仪选用不同荧光探针进行PCR扩增。

本发明检测方法的优点和效果如下：

(1)单管内同时加入突变型和野生型两种探针，操作简单、减少成本、结果分析更清晰明了，提高了检测效率，可进行大批量样本的检测，有利于临床操作。

(2)使用Taqman-MGB特异性探针对基因多态性检测，特异性强、结果准确性高。检测结果与测序结果完全一致。

(3)整个检测过程均在同一个PCR管内进行，无需开盖分析，不易造成气溶胶污染；无需进行电泳分析，不接触有毒有害试剂。

(4)从样本接收、DNA提取到PCR扩增全部检测过程可在4小时内完成。可同时检测大批量样本，提高了检测效率，节约了时间成本。

本发明采用实时荧光定量PCR Taqman-MGB探针的方法检测CYP3A5基因多态性，并且采用了野生型与突变型双探针的检测方法，不但提高了特异性，还降低了成本。MGB-Taqman探针在实验结果的准确性、重复性、特异性、灵敏度等发面均优于普通的探针。本发明的检测方法能快速、准确、高效的检测CYP3A5*3多态性，使假阳性和假阴性的发生概率降到了最低，并为根据CYP3A5*3的基因多态性结果给出他克莫司初次用量提供了技术支持。

附图说明

图1为CYP3A5*3位点的三种基因型(AA纯合野生型、AG杂合突变型、GG纯合突变型)和空白。

图2为CYP3A5*3位点的三种基因型分布情况。

具体实施方式

为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明。非特殊说明，本发明实施所采用的试剂均为市售商品，本发明实施所采用的数据库均为公开的在线数据库。以下实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1

一种检测CYP3A5基因多态性的方法待测DNA样本的制备方法，包括如下步骤：用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取基因组DNA，并采用NP80-touch(德国IMPLEN)测定DNA的浓度及纯度，然后保存基因组DNA。

实施例2

1.引物和探针设计

本发明根据CYP3A5*3基因位点的碱基序列分别设计特异性引物和特异性荧光探针，特异性引物通过Primer Premier 5.0在包含SNP位点的两端设计引物，通过软件分析选择最适合的引物；特异性探针位于一对引物之间的区域，其中检测野生型的探针5’端采用荧光报告基团(FAM)标记，检测突变型的探针5’端采用荧光报告基团(VIC)标记，3’端采用非荧光淬灭基团(NFQ)标记，同时探针上还链接有MGB修饰基团；在实际操作中可根据实际情况更换荧光报告基团，只要保证野生型和突变型探针的荧光报告基团不一致。

本发明的引物探针序列见表1：

表1 PCR引物探针序列

序列编号	引物名称	5’-3’
			SEQ ID NO.1	CYP3A5*3-F	ACGTATGTACCACCCAGCTTAAC
SEQ ID NO.2	CYP3A5*3-R	AAGGGTAATGTGGTCCAAACAG
			SEQ ID NO.3	CYP3A5*3-P1	FAM+CTTTTGTCTTTCAATATCTCTTC+MGB
SEQ ID NO.4	CYP3A5*3-P2	VIC+CTTTTGTCTTTCAGTATCTCTTC+MGB

2.体系配制及PCR扩增

通过荧光定量PCR反应扩增出CYP3A5基因目的片段，引物(上下游引物)和探针(探针1、探针2)分别按照1∶1混合，反应体系见表2，按照表3的反应程序进行扩增；实验过程设置空白对照，以超纯水为模板。

表2 PCR扩增反应体系

试剂成分	体积
		2×TaqMan PCR Mix	5μl
Probe Mix	0.4μl
		Primer Mix	0.5μl
DNA	1ul
		水	3.1ul

表3多重PCR反应条件

备注：*为接收荧光信号的位置。

实施例2选用ABI 7500用于扩增，但本发明不仅局限于ABI 7500，它适用任何荧光定量PCR仪，可根据不同PCR仪选用不同荧光探针进行检测。

3.结果判断

反应结束后，进行自动调整基线和阈值。设定之后，观察各样本的Ct值。

Ct≤30，且曲线呈S型或类似S型；

空白对照Ct＞30，或无曲线产生。

4.基因分型

纯合型(突变、野生)：一条曲线Ct≤30，且曲线呈S型或类似S型；另外一条曲线Ct＞30，或无曲线产生。

杂合型：两条曲线均Ct≤30，且曲线呈S型或类似S型；

检测结果如图1所示，分别是CYP3A5*3位点的三种基因型(AA纯合野生型、AG杂合突变型、GG纯合突变型)和空白的曲线图。

如图2所示，CYP3A.5*3位点的三种基因型分布情况。

本发明检测结果与“金标准”测序方法比较，结果符合率为100％，其检测方法有很好的特异性。

实施例3：试剂盒的配置

根据上述实验结果，本实施例提供一种优选的用于荧光定量PCR检测CYP3A5基因多态性的试剂盒，所述试剂盒中包含以下试剂：

2×TaqMan PCR Mix.DNA聚合酶、缓冲液、尿嘧啶DNA糖基酶、dNTPs(含dUTP)；

Probe Mix：2个荧光探针，终浓度均为0.6μM；

Primer Mix：引物对，F上游引物(1.0μM)，R下游引物(1.0μM)；

样品DNA提取试剂；

样品DNA采集收纳盒(如包含口腔拭子和拭子收纳盒)；

超纯水。

所述试剂在试剂盒中合理安放，再放入试剂盒的使用说明(可选择性再配置PCR试管或孔板或移液枪)，所述使用说明包括待测样品DNA的采集步骤，采集后放入收纳盒中，再进行DNA提取步骤，最后按照上述的检测方法进行PCR扩增过程。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 北京和合医学诊断技术股份有限公司

<120> 用于荧光定量PCR检测CYP3A5基因多态性的方法

<130> ss191-215

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

acgtatgtac cacccagctt aac 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

aagggtaatg tggtccaaac ag 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cttttgtctt tcaatatctc ttc 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

cttttgtctt tcagtatctc ttc 23

Claims (10)

1.一种用于荧光定量PCR检测CYP3A5基因多态性的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针的核苷酸序列：上游引物由SEQ ID NO.1所示，下游引物由SEQ ID NO.2所示，荧光探针1由SEQ ID NO.3所示，荧光探针2由SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述CYP3A5基因多态性包括CYP3A5基因的CYP3A5*3位点。

3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光探针在5′末端区域标记有荧光基团，在3′末端区域标记有淬灭基团，荧光探针1和荧光探针2的荧光基团均不相同。

4.根据权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、TET、VIC、ROX、Texas Red-X、Cy3、Cy5；淬灭基团选自TAMRA、BHQ、DABCYL、NFQ-MGB。

5.根据权利要求3或4所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光探针1的5′端标记有FAM的荧光基团，荧光探针2的5′端标记有VIC荧光基团，所有荧光探针的3′

端均标记有NFQ-MGB的淬灭基团。

6.权利要求1-5任一项所述的引物探针组合应用于制备荧光定量PCR检测CYP3A5基因多态性的试剂盒中。

7.一种用于荧光定量PCR检测CYP3A5基因多态性的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-5任一项所述的引物探针组合。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包含DNA聚合酶、缓冲液、尿嘧啶DNA糖基酶、含dUTP的dNTPs和超纯水。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包含待测样品DNA提取试剂或DNA提取试剂盒。

10.一种用于荧光定量PCR检测CYP3A5基因多态性的检测方法，其特征在于，采用权利要求1-5任一项所述的引物探针组合对待测样品进行荧光定量PCR检测，包括步骤：

(1)从待测样品中提取基因组DNA，作为扩增模板；

(2)配制包含所述引物探针组合和所述扩增模板的荧光定量PCR反应体系，上游引物和下游引物的终浓度均为0.2-1.0μM；荧光探针的终浓度均为0.05-1.0μM；

(3)荧光PCR扩增反应，条件：90-98℃，预变性，5-20min；94-98℃变性10-50s；55-69℃，退火60-90s；68-72℃，延伸15-300s；30-50个循环；

(4)基因型判读：

方法一：扩增完成后，根据扩增曲线呈S型或类似S型，且Ct≤30，判断实验是否成功；再根据以下标准判断基因型：纯合型(突变、野生)：一条曲线Ct≤30，且曲线呈S型或类似S型；另外一条曲线Ct＞30，或无曲线产生；杂合型：两条曲线均Ct≤30，且曲线呈S型或类似S型；

方法二：扩增完成后，根据散点图自动读取基因型，每个点代表一个样品，每个数据集代表一种基因型：纯合野生型、杂合突变型、纯合突变型。

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