CN114015766A - 一种心脑血管疾病精准用药的检测试剂盒 - Google Patents
一种心脑血管疾病精准用药的检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114015766A CN114015766A CN202111366510.7A CN202111366510A CN114015766A CN 114015766 A CN114015766 A CN 114015766A CN 202111366510 A CN202111366510 A CN 202111366510A CN 114015766 A CN114015766 A CN 114015766A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- upstream
- fluorescent probe
- detecting
- downstream primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 title claims abstract description 22
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 title claims abstract description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 title abstract description 29
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title abstract description 21
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 53
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 27
- 108091006731 SLCO1B1 Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102100027233 Solute carrier organic anion transporter family member 1B1 Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 101000690425 Homo sapiens Type-1 angiotensin II receptor Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102100026803 Type-1 angiotensin II receptor Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 72
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 57
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 claims description 36
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 23
- 108010026925 Cytochrome P-450 CYP2C19 Proteins 0.000 claims description 13
- 102100029363 Cytochrome P450 2C19 Human genes 0.000 claims description 13
- 101150037123 APOE gene Proteins 0.000 claims description 8
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 claims description 8
- 108010000543 Cytochrome P-450 CYP2C9 Proteins 0.000 claims description 8
- 102100029358 Cytochrome P450 2C9 Human genes 0.000 claims description 8
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 6
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 6
- 108010001237 Cytochrome P-450 CYP2D6 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100021704 Cytochrome P450 2D6 Human genes 0.000 claims description 5
- 101000892264 Homo sapiens Beta-1 adrenergic receptor Proteins 0.000 claims description 5
- 102000009645 Mitochondrial Aldehyde Dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 5
- 108010009513 Mitochondrial Aldehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 5
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 5
- 102000017920 ADRB1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100034033 Alpha-adducin Human genes 0.000 claims description 4
- -1 BHQ1 Chemical compound 0.000 claims description 4
- 101000799076 Homo sapiens Alpha-adducin Proteins 0.000 claims description 4
- 101000606878 Homo sapiens Platelet endothelial aggregation receptor 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000605122 Homo sapiens Prostaglandin G/H synthase 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 108091008067 NPPA-AS1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100039710 Platelet endothelial aggregation receptor 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100038277 Prostaglandin G/H synthase 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 101000629598 Rattus norvegicus Sterol regulatory element-binding protein 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims description 4
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 claims description 2
- GYDJEQRTZSCIOI-UHFFFAOYSA-N Tranexamic acid Chemical compound NCC1CCC(C(O)=O)CC1 GYDJEQRTZSCIOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102200017290 rs429358 Human genes 0.000 claims description 2
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 101150096316 5 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101150044523 ITGB3 gene Proteins 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 92
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 21
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 101001015004 Homo sapiens Integrin beta-3 Proteins 0.000 description 3
- 102100032999 Integrin beta-3 Human genes 0.000 description 3
- 102220632110 Solute carrier organic anion transporter family member 1B1_E156G_mutation Human genes 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 2
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005552 B01AC04 - Clopidogrel Substances 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SNIOPGDIGTZGOP-UHFFFAOYSA-N Nitroglycerin Chemical compound [O-][N+](=O)OCC(O[N+]([O-])=O)CO[N+]([O-])=O SNIOPGDIGTZGOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000006 Nitroglycerin Substances 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- GKTWGGQPFAXNFI-HNNXBMFYSA-N clopidogrel Chemical compound C1([C@H](N2CC=3C=CSC=3CC2)C(=O)OC)=CC=CC=C1Cl GKTWGGQPFAXNFI-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 2
- 229960003009 clopidogrel Drugs 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 229960003711 glyceryl trinitrate Drugs 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101001002634 Homo sapiens Interleukin-1 alpha Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 102100020881 Interleukin-1 alpha Human genes 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000003276 anti-hypertensive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 239000002220 antihypertensive agent Substances 0.000 description 1
- 229940127088 antihypertensive drug Drugs 0.000 description 1
- 229940127218 antiplatelet drug Drugs 0.000 description 1
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 description 1
- 230000006793 arrhythmia Effects 0.000 description 1
- 239000002876 beta blocker Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 102200087122 rs11045819 Human genes 0.000 description 1
- 102200087157 rs4149056 Human genes 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于医学检验技术领域,提供了一种心脑血管疾病精准用药的检测试剂盒,包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的SLCO1B1*1b分型荧光探针或/和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的AGTR1分型荧光探针。本发明以错配探针结合熔解曲线分析技术为基础,通过检测基因多态性确定心脑血管疾病患者用药的适应性,可为心脑血管患者提供全面的个体化用药指导,与现有检测手段相比,本发明的在熔解曲线分析技术的基础上结合错配探针,特异性高、有效避免假阳性或假阴性的出现,且操作简单、周期短、成本低。
Description
技术领域
本发明属于医学检验技术领域,具体涉及一种心脑血管疾病精准用药的检测试剂盒。
背景技术
心脑血管疾病是全球范围内死亡的主要原因,并且在发达国家和发展中国家,心脑血管疾病的患病率仍在不断上升。根据世界卫生组织的报告,2016年约有1790万人死于心脏病和中风,占全部死亡人数的31%,到2030年预计2360万人死于心脑血管疾病。目前通过药物维持仍是治疗心脑血管患者重要的方式,但临床上常规使用的抗血小板药、降压药、降脂药等心脑血管药物普遍存在个体差异,药物疗效差、出现不良反应的情况时有发生。因此进行用药前基因检测,预测患者对药物的疗效及不良反应,指导不同患者精准用药具有十分重要的临床意义。
基因多态性是心脑血管疾病患者药物疗效个体差异和产生不良反应的主要原因。如硝酸甘油作为抗心绞痛的急救药物,但携带有ALDH2突变的患者硝酸脂酶活性会降低10倍,从而使硝酸甘油无法产生一氧化氮,因此难以缓解心脏缺血的症状;抗血小板药物阿司匹林也并非对所有的血栓患者都有效果,部分患者即使服用阿司匹林也不能抑制血小板的聚集和预防血栓形成;美国FDA在2010年就曾推荐在使用氯吡格雷前应进行基因检测,并提示氯吡格雷抵抗与CYP2C19功能缺失相关;因SLCO1B1和APOE单核苷酸多态性(SNP)存在,他汀类降脂药物在不同人群中存在用药效果差异及不良反应;降压药物β受体阻断剂敏感性及副作用与CYP2D6和ADRB1基因多态性相关。目前市场上仅有针对一种药物或几种高血压药物精准用药产品,但心脑血管病人大多需要多种药物联合治疗,目前尚未有针对心脑血管抗心绞痛、抗血小板、降脂、降压、抗心律失常多种药物检测的产品。
目前市场上针对心脑血管用药指导的产品采用技术主要有Sanger测序、基因芯片、荧光PCR-扩增曲线等。其中Sanger测序操作复杂、检测时间长且检测成本高;基因芯片法准确性低、易污染、检测成本高;荧光PCR-扩增曲线法虽操作简单、成本较低,但用于基因多态性检测准确性较低。
另外,传统的荧光PCR-熔解曲线分析法原理是利用不同DNA差异具有不同Tm值(DNA的双螺旋结构降解一半时的温度)的特征,在PCR扩增反应之后,通过逐步提高PCR反应产物的温度,使具有不同Tm值的双链DNA依次变性为单链DNA,从而产生不同形状的熔解曲线,以此来区分不同DNA序列。但除靶标位点外, 探针上其它SNP位点的存在同样影响DNA双链Tm值而导致不同的熔解曲线。据研究发现SNP位点在人类基因组中极为常见,人类所有群体中存在大约1500万个SNP位点(频率大于1%),平均约每300-600bp存在一个SNP位点(频率大于1%)。因此紧邻靶标位点的上下游可能存在其他SNP位点,如与他汀药物副作用相关的SLCO1B1*1b位点,此位点上游4bp处存在突变频率为11.457%的SNP位点(rs11045819,数据来源UCSC)若忽略此类突变频率较大的SNP存在,不可避免假阳性或假阴性出现。然而目前市面上已有利用熔解曲线SNP分型的相关检测产品的在探针设计上未考虑其它SNP位点的存在,这将直接导致假阳性或假阴性事件的发生。
发明内容
针对利用熔解曲线SNP分型的现有检测产品易导致假阳性或假阴性发生等问题,本发明提供一种心脑血管疾病精准用药的检测试剂盒,在非检测高频SNP位点设置错配探针,特异性高、有效避免假阳性或假阴性的出现,且操作简单、周期短、成本低。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案。
一种SLCO1B1*1b分型荧光探针,其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示,5’端和3’端分别连接报告基团和猝灭基团。
一种AGTR1分型荧光探针,其核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示,5’端和3’端分别连接报告基团和猝灭基团。
上述报告基团选自ROX、FAM、HEX、VIC、NED、TET、JOE、CY3、CY5、CY7或AMCA中的一种。
上述猝灭基团选择TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL或QYS-7中的一种。
所述报告基团和猝灭基团的具体组合可以根据检测波长进行选择。
一种检测SLCO1B1*1b分型的试剂盒,包括上述SLCO1B1*1b分型荧光探针、核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示的下游引物。
一种检测AGTR1分型的试剂盒,包括上述AGTR1分型荧光探针、核苷酸序列如SEQID NO: 5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO: 6所示的下游引物。
一种心脑血管疾病精准用药的检测试剂盒,包括上述SLCO1B1*1b分型荧光探针和上述AGTR1分型荧光探针中的至少一种。
优选地,上述试剂盒还包括如SEQ ID NO: 3-4所示的SLCO1B1*1b上/下游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO: 5-6所示的AGTR1上/下游引物中的至少一种。
优选地,上述试剂盒还包括相应SNP基因突变/野生型或杂合型DNA的质控样品中的一种。所述突变型是指SNP位点均发生突变的DNA型,所述杂合型是指SNP位点只有一个碱基发生突变的DNA型,所述野生型是指SNP位点均未突变的DNA型。
优选地,所述检测试剂盒还包括检测ALDH2、ITGB3、IL1β、PTGS1、PEAR1、CYP2C19*2、CYP2C19*17、CYP2C19*3、SLCO1B1*5、APOE(T388C)、APOE(C526T)、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2D6*10、ADRB1、ACE(I/D)、ADD1和NPPA-AS1中的至少一种基因分型的荧光探针和上/下游引物。
更优选地,所述检测ALDH2基因分型的荧光探针和上/下游引物核苷酸序列如SEQID NO: 7-9所示。
更优选地,所述检测ITGB3基因分型的荧光探针和上/下游引物核苷酸序列如SEQID NO: 10-12所示。
更优选地,所述检测IL1β基因分型的荧光探针和上/下游引物核苷酸序列如SEQID NO: 13-15所示。
更优选地,所述检测PTGS1基因分型的荧光探针和上/下游引物核苷酸序列如SEQID NO: 16-18所示。
更优选地,所述检测PEAR1基因分型的荧光探针和上/下游引物核苷酸序列如SEQID NO: 19-21所示。
更优选地,所述检测CYP2C19*2基因分型的荧光探针和上/下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 22-24所示。
更优选地,所述检测CYP2C19*17基因分型的荧光探针和上/下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 25-27所示。
更优选地,所述检测CYP2C19*3基因分型的荧光探针和上/下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 28-30所示。
更优选地,所述检测SLCO1B1*5基因分型的荧光探针和上/下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 31-33所示。
更优选地,所述检测APOE(T388C)基因分型的荧光探针和上/下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 34-36所示。
更优选地,所述检测APOE(C526T)基因分型的荧光探针和上/下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 34、37-38所示。
更优选地,所述检测CYP2C9*2基因分型的荧光探针和上/下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 39-41所示。
更优选地,所述检测CYP2C9*3基因分型的荧光探针和上/下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 42-44所示。
更优选地,所述检测CYP2D6*10基因分型的荧光探针和上/下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 45-47所示。
更优选地,所述检测ADRB1基因分型的荧光探针和上/下游引物核苷酸序列如SEQID NO: 47-50所示。
更优选地,所述检测ACE(I/D)基因分型的荧光探针和上/下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 51-53所示。
更优选地,所述检测ADD1基因分型的荧光探针和上/下游引物核苷酸序列如SEQID NO: 54-56所示。
更优选地,所述检测NPPA-AS1基因分型的荧光探针和上/下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 57-59所示。
本发明具有以下优点:
本发明以错配探针结合熔解曲线分析技术为基础,通过检测基因多态性确定心脑血管疾病患者用药的适应性,可为心脑血管患者提供全面的个体化用药指导,与现有检测手段相比,本发明的在熔解曲线分析技术的基础上结合错配探针,特异性高、有效避免假阳性或假阴性的出现,且操作简单、周期短、成本低。
附图说明
图1探针1b-P1体系4种样本熔解曲线图;
图2探针1b-P2体系4种样本熔解曲线图;
图3探针1b-P3体系4种样本熔解曲线图;
图4探针AGTR1-P1体系4种样本熔解曲线图;
图5探针AGTR1-P2体系4种样本熔解曲线图;
图6探针AGTR1-P3体系4种样本熔解曲线图;
图7为ALDH2(rs671)杂合型核酸样本检测结果;
图8为ITGB3 (rs5918)、IL1β (rs16944)、PTGS1 (10306114)、PEAR1(rs12041331)各位点杂合型核酸样本检测结果;
图9为CYP2C19*2 (rs4244285)、CYP2C19*17 (rs12248560)、CYP2C19*3(rs4986893)各位点杂合型核酸样本检测结果;
图10为SLCO1B1*5 (rs4149056)、SLCO1B1*1b (rs72559745)、APOE (T388C,rs429358)、APOE (C526T, rs7412)各位点杂合型核酸样本检测结果;
图11为CYP2C9*2 (rs1799853)、CYP2C9*3 (rs1057910)、AGTR1 (rs5186)各位点杂合型核酸样本检测结果;
图12为CYP2D6*10 (rs1065852)、ADRB1 (rs1801253)各位点杂合型核酸样本检测结果;
图13为ACE (rs4646994)杂合型核酸样本检测结果;
图14为ADD1 (rs4961)杂合型核酸样本检测结果;
图15为NPPA-AS1 (rs5065)杂合型核酸样本检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明,但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 SLCO1B1*1b位点引物、错配探针的设计及筛选
1. 引物的设计
根据SLCO1B1*1b(rs72559745)设计引物序列如下:
上游引物序列:5' -ATAATGGTGCAAATAAAGGGGA-3';Tm 58.6℃
下游引物序列:5' - TGTCAATATTAATTCTTACCTTTTCCC-3';Tm 59.7℃;
上述引物进行商业合成,上游引物配制为0.67μM的溶液,下游引物配制为4μM的溶液。
2. 错配探针的设计
在靶标位点上下游各20bp范围进行SNP分析;寻找到一处等位基因频率大于0.1%的SNP位点,并在设计探针时引入错配T或G,探针Tm值65-70℃,探针距离同方向引物40bp。本次设计3条探针进行筛选及验证错配探针的必要性,探针序列如下:
错配为G探针序列:
1b-P1:5'-ROX-TTCAGAGCATCAgCTGgGATAGTGGGAA-BHQ2-3';Tm 67.4℃
错配为T探针序列:
1b-P2:5'-ROX-TTCAGAGCATCAtCTGgGATAGTGGGAA-BHQ2-3';Tm 65.3℃
未设错配探针序列:
1b-P3:5'-ROX-TTCAGAGCATCAcCTGgGATAGTGGGAA-BHQ2-3';Tm 67.2℃。
3. 模板准备
准备靶标位点/SNP位点均野生(样本a)、靶标位点/SNP位点均突变(样本b)、靶标位点野生/SNP位点突变(样本c)、靶标位点突变/SNP位点野生(样本d)四种样本核酸,稀释至10ng/μL备用。
4. 反应体系及程序
单孔体系配制如下:
上下游引物各1μL;10×PCR Buffer 2.5μL;四种模板DNA各5μL;2.5mM dNTP 2μL;5U/μL Taq Hot Star Version 0.2μL;用无核酸酶水补齐至20μL;
按如下程序上机:PCR扩增程序95℃预变性300s,95℃变性20s,58℃退火20s,76℃延伸25s,共50个循环,扩增程序结束后直接运行收集熔解曲线程序95℃变性1min,37℃降温180s,45-85℃连续升温(升温速率0.06℃/s)。
5. 结果与分析
以4种样本(样本a、b、c、d)为模板,含有3种探针的体系获得熔解曲线和对应Tm值如图1-3所示:图3中,探针1b-P3体系,样本d和样本a虽有Tm值的差异,但样本a和样本b 熔解曲线Tm值基本无差异,即若未使用错配探针,样本b会被误判成rs72559745野生型,从而导致假阴性出现。对比图1和图2两种错配探针,探针1b-P2体系中,样本a和样本c/样本b和样本d两组熔解曲线△Tm≧2℃,且样本a和样本b熔解曲线Tm值较接近,容易出现判读错误;而探针1b-P1体系,样本a和样本c/样本b和样本d两组熔解曲线△Tm≦1℃,此体系中探针受rs11045819影响较小,可较容易区分a/c和b/d样本,因此该体系选取探针1b-P1。
实施例2 AGTR1位点引物、错配探针的设计及筛选
1. 引物的设计
根据AGTR1(rs5186)设计引物序列如下:
上游引物序列:5' -AAATCCCACTCAAACCTTTCAAC-3';Tm 59.4℃
下游引物序列:5' -TAGAAAAGTCGGTTCAGTCCACATA-3';Tm 60.3℃;
上述引物进行商业合成,上游引物配制为0.67μM的溶液,下游引物配制为4μM的溶液。
2. 错配探针的设计
在靶标位点上下游各20bp范围进行SNP分析;寻找到一处等位基因频率大于0.1%的SNP位点,并在设计探针时引入错配T或C,探针Tm值65-70℃,探针距离同方向引物40bp。本次设计3条探针进行筛选及验证错配探针的必要性,探针序列如下:
错配为T探针序列:
AGTR1-P1:5'-ROX-CTGATACCAAATGAGCcTTAGCTtCTTTTCAG-BHQ2-3';Tm 65.5℃
错配为C探针序列:
AGTR1-P2:5'-ROX-CTGATACCAAATGAGCcTTAGCTcCTTTTCAG-BHQ2-3';Tm 67.1℃
未设错配探针序列:
AGTR1-P3:5'-ROX-CTGATACCAAATGAGCcTTAGCTaCTTTTCAG-BHQ2-3';Tm 63.8℃。
3. 模板准备
准备靶标位点/SNP位点均野生(样本a)、靶标位点/SNP位点均突变(样本b)、靶标位点野生/SNP位点突变(样本c)、靶标位点突变/SNP位点野生(样本d)四种样本核酸,稀释至10ng/μL备用。
4. 反应体系及程序
单孔体系配制如下:
上下游引物各1μL;10×PCR Buffer 2.5μL;四种模板DNA各5μL;2.5mM dNTP 2μL;5U/μL Taq Hot Star Version 0.2μL;用无核酸酶水补齐至20μL;
按如下程序上机:PCR扩增程序95℃预变性300s,95℃变性20s,58℃退火20s,76℃延伸25s,共50个循环,扩增程序结束后直接运行收集熔解曲线程序95℃变性1min,37℃降温180s,45-85℃连续升温(升温速率0.06℃/s)。
5. 结果与分析
以4种样本(样本a、b、c、d)为模板,含有3种探针的体系获得熔解曲线和对应Tm值如图4-6所示:图6中,探针AGTR1-P3体系,样本b1/d1和样本a1/c1的 Tm值的差异不如探针AGTR1-P1体系大,若Tm值稍有偏移将会导致靶标阴阳性难以区分,从而会有假阳性或假阴性事件的发生,因此舍弃 AGTR1-P3探针;对比图4和图5两种错配探针,探针AGTR1-P2体系中,样本a1和c1以及样本b1和d1两组熔解曲线△Tm≧3℃,说明此体系受rs5187影响较大,且样本c1和样本d1区分度不如AGTR1-P1体系区分度大;而探针AGTR1-P1体系,样本a1/c1和样本b1/d1两组熔解曲线△Tm≦1℃,此体系中探针受rs5187影响较小,可较容易区分a1/c1和b1/d1样本,因此该体系选取探针AGTR1-P1。
实施例3 心脑血管疾病精准用药的检测试剂盒及应用
按照下表1中序列合成各上、下游引物和探针,装入1mL EP管,与10×PCR Buffer、dNTP、Taq Hot Star Version、无核酸酶水和各基因的四种核酸样品(靶标位点/SNP位点均野生(样本a)、靶标位点/SNP位点均突变(样本b)、靶标位点野生/SNP位点突变(样本c)、靶标位点突变/SNP位点野生(样本d))组成心脑血管疾病精准用药的检测试剂盒。
表1 试剂盒各基因上、下游引物和探针的核苷酸序列
对1例心脑血管疾病患者外周血,使用DNA提取试剂盒提取DNA,并Nandrop定量为532ng/μL,稀释至10ng/μL备用,采用上述检测试剂盒按照表2加样,然后分别加入5μL待测样本、阴性质控品或各位点的杂合突变型质控品,以无核酸酶水补足至20μL,重复3管。
表2 检测体系配制
按如下程序进行荧光PCR:95℃预变性300s;95℃变性20s,58℃退火20s,76℃延伸25s,共50个循环; 95℃变性1min,37℃降温180s,45-85℃连续升温(升温速率0.06℃/s)收集荧光信号。各杂合突变型质控品的熔解曲线如图7-15所示。根据样本的Tm值并参考表3中结果判读标准对样本进行判读,结果如表4所示。临床医生可根据以上检测结果对该心脑血管疾病患者进行精准用药。
表3 各基因分型结果判读标准
表4 样本各基因分型结果
序列表
<110> 银丰基因科技有限公司
银丰生物工程集团有限公司
<120> 一种心脑血管疾病精准用药的检测试剂盒
<130> 20211116
<160> 59
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1B1*1b-P1
<400> 1
ttcagagcat cagctgggat agtgggaa 28
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AGTR1-P1
<400> 2
ctgataccaa atgagcctta gcttcttttc ag 32
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1B1*1b-F
<400> 3
ataatggtgc aaataaaggg ga 22
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1B1*1b-R
<400> 4
tgtcaatatt aattcttacc ttttccc 27
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AGTR1-F
<400> 5
aaatcccact caaacctttc aac 23
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AGTR1-R
<400> 6
tagaaaagtc ggttcagtcc acata 25
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ALDH2-F
<400> 7
gtttggagcc cagtcaccc 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ALDH2-R
<400> 8
ccagcaggtc ccacactca 19
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ALDH2-P
<400> 9
tttgggctgc aggcatacac tgaagtcaaa 30
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITGB3-F
<400> 10
gattatccca ggaaagacca ca 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITGB3-R
<400> 11
attctggggc acagttatcc tt 22
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITGB3-P
<400> 12
aggtccctgc ctccgggctc acct 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL1β-F
<400> 13
aatactggat tttcccacgt taga 24
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL1β-R
<400> 14
catccatgag attggctagg g 21
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL1β-P
<400> 15
tgactgcctc gggagctctc tgtca 25
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PTGS1-F
<400> 16
gcggtggatg tragtctagc tac 23
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PTGS1-R
<400> 17
aatcggctta atarcaaaaa cc 22
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PTGS1-P
<400> 18
acctactaca tgctgggcac tgcac 25
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PEAR1-F
<400> 19
agctggaagg gagcccgt 18
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PEAR1-R
<400> 20
gattagagtt cctggtggac aagag 25
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PEAR1-P
<400> 21
agggttctgc tgtctcactt ccgtcaccct 30
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2C19*2-F
<400> 22
agagcttggc atattgtatc tatrcc 26
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2C19*2-R
<400> 23
atgtccatcg attcttggtg ttc 23
<210> 24
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2C19*2-P
<400> 24
ctatgggttc ccggttaata atcaatgata g 31
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2C19*17-F
<400> 25
gggctgtttt ccttagataa ataagt 26
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2C19*17-R
<400> 26
cctaaaaaaa cacgtgaagg ca 22
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2C19*17-P
<400> 27
caggtgtctt ctgttctcaa agcatctctg 30
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2C19*3-F
<400> 28
attgtttcca atcatttagc ttcac 25
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2C19*3-R
<400> 29
cttagaagcc tgatctatat tggga 25
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2C19*3-P
<400> 30
tattacctgg atccagtggg tgcttacaat c 31
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1B1*5-F
<400> 31
agcagcataa gaatggacta ataca 25
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1B1*5-R
<400> 32
caaaagtaga caaagggaaa gtgat 25
<210> 33
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1B1*5-P
<400> 33
accctacatg tggatatatg cgttcatggg t 31
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 388-F
<400> 34
cggaactgga ggaacaactg a 21
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 388-R
<400> 35
ttctgcaggt catcggcat 19
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 388-P
<400> 36
cggcggagga cgtgcgcggc cg 22
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 526-R
<400> 37
ccccggcctg gtacactgc 19
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 526-P
<400> 38
ttaatgacct gcagaagcgc ctggctaa 28
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2C9*2-F
<400> 39
ggaggatgga aaacagagac ttac 24
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2C9*2-R
<400> 40
agctaacaac caggactcat aatg 24
<210> 41
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2C9*2-P
<400> 41
agcacctctt gaacacggtc ctcaatgct 29
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2C9*3-F
<400> 42
ccttcatgat tcatataccc ctga 24
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2C9*3-R
<400> 43
ggtgatggta gaggtttaaa aatga 25
<210> 44
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2C9*3-P
<400> 44
tcaatgcacg aggtccagag ataccttga 29
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2D6*10-F
<400> 45
ccakttggta gtgaggcagg t 21
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2D6*10-R
<400> 46
atgcagcagg ttgcccag 18
<210> 47
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2D6*10-P
<400> 47
tattgggctg cacgctaccc accagaata 29
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ADRB1-F
<400> 48
tcgtcttctt caactggctg gg 22
<210> 49
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ADRB1-R
<400> 49
gtctccgtrg gtcgcgtg 18
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ADRB1-P
<400> 50
aggccttcca gcgactgctc tgc 23
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ACE-F
<400> 51
ggggactctg taagccactg c 21
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ACE-R
<400> 52
cccataacag gtcttcatat ttcc 24
<210> 53
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ACE-P
<400> 53
cgaaaccaca taaaagtgac tgtatcacg 29
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ADD1-F
<400> 54
cttgctcccc actcagacac a 21
<210> 55
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ADD1-R
<400> 55
acgcagacac cggacgaga 19
<210> 56
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ADD1-P
<400> 56
aggactgctt ccattctgcc cttcct 26
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AS1-F
<400> 57
cagcttagat gggatgatca caa 23
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AS1-R
<400> 58
gtaatcaagt tcagaggatg ggc 23
<210> 59
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AS1-P
<400> 59
tttggctgtt atcttcggta ctgcaaa 27
Claims (9)
1.一种SLCO1B1*1b分型荧光探针,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示,5’端和3’端分别连接报告基团和猝灭基团。
2.一种AGTR1分型荧光探针,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示,5’端和3’端分别连接报告基团和猝灭基团。
3.根据权利要求1或2任一所述的分型荧光探针,其特征在于,其特征在于,所述报告基团选自ROX、FAM、HEX、VIC、NED、TET、JOE、CY3、CY5、CY7或AMCA中的一种;
所述上述猝灭基团选择TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL或QYS-7中的一种。
4.一种检测SLCO1B1*1b分型的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1或3所述的SLCO1B1*1b分型荧光探针、核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示的下游引物。
5.一种检测AGTR1分型的试剂盒,其特征在于,包括权利要求2或3所述的AGTR1分型荧光探针、核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO: 6所示的下游引物。
6.一种心脑血管疾病精准用药的检测试剂盒,其特征在于,包括权利要求1或3所述的SLCO1B1*1b分型荧光探针和权利要求2或3所述AGTR1分型荧光探针中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒,其特征在于,还包括如SEQ ID NO: 3-4所示的SLCO1B1*1b上/下游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO: 5-6所示的AGTR1上/下游引物中的至少一种。
8.根据权利要求6所述的检测试剂盒,其特征在于,还包括
核苷酸序列如SEQ ID NO: 7-9所示的检测ALDH2基因分型的荧光探针和上/下游引物,
核苷酸序列如SEQ ID NO: 10-12所示的检测ITGB3基因分型的荧光探针和上/下游引物,
核苷酸序列如SEQ ID NO: 13-15所示的检测IL1β基因分型的荧光探针和上/下游引物,
核苷酸序列如SEQ ID NO: 16-18所示的检测PTGS1基因分型的荧光探针和上/下游引物,
核苷酸序列如SEQ ID NO: 19-21所示的检测PEAR1基因分型的荧光探针和上/下游引物,
核苷酸序列如SEQ ID NO: 22-24所示的检测CYP2C19*2基因分型的荧光探针和上/下游引物,
核苷酸序列如SEQ ID NO: 25-27所示的检测CYP2C19*17基因分型的荧光探针和上/下游引物,
核苷酸序列如SEQ ID NO: 28-30所示的检测CYP2C19*3基因分型的荧光探针和上/下游引物,
核苷酸序列如SEQ ID NO: 31-33所示的检测SLCO1B1*5基因分型的荧光探针和上/下游引物,
核苷酸序列如SEQ ID NO: 34-36所示的检测APOE(T388C)基因分型的荧光探针和上/下游引物,
核苷酸序列如SEQ ID NO: 34、37-38所示的检测APOE(C526T)基因分型的荧光探针和上/下游引物,
核苷酸序列如SEQ ID NO: 39-41所示的检测CYP2C9*2基因分型的荧光探针和上/下游引物,
核苷酸序列如SEQ ID NO: 42-44所示的检测CYP2C9*3基因分型的荧光探针和上/下游引物,
核苷酸序列如SEQ ID NO: 45-47所示的检测CYP2D6*10基因分型的荧光探针和上/下游引物,
核苷酸序列如SEQ ID NO: 47-50所示的检测ADRB1基因分型的荧光探针和上/下游引物,
核苷酸序列如SEQ ID NO: 51-53所示的检测ACE(I/D)基因分型的荧光探针和上/下游引物,
核苷酸序列如SEQ ID NO: 54-56所示的检测ADD1基因分型的荧光探针和上/下游引物,和核苷酸序列如SEQ ID NO: 57-59所示的检测NPPA-AS1基因分型的荧光探针和上/下游引物中的至少一种。
9.根据权利要求6-8任一所述的检测试剂盒,其特征在于,还包括相应SNP基因突变/野生型、杂合型DNA的质控样品中的一种。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111366510.7A CN114015766B (zh) | 2021-11-18 | 2021-11-18 | 一种心脑血管疾病精准用药的检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111366510.7A CN114015766B (zh) | 2021-11-18 | 2021-11-18 | 一种心脑血管疾病精准用药的检测试剂盒 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114015766A true CN114015766A (zh) | 2022-02-08 |
CN114015766B CN114015766B (zh) | 2024-04-05 |
Family
ID=80065006
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111366510.7A Active CN114015766B (zh) | 2021-11-18 | 2021-11-18 | 一种心脑血管疾病精准用药的检测试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114015766B (zh) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004248678A (ja) * | 2000-09-26 | 2004-09-09 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 新規核酸プローブ並びにそれを用いる核酸測定方法、及びその方法によって得られるデータを解析する方法 |
CN105296650A (zh) * | 2015-11-25 | 2016-02-03 | 广州莱德璞检测技术有限公司 | 一种检测rs9263726等位基因的方法 |
US20160202195A1 (en) * | 2013-08-30 | 2016-07-14 | University Of Utah Research Foundation | A quantum method for fluorescence background removal in dna melting analysis |
AU2016211132A1 (en) * | 2015-01-30 | 2017-08-10 | Inland Norway University of Applied Sciences | Method and product for preventing false positives in methods employing ddNTPs |
CN109280703A (zh) * | 2018-10-22 | 2019-01-29 | 合肥欧创基因生物科技有限公司 | Smn2基因多拷贝数的检测方法 |
KR102061896B1 (ko) * | 2018-11-20 | 2020-01-09 | 대한민국 | 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형 판별용 pna 프로브 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형 판별방법 |
-
2021
- 2021-11-18 CN CN202111366510.7A patent/CN114015766B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004248678A (ja) * | 2000-09-26 | 2004-09-09 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 新規核酸プローブ並びにそれを用いる核酸測定方法、及びその方法によって得られるデータを解析する方法 |
US20160202195A1 (en) * | 2013-08-30 | 2016-07-14 | University Of Utah Research Foundation | A quantum method for fluorescence background removal in dna melting analysis |
AU2016211132A1 (en) * | 2015-01-30 | 2017-08-10 | Inland Norway University of Applied Sciences | Method and product for preventing false positives in methods employing ddNTPs |
CN105296650A (zh) * | 2015-11-25 | 2016-02-03 | 广州莱德璞检测技术有限公司 | 一种检测rs9263726等位基因的方法 |
CN109280703A (zh) * | 2018-10-22 | 2019-01-29 | 合肥欧创基因生物科技有限公司 | Smn2基因多拷贝数的检测方法 |
KR102061896B1 (ko) * | 2018-11-20 | 2020-01-09 | 대한민국 | 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형 판별용 pna 프로브 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형 판별방법 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
KIM DE LEENEER ET AL.: ""Genotyping of Frequent BRCA1/2 SNPs with Unlabeled Probes"", 《JOURNAL OF MOLECULAR DIAGNOSTICS》, vol. 11, no. 5, pages 415 - 419 * |
刘睿茜 等: ""基于单核苷酸多态性位点的多重实时荧光定量聚合酶链式反应法鉴别当雄高山牦牛肉"", 《肉类研究》, vol. 34, no. 10, pages 47 - 52 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114015766B (zh) | 2024-04-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP2314680B1 (en) | Method for amplification of target nucleic acid sequence, method for detection of mutation by using the method, and reagents for use in the methods | |
CN106701987A (zh) | 人叶酸代谢相关的三个snp位点基因分型的pcr扩增系统和检测试剂盒 | |
CN107841537A (zh) | 一种全预混mthfr和mtrr多重pcr基因多态性检测试剂盒和方法 | |
CN106701918A (zh) | 一种rs8099917基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒 | |
JPWO2008117782A1 (ja) | 遺伝子増幅用プライマーセット、それを含む遺伝子増幅用試薬およびその用途 | |
WO2011062258A1 (ja) | Mthfr遺伝子増幅用プライマーセット、それを含むmthfr遺伝子増幅用試薬およびその用途 | |
JP5290957B2 (ja) | 免疫関連遺伝子の多型の検出用プローブおよびその用途 | |
WO2016165591A1 (zh) | 基于焦磷酸测序技术的mgmt基因启动子甲基化检测 | |
CN113584147A (zh) | 一种用于指导精神病用药的基因多态性检测试剂盒 | |
CN108949967B (zh) | 用液相芯片技术检测心血管疾病药物基因多态性的特异性引物及试剂盒 | |
CN111621553A (zh) | 一种能够用于检测npc1l1突变基因分型的试剂及其应用 | |
CN103320531B (zh) | 一种可同时检测多个hbv耐药突变位点的新方法 | |
CN114015766B (zh) | 一种心脑血管疾病精准用药的检测试剂盒 | |
CN112899361A (zh) | 一种基于锁核酸修饰的rma法检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的试剂盒 | |
CN111118150B (zh) | 用于检测il28b基因的方法、试剂盒、引物对及探针 | |
CN107267621A (zh) | Mdr1基因多态性检测体系及其试剂盒 | |
CN106399565A (zh) | 一种rs12979860基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒 | |
KR101992952B1 (ko) | 콜레스테롤 유출능과 관련된 심혈관질환의 발병 위험을 예측하기 위한 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법 | |
CN112266950A (zh) | 一种探针引物组合及其检测试剂盒 | |
CN113981069B (zh) | 检测adrb1基因g1165c多态性的引物、试剂盒及其检测方法和应用 | |
CN110923312A (zh) | 一种检测CYP1A2基因rs762551位点的实时荧光PCR方法及其引物探针组合 | |
CN114480594B (zh) | 一种检测多个单核苷酸多态性的方法、试剂盒及其应用 | |
CN110684832A (zh) | 叶酸相关基因多态性检测的试剂盒及其使用方法 | |
CN112695083B (zh) | 一种检测高血压用药基因多态性的核酸组合物及试剂盒 | |
CN107058608A (zh) | 用于检测dpyd*2a遗传多态性的引物、探针及检测试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |