CN117721253A - 用于指导奈韦拉平用药的hla-drb1-01:01分型检测扩增引物组、试剂、试剂盒 - Google Patents
用于指导奈韦拉平用药的hla-drb1-01:01分型检测扩增引物组、试剂、试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117721253A CN117721253A CN202311844751.7A CN202311844751A CN117721253A CN 117721253 A CN117721253 A CN 117721253A CN 202311844751 A CN202311844751 A CN 202311844751A CN 117721253 A CN117721253 A CN 117721253A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- drb1
- hla
- nevirapine
- administration
- typing detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- NQDJXKOVJZTUJA-UHFFFAOYSA-N nevirapine Chemical compound C12=NC=CC=C2C(=O)NC=2C(C)=CC=NC=2N1C1CC1 NQDJXKOVJZTUJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 90
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 88
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 88
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 76
- 229960000689 nevirapine Drugs 0.000 title claims abstract description 45
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 102100040485 HLA class II histocompatibility antigen, DRB1 beta chain Human genes 0.000 claims abstract description 83
- 108010039343 HLA-DRB1 Chains Proteins 0.000 claims abstract description 83
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 37
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 claims 3
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 9
- 230000004907 flux Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 65
- 101001100327 Homo sapiens RNA-binding protein 45 Proteins 0.000 description 61
- 102100038823 RNA-binding protein 45 Human genes 0.000 description 61
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 38
- 238000013461 design Methods 0.000 description 17
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 14
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 4
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 102210047356 DRB1*03:01 Human genes 0.000 description 3
- 102210047784 DRB1*13:02 Human genes 0.000 description 3
- 102210012675 DRB1*15 Human genes 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- 101150018610 HLA-DRB1 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 3
- 102210048109 DRB1*01:01 Human genes 0.000 description 2
- 102210048110 DRB1*01:02 Human genes 0.000 description 2
- 102210048112 DRB1*04:01 Human genes 0.000 description 2
- 102210047482 DRB1*07:01 Human genes 0.000 description 2
- 102210048119 DRB1*12:01 Human genes 0.000 description 2
- 102210048120 DRB1*13:01 Human genes 0.000 description 2
- 206010040914 Skin reaction Diseases 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000013441 quality evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000035483 skin reaction Effects 0.000 description 2
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 201000010000 Agranulocytosis Diseases 0.000 description 1
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102210048113 DRB1*04:03 Human genes 0.000 description 1
- 102210042966 DRB1*04:04 Human genes 0.000 description 1
- 102210048115 DRB1*04:07 Human genes 0.000 description 1
- 102210047360 DRB1*04:08 Human genes 0.000 description 1
- 102210047483 DRB1*11:01 Human genes 0.000 description 1
- 102210047484 DRB1*11:04 Human genes 0.000 description 1
- 102210047486 DRB1*11:28 Human genes 0.000 description 1
- 102210048121 DRB1*14:01 Human genes 0.000 description 1
- 102210047362 DRB1*15:01 Human genes 0.000 description 1
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010014950 Eosinophilia Diseases 0.000 description 1
- 206010059284 Epidermal necrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 206010018687 Granulocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 101900297506 Human immunodeficiency virus type 1 group M subtype B Reverse transcriptase/ribonuclease H Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 206010042033 Stevens-Johnson syndrome Diseases 0.000 description 1
- 231100000168 Stevens-Johnson syndrome Toxicity 0.000 description 1
- 206010044223 Toxic epidermal necrolysis Diseases 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 1
- 230000007056 liver toxicity Effects 0.000 description 1
- 208000018555 lymphatic system disease Diseases 0.000 description 1
- 229940042402 non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000002726 nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000001303 quality assessment method Methods 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 1
- 238000007482 whole exome sequencing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明实施例公开了用于指导奈韦拉平用药的HLA‑DRB1*01:01分型检测扩增引物组、试剂、试剂盒；扩增引物组包括：HLA‑DRB1*01:01‑F，其序列为：5’‑CYTGTGGCAGCTTAAGTTTGAA‑3’；其中，Y为简并碱基，代表C/T；HLA‑DRB1*01:01‑R，其序列为：5’‑CACTGTGAA GCTCTCACAAAC‑3’；HLA‑DRB1*01:01‑P，其序列为：5’‑FAM‑CATCTATAACCAAGAGGAGTCCGTGCG‑3’‑BHQ1。利用指导奈韦拉平用药的HLA‑DRB1*01:01分型检测扩增引物组，能够准确、快速、简便地检测待测样本是否具有HLA‑DRB1*01:01的基因，具有高通量、特异性高的优点，可用于指导奈韦拉平的用药。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1-01:01分型检测扩增引物组、试剂、试剂盒。
背景技术
奈韦拉平是一类治疗HIV-1感染的非核苷逆转录酶抑制剂，与HIV-1的逆转录酶直接连接，使此酶的催化端破裂来阻断RNA依赖/DNA依赖的DNA聚合酶活性。使用此药物后，最严重的药物不良反应是Stevens-Johnson综合征，毒性表皮坏死溶离，重症肝炎/肝衰竭和过敏反应，其特征为皮疹，伴全身症状，如发热、关节痛、肌痛和淋巴结病，以及内脏损害，如肝炎、嗜酸细胞增多、粒细胞缺乏症和肾功能损害。临床研究表明：患者使用奈韦拉平片后，约48％的患者会出现全身反应或皮肤反应，4.9％的患者会引发肝毒，0.3％的患者则会出现SJS/TEN等严重皮肤反应。不同个体对药物的耐受力不同，临床医师不能预先判定疾病的复发频度以及侵袭性，以及对奈韦拉平药物不良反应的顾虑，很难决定针对某个患者是否采用奈韦拉平药物进行辅助治疗，而研究表明，奈韦拉平所致的药物不良反应与人HLA基因的HLA-DRB1*01:01亚型密切相关，通过对人HLA-DRB1*01:01亚型携带者进行检测，将有效避免在临床上出现的肝脏毒性等不良反应，提高患者疗效。
人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)是目前所知人体最复杂的多态系统，HLA复合体位于人类第6号染色体短臂6p21.31上，占人类整个基因组的1/3000。自Jean Dausset于1958年发现第1个HLA抗原以来，HLA已成为免疫遗传学、免疫生物学和生物化学等学科的重要组成部分。HLA与多种疾病的发展有着密切的关系，带有某些特定HLA型的个体疾病的敏感度不同，对HLA基因进行分型可以根据基因型选择治疗药物，提高药物的有效性，避免不良反应的发生。
目前，常用的HLA基因分型方法有直接测序法、PCR-RFLP(限制性片段长度多态性分析)、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸探针)、PCR-SSP(序列特异性引物PCR技术)和PCR-SSCP(单链构象多态性分析)等。其中直接测序法在所有SNP的检测方法中，是最为准确的方法，但是，存在操作繁琐、耗时长、成本高昂的缺点；PCR-RFLP是通过电泳观察结果，尚不能检出所有的HLA等位基因；PCR-SSO是以同位素或非放射性标记的探针与PCR扩增的目标片断产物杂交，根据阳性斑点判断个体基因型，但是需要不同探针的杂交条件严格统一，易出现误差，不能检测新等位基因，分辨率低；PCR-SSP借助PCR技术获得HLA型特异的扩增产物，通过电泳直接分析带型，但是不易自动化，且无法检测新的等位基因；PCR-SSCP是一种简单、高效地检测DNA或RNA序列中点突变的技术，需要进一步测序去确定突变的位置和类型，容易出现重叠峰。这些方法均是针对全部或特定HLA基因所有可能的型或亚型的全面性检测方法，对于奈韦拉平的精准快速用药指导没有指导意义，难以满足临床的需求，因此亟需一种精准快速的HLA-DRB1*01:01基因型检测方法。
发明内容
有鉴于此，一方面，一些实施例公开了用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测扩增引物组，包括：
HLA-DRB1*01:01-F，其序列为：
5’-CYTGTGGCAGCTTAAGTTTGAA-3’；其中，Y为简并碱基，代表C/T；
HLA-DRB1*01:01-R，其序列为：
5’-CACTGTGAAGCTCTCACAAAC-3’；
HLA-DRB1*01:01-P，其序列为：
5’-FAM-CATCTATAACCAAGAGGAGTCCGTGCG-3’-BHQ1。
进一步，一些实施例公开的用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测扩增引物组，还包括内标基因特异性扩增引物组，内标基因特异性扩增引物组包括：
CFTR-F，其序列为：
5’-GTAGGAAGTCACCAAAGCAGTACA-3’；
CFTR-R，其序列为：
5’-AGCTATTCTCATCTGCATTCCA-3’；
CFTR-P，其序列为：
5’-CY5-CTATGACCCGGATAACAAGGAGGAACGC-3’-BHQ2。
再一方面，一些实施例公开了用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂，包括用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测扩增引物组。
一些实施例公开的用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂，分型检测试剂用于对人体DNA样本进行检测。
一些实施例公开的用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂，其进行检测的人体DNA样本为血清样本。
一些实施例公开的用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂，利用分型检测试剂对人体DNA样本的检测过程包括：
处理人体DNA样本；
利用分型检测试剂、人体DNA样本配置扩增反应体系；
扩增反应体系进行扩增反应；
根据扩增反应结果判定人体DNA样本是否携带有HLA-DRB1*01:01等位基因。
另一方面，一些实施例公开了用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂盒，包括用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂。
一些实施例公开的用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂盒，分型检测试剂盒用于对人体DNA样本进行检测。
一些实施例公开的用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂盒，其进行检测的人体DNA样本为血清样本。
一些实施例公开的用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂盒，利用分型检测试剂盒对人体DNA样本的检测过程包括：
处理人体DNA样本；
利用分型检测试剂、人体DNA样本配置扩增反应体系；
扩增反应体系进行扩增反应；
根据扩增反应结果判定人体DNA样本是否携带有HLA-DRB1*01:01等位基因。
本发明实施例公开的用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测扩增引物组、试剂和试剂盒，包括针对HLA-DRB1*01:01进行PCR扩增的上下游特异性引物组和一种特异性探针，采用荧光定量ARMS-PCR的方法，能够准确、快速、简便地检测待测样本是否具有HLA-DRB1*01:01的基因，具有高通量、特异性高的优点，可用于指导奈韦拉平的合理化用药。
附图说明
图1实施例2PCR扩增结果示意图；
图2实施例3PCR扩增结果示意图；
图3实施例4PCR扩增结果示意图；
图4实施例5PCR扩增结果示意图。
HLA-DRB1*01:01分型检测扩增引物组：上游引物HLA-DRB1*01:01-F的序列见序列表SEQ ID:001；下游引物HLA-DRB1*01:01-R的序列见序列表SEQ ID:002；特异性探针HLA-DRB1*01:01-P的序列见序列表SEQ ID:003；
内标基因特异性扩增引物组：上游引物CFTR-F的序列为见序列表SEQ ID:004，下游CFTR-R的序列见序列表SEQ ID:005，特异性探针CFTR-P的序列见序列表SEQ ID:006。
具体实施方式
在这里专用的词“实施例”，作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。本发明实施例中性能指标测试，除非特别说明，采用本领域常规试验方法。应理解，本发明实施例中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明实施例公开的内容。
除非另有说明，否则本文使用的技术和科学术语具有本发明实施例所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义；作为本发明实施例中其它未特别注明的试验方法和技术手段均指本领域内普通技术人员通常采用的实验方法和技术手段。
本文所用的术语“基本”和“大约”用于描述小的波动。例如，它们可以是指小于或等于±5％，如小于或等于±2％，如小于或等于±1％，如小于或等于±0.5％，如小于或等于±0.2％，如小于或等于±0.1％，如小于或等于±0.05％。在本文中以范围格式表示或呈现的数值数据，仅为方便和简要起见使用，因此应灵活解释为不仅包括作为该范围的界限明确列举的数值，还包括该范围内包含的所有独立的数值或子范围。例如，“1～5％”的数值范围应被解释为不仅包括1％至5％的明确列举的值，还包括在所示范围内的独立值和子范围。因此，在这一数值范围中包括独立值，如2％、3.5％和4％，和子范围，如1％～3％、2％～4％和3％～5％等。这一原理同样适用于仅列举一个数值的范围。此外，无论该范围的宽度或所述特征如何，这样的解释都适用。
在本文中，包括权利要求书中，连接词，如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”等被理解为是开放性的，即是指“包括但不限于”。只有连接词“由……构成”和“由……组成”是封闭连接词。
为了更好的说明本发明内容，在下文的具体实施例中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在实施例中，对于本领域技术人员熟知的一些方法、手段、仪器、设备等未作详细描述，以便凸显本发明的主旨。
在不冲突的前提下，本发明实施例公开的技术特征可以任意组合，得到的技术方案属于本发明实施例公开的内容。
在一些实施方式中，一些实施例公开了用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测扩增引物组，包括上游引物、下游引物和特异性探针，具体包括：
上游引物HLA-DRB1*01:01-F，其序列为：
5’-CYTGTGGCAGCTTAAGTTTGAA-3’；其中，Y为简并碱基，代表C/T；设计区间为chr6:32552127-32552148；
下游引物HLA-DRB1*01:01-R，其序列为：
5’-CACTGTGAAGCTCTCACAAAC-3’；设计区间为chr6:32551896-32551916；
特异性探针HLA-DRB1*01:01-P，其序列为：
5’-FAM-CATCTATAACCAAGAGGAGTCCGTGCG-3’-BHQ1，设计区间为chr6:32552053-32552079。
一些实施例公开的用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测扩增引物组，还包括内标基因特异性扩增引物组，内标基因特异性扩增引物组包括：
上游引物CFTR-F，其序列为：
5’-GTAGGAAGTCACCAAAGCAGTACA-3’；
设计区间为chr7:117170949-117170972；
下游CFTR-R，其序列为：
5’-AGCTATTCTCATCTGCATTCCA-3’；
设计区间为chr7:117171123-117171144；
特异性探针CFTR-P，其序列为：
5’-CY5-CTATGACCCGGATAACAAGGAGGAACGC-3’-BHQ2；
设计区间为chr7:117171003-117171030。
表1列出了HLA-DRB1*01:01分型检测扩增引物组、内标基因特异性扩增引物组的数据。
表1扩增引物组数据列表
一些实施例公开的用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂，包括用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测扩增引物组。通常，检测试剂除了包含扩增引物组，还包括其他扩增试剂，例如PCR buffer、dNTP、热稳定性Taq聚合酶等。
一些实施例公开的用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂，分型检测试剂用于对人体DNA样本进行检测，人体DNA样本为血清样本，检测过程包括：
处理人体DNA样本；
利用分型检测试剂、人体DNA样本配置扩增反应体系；
扩增反应体系进行扩增反应；
根据扩增反应结果判定人体DNA样本是否携带有HLA-DRB1*01:01等位基因。
一些实施例公开的用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂盒，包括用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂。
一些实施例公开的用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂盒，分型检测试剂盒用于对人体DNA样本进行检测，人体DNA样本为血清样本，检测过程包括：
处理人体DNA样本；
利用分型检测试剂、人体DNA样本配置扩增反应体系；
扩增反应体系进行扩增反应；
根据扩增反应结果判定人体DNA样本是否携带有HLA-DRB1*01:01等位基因。
以下结合实施例对技术细节做进一步示例性说明。
实施例1
扩增引物的设计
(1)序列选取
发明人在研究检测HLA-DRB1*01:01等位基因的扩增引物组的过程中，依据中华骨髓库统计的中国人群常见及确认HLA等位基因表(CWD表，版本2.2)和IPD-IMGT/HLA数据库(版本号3.51，2023-01)，选取中国人群常见及确认HLA-DRB1等位基因中人群频率大于0.005％的亚型，共计57种亚型；考虑到其中6种亚型DRB1*12:10、DRB1*14:25、DRB1*13:50、DRB1*12:08、DRB1*12:05、DRB1*03:27在IPD-IMGT/HLA数据库中无相应参考基因组序列，且该6种亚型人群频率较低，故在设计时不纳入参考范围，因此共选取51种HLA-DRB1亚型的基因组序列，该基因组序列在IPD-IMGT/HLA数据库中的ID及其应对的亚型如表2所示，对该51种亚型进行alignment序列对齐比对，选取检测HLA-DRB1*01:01等位基因的扩增引物组的序列。
表2人群频率大于0.005％的51种HLA-DRB1亚型
| 序号 | 亚型ID | 亚型 | 序号 | 亚型ID | 亚型 |
| 1 | HLA00749 | DRB1*09:01 | 27 | HLA00696 | DRB1*04:10 |
| 2 | HLA00865 | DRB1*15:01 | 28 | HLA00665 | DRB1*01:02 |
| 3 | HLA00719 | DRB1*07:01 | 29 | HLA00839 | DRB1*14:07 |
| 4 | HLA00790 | DRB1*12:02 | 30 | HLA00871 | DRB1*15:04 |
| 5 | HLA00727 | DRB1*08:03 | 31 | HLA00693 | DRB1*04:07 |
| 6 | HLA00751 | DRB1*11:01 | 32 | HLA00687 | DRB1*04:02 |
| 7 | HLA00671 | DRB1*03:01 | 33 | HLA00735 | DRB1*08:09 |
| 8 | HLA00690 | DRB1*04:05 | 34 | HLA00694 | DRB1*04:08 |
| 9 | HLA00798 | DRB1*13:02 | 35 | HLA00759 | DRB1*11:06 |
| 10 | HLA14828 | DRB1*15:02 | 36 | HLA00850 | DRB1*14:18 |
| 11 | HLA00878 | DRB1*16:02 | 37 | HLA00876 | DRB1*16:01 |
| 12 | HLA00692 | DRB1*04:06 | 38 | HLA00804 | DRB1*13:07 |
| 13 | HLA00789 | DRB1*12:01 | 39 | HLA00723 | DRB1*08:01 |
| 14 | HLA02371 | DRB1*14:54 | 40 | HLA00799 | DRB1*13:03 |
| 15 | HLA00837 | DRB1*14:05 | 41 | HLA00844 | DRB1*14:12 |
| 16 | HLA00664 | DRB1*01:01 | 42 | HLA00755 | DRB1*11:03 |
| 17 | HLA00750 | DRB1*10:01 | 43 | HLA00728 | DRB1*08:04 |
| 18 | HLA00688 | DRB1*04:03 | 44 | HLA00842 | DRB1*14:10 |
| 19 | HLA00797 | DRB1*13:01 | 45 | HLA00834 | DRB1*14:02 |
| 20 | HLA00685 | DRB1*04:01 | 46 | HLA00838 | DRB1*14:06 |
| 21 | HLA00810 | DRB1*13:12 | 47 | HLA00873 | DRB1*15:06 |
| 22 | HLA00689 | DRB1*04:04 | 48 | HLA00782 | DRB1*11:28 |
| 23 | HLA00724 | DRB1*08:02 | 49 | HLA00802 | DRB1*13:05 |
| 24 | HLA00836 | DRB1*14:04 | 50 | HLA00765 | DRB1*11:11 |
| 25 | HLA00756 | DRB1*11:04 | 51 | HLA00833 | DRB1*14:01 |
| 26 | HLA00835 | DRB1*14:03 |
(2)引物设计位置选择
在进行HLA-DRB1*01:01等位基因特异性位点和引物设计区域的筛选过程中，因HLA-DRB1*01:01等位基因多态性主要位于2号和3号外显子，因此首先划定范围为HLA-DRB1基因2号和3号外显子区域为设计区域，然后通过上下游引物和探针的组合，使其在设计上能够区别于其他50种不同亚型；使得上下游引物和探针组合具有很好的特异性，排除上下游扩增引物组合对其它等位基因型，如常见的DRB1*09:01，DRB1*15:01，DRB1*07:01，DRB1*12:02，DRB1*03:01等基因型的结合，使得针对HLA-DRB1*01:01等位基因特异性位点的扩增引物组仅可以扩增HLA-DRB1*01:01等位基因；
同时考虑到上下游扩增引物组的灵敏性，确保能够扩增DRB1*01:01的所有已知25种DRB1*01:01亚型，如DRB1*01:01:01:01、DRB1*01:01:01:02、DRB1*01:01:01:03、DRB1*01:01:01:04、DRB1*01:01:01:05、DRB1*01:01:02、DRB1*01:01:07、DRB1*01:01:34、DRB1*01:01:38、DRB1*01:01:39、DRB1*01:01:40等，发明人在HLA-DRB1*01:01的正向扩增引物引入简并碱基Y，简并碱基Y表示C/T，提高扩增引物组合的灵敏性，以兼顾考虑到DRB1*01:01各种亚型之间的序列差异，能够对DRB1*01:01的所有25种亚型进行扩增。
(3)错配突变碱基
发明人根据DRB1*01:01等位基因特异性位点附近区域的特征和测试实验的结果，结合等位基因阻滞突变系统ARMS等方法，引入错配突变碱基，增强引物的特异性；例如，DRB1*01:02亚型与DRB1*01:01亚型的基因序列高度相似，虽然将DRB1*01:01等位基因的上下游引物设计在序列差异区域，如表3所示，DRB1*01:01在反向引物设计区域的3’端碱基为“ACCAAC”，DRB1*01:02在引物设计区域的3’端碱基为“CACAGC”，DRB1*01:02与DRB1*01:01在引物设计区域的3’端相差三个碱基，但经过试验发现，基于三个差异碱基的错配力依然无法将二者完全区分开，因此发明人在HLA-DRB1*01:01反向引物上的-4位置上引入错配突变C>A，如表3中HLA-DRB1*01:01-R扩增引物序列所示，错配突变碱基的引入不仅增强引物的特异性，又能够保证扩增效率。
表3 DRB1*01:02与DRB1*01:01序列差异比较
| 名称 | 序列(5’-3’) |
| HLA-DRB1*01:01参考引物序列 | CACTGTGAAGCTCTCACCAAC |
| HLA-DRB1*01:02参考引物序列 | CACTGTGAAGCTCTCCACAGC |
| HLA-DRB1*01:01-R扩增引物序列 | CACTGTGAAGCTCTCACAAAC |
通过以上方法设计得到的HLA-DRB1*01:01的扩增引物组合如表1所示，引物和探针的设计区间(参考人类hg19版本参考基因组)如表1所示，通过PCR扩增曲线其否起跳，来判断样本是否携带HLA-DRB1*01:01等位基因；同时反应体系中还加入检测内标基因的特异性引物与探针，确保反应体系中人DNA的加入，防止出现假阴性结果。内标基因的特异性引物与探针的序列和设计区间如表1所列。
实施例2
HLA-DRB1*01:01分型检测方法
实施例2中，利用用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂对人体DNA样本进行检测，人体DNA样本为血清样本，检测过程包括：
(1)处理人体DNA样本；
使用商业化的DNA提取试剂盒提取DNA样本，并使用分光光度计对提取的DNA样本进行浓度和纯度测定，要求待测DNA样本的OD260/OD280为1.6～2.0，DNA浓度大于等于1ng/μL；
(2)利用分型检测试剂、人体DNA样本配置扩增反应体系；
在PCR扩增管中分别加入HLA-DRB1*01:01的上游引物HLA-DRB1*01:01-F、下游引物HLA-DRB1*01:01-R、特异性探针HLA-DRB1*01:01-P，以及内标基因上游引物CFTR-F、下游引物CFTR-R及探针CFTR-P，并加入待测DNA样本、以及Taq Master Mix，反应体系的配置如表4所示，其中Taq Master Mix为商品化的扩增试剂，包含有PCR buffer、dNTP、热稳定性Taq聚合酶等；
表4实施例2扩增反应体系配置表
(3)进行PCR扩增反应
使用qPCR仪对配置好的扩增体系进行扩增，程序设定中，荧光基团分别选择FAM和CY5，其中FAM荧光对应HLA-DRB1*01:01的扩增，CY5荧光对应内标基因的扩增。设置反应体系为20μL，反应程序设置如表5所示，保存并运行程序；
表5实施例2qPCR反应程序设置列表
(4)结果分析
PCR扩增结果如图1所示，CY5通道和FAM通道均有明显的指数扩增曲线，且Ct≤33，可以判定实施例2中的待测DNA样本为HLA-DRB1*01:01等位基因型携带者。
对于HLA-DRB1*01:01等位基因型携带者，禁止使用奈韦拉平进行治疗。
实施例3
在本实施例3中，分别选取经一代测序验证过的两个HLA-DRB1*01:01和两个HLA-DRB1*01:02阳性临床DNA样本；
选取引入错配突变的引物HLA-DRB1*01:01-R和没有引入错配突变的引物作为反向引物，见表3中的HLA-DRB1*01:01-R扩增引物序列和HLA-DRB1*01:01参考引物序列，其他引物及反应体系参照实施例2，分别配置包含HLA-DRB1*01:01-R扩增引物序列和HLA-DRB1*01:01参考引物序列的两个扩增体系；
参照实施例2的方法配置两个扩增反应体系，对两个HLA-DRB1*01:01和两个HLA-DRB1*01:02阳性临床DNA样本分别进行PCR扩增检测；
扩增检测同时在八孔板上进行，检测结果如图2所示，所有样本的内标基因通道，即CY5通道，均有正常指数扩增曲线，引入错配突变的引物在对HLA-DRB1*01:02阳性样本进行检测时FAM通道无明显扩增曲线，而没有引入错配突变的引物组则有明显的扩增曲线；由此说明本实施例3引入错配突变的引物组可以明显降低假阳性的发生，提升引物探针组合的特异性，同时引入错位突变对HLA-DRB1*01:01的阳性样本的扩增效率基本无影响，从而保证了扩增引物组的灵敏性。
因此，发明人通过在扩增引物中引入错配突变碱基提高了引物的特异性，同时又保证了扩增效率高效性。
实施例4
选取十个具有HLA-DRB1明确亚型的质评样本DNA，样本编号分别为G1～G10，样本的HLA-DRB1基因型如表6所示，以十个质评样本DNA分别作为模板，参照实施例2的步骤，分别配制扩增反应体系并进行PCR上机扩增反应；
表6质评样本HLA-DRB1基因分型信息
| 样本编号 | HLA-DRB1亚型 |
| G1 | DRB1*12:02:01/DRB1*08:03:02 |
| G2 | DRB1*01:02:01/DRB1*04:01:01 |
| G3 | DRB1*03:01:01/DRB1*13:02:01 |
| G4 | DRB1*13:01:01/DRB1*07:01:01 |
| G5 | DRB1*11:02:01/DRB1*03:01:01 |
| G6 | DRB1*04:02:01/DRB1*04:02:01 |
| G7 | DRB1*12:02:01/DRB1*12:02:01 |
| G8 | DRB1*04:05:01/DRB1*12:01:01 |
| G9 | DRB1*13:05:01/DRB1*01:01:01 |
| G10 | DRB1*13:02:01/DRB1*14:54:01 |
实施例4的PCR扩增结果如图3所示，所有样本的内标基因通道CY5均有正常指数扩增曲线，而靶基因通道FAM只有G9样本有正常指数扩增曲线，Ct值为25左右，G1～G8和G10样本均无指数扩增曲线。
结果表明，实施例4的引物探针组合实现了对G9样本HLA-DRB1*01:01等位基因的特异性扩增，并且可以完全排除G2样本HLA-DRB1*01:02、G3样本HLA-DRB1*03:01等其他常见HLA-DRB1亚型的干扰。
实施例5
选取85个具有已知HLA-DRB1基因亚型的临床样本，该85个临床样本均具有全外显子组测序(WES)数据作为HLA-DRB1基因分型的数据支撑，参照实施例2中的步骤对85个临床样本进行检测，检测结果如图4和表7所示，在85个临床样本中共检测到HLA-DRB1*01:01阳性携带者样本8例，所有临床样本的检测结果Ct值及判定结果如表7所示，HLA-DRB1*01:01携带/未携带者分别判读为阳性/阴性。
结果表明，该85个临床样本中，与全外显子组测序结果相比，本发明申请对HLA-DRB1*01:01阳性携带的阳性检出率为100％，且非HLA-DRB1*01:01阳性携带基因型的样本均无明显指数扩增，特异性符合率为100％，验证了本发明的引物探针组合具有很好的灵敏性和特异性。
表7 HLA-DRB1*01:01阳性携带者临床样本检测结果与全外显子测序结果对比列表
本发明实施例公开的用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测扩增引物组、试剂和试剂盒，包括针对HLA-DRB1*01:01进行PCR扩增的上下游特异性引物组和一种特异性探针，采用荧光定量PCR方法，能够准确、快速、简便地检测待测样本是否具有HLA-DRB1*01:01的基因亚型，具有高通量、特异性高和简单快速的优点，可用于指导奈韦拉平的用药。
本发明实施例公开的技术方案和实施例中公开的技术细节，仅是示例性说明本发明的发明构思，并不构成对本发明实施例技术方案的限定，凡是对本发明实施例公开的技术细节所做的常规改变、替换或组合等，都与本发明具有相同的发明构思，都在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测扩增引物组，其特征在于，包括：
HLA-DRB1*01:01-F，其序列为：
5’-CYTGTGGCAGCTTAAGTTTGAA-3’；其中，Y为简并碱基，代表C/T；
HLA-DRB1*01:01-R，其序列为：
5’-CACTGTGAAGCTCTCACAAAC-3’；
HLA-DRB1*01:01-P，其序列为：
5’-FAM-CATCTATAACCAAGAGGAGTCCGTGCG-3’-BHQ1。
2.根据权利要求1所述的用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测扩增引物组，其特征在于，还包括内标基因特异性扩增引物组，所述内标基因特异性扩增引物组包括：
CFTR-F，其序列为：
5’-GTAGGAAGTCACCAAAGCAGTACA-3’；
CFTR-R，其序列为：
5’-AGCTATTCTCATCTGCATTCCA-3’；
CFTR-P，其序列为：
5’-CY5-CTATGACCCGGATAACAAGGAGGAACGC-3’-BHQ2。
3.用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的扩增引物组。
4.根据权利要求3所述的用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂，其特征在于，所述分型检测试剂用于对人体DNA样本进行检测。
5.根据权利要求4所述的用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂，其特征在于，所述人体DNA样本为血清样本。
6.根据权利要求4所述的用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂，其特征在于，利用分型检测试剂对人体DNA样本的检测过程包括：
处理人体DNA样本；
利用分型检测试剂、人体DNA样本配置扩增反应体系；
扩增反应体系进行扩增反应；
根据扩增反应结果判定人体DNA样本是否携带有HLA-DRB1*01:01等位基因。
7.用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的分型检测试剂。
8.根据权利要求7所述的用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂盒，其特征在于，所述分型检测试剂盒用于对人体DNA样本进行检测。
9.根据权利要求7所述的用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂盒，其特征在于，所述人体DNA样本为血清样本。
10.根据权利要求7所述的用于指导奈韦拉平用药的HLA-DRB1*01:01分型检测试剂盒，其特征在于，利用分型检测试剂盒对人体DNA样本的检测过程包括：
处理人体DNA样本；
利用分型检测试剂、人体DNA样本配置扩增反应体系；
扩增反应体系进行扩增反应；
根据扩增反应结果判定人体DNA样本是否携带有HLA-DRB1*01:01等位基因。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311844751.7A CN117721253A (zh) | 2023-12-29 | 2023-12-29 | 用于指导奈韦拉平用药的hla-drb1-01:01分型检测扩增引物组、试剂、试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311844751.7A CN117721253A (zh) | 2023-12-29 | 2023-12-29 | 用于指导奈韦拉平用药的hla-drb1-01:01分型检测扩增引物组、试剂、试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117721253A true CN117721253A (zh) | 2024-03-19 |
Family
ID=90206957
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311844751.7A Pending CN117721253A (zh) | 2023-12-29 | 2023-12-29 | 用于指导奈韦拉平用药的hla-drb1-01:01分型检测扩增引物组、试剂、试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117721253A (zh) |
-
2023
- 2023-12-29 CN CN202311844751.7A patent/CN117721253A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108048531B (zh) | 一种高灵敏度检测稀有突变的超阻滞荧光定量pcr方法 | |
| CN108866207B (zh) | 新型hiv-1耐药检测方法的建立及其应用 | |
| US20150211076A1 (en) | Polynucleotide primers | |
| US20060269925A1 (en) | Methods for determining glutathione S-transferase theta-1 genotype | |
| CN106755360B (zh) | 用于检测人类cyp2d6基因多态性的核酸、试剂盒及方法 | |
| CN111575373B (zh) | 基于多重pcr的靶向高通量测序的急性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒及方法 | |
| CN108456721B (zh) | 同步检测基因突变和甲基化的方法及其应用 | |
| CN111321227A (zh) | 白血病mef2d基因及znf384基因的多重荧光rt-pcr检测方法 | |
| CN110408697A (zh) | Npm1基因突变分型检测方法及试剂盒 | |
| US9879314B2 (en) | Method for detecting HLA-A*31:01 allele | |
| CN113584147A (zh) | 一种用于指导精神病用药的基因多态性检测试剂盒 | |
| CN113151441A (zh) | 一种用于β受体拮抗剂用药的基因检测试剂盒及其方法和应用 | |
| CN117305437A (zh) | 一种人运动神经元存活基因的检测引物探针组合、试剂盒及检测方法 | |
| CN110295218B (zh) | 量化靶基因的突变型等位基因负担的方法 | |
| Pichon et al. | Analysis and annotation of DNA methylation in two nonhuman primate species using the Infinium Human Methylation 450K and EPIC BeadChips | |
| EP3679155B1 (en) | Method to confirm variants in ngs panel testing by snp genotyping | |
| CN110863040A (zh) | 用于荧光定量pcr检测cyp3a5基因多态性的方法 | |
| CN115961037A (zh) | 一种检测mpn变异位点的试剂盒及检测方法 | |
| CN117721253A (zh) | 用于指导奈韦拉平用药的hla-drb1-01:01分型检测扩增引物组、试剂、试剂盒 | |
| CN114592054A (zh) | 用于哮喘个体化用药基因检测的扩增引物组及探针、检测试剂盒、使用方法 | |
| CN110029162B (zh) | 一种用于检测系统性红斑狼疮易感性位于非编码基因区的snp标志物及其应用 | |
| TW201533244A (zh) | 檢測酒精代謝基因之方法及套組 | |
| CN114015766A (zh) | 一种心脑血管疾病精准用药的检测试剂盒 | |
| CN106811537A (zh) | 一种检测表皮生长因子受体基因t790m低频突变引物及其应用 | |
| CN106566880A (zh) | 遗传性耳聋基因突变检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |