CN113981069B

CN113981069B - 检测adrb1基因g1165c多态性的引物、试剂盒及其检测方法和应用

Info

Publication number: CN113981069B
Application number: CN202111324819.XA
Authority: CN
Inventors: 王知丰; 秦付军; 吴书展
Original assignee: Zhengzhou Huawo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhengzhou Huawo Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-11-10
Filing date: 2021-11-10
Publication date: 2023-08-15
Anticipated expiration: 2041-11-10
Also published as: CN113981069A

Abstract

本发明公开了一种检测ADRB1基因G1165C多态性的引物、试剂盒及其检测方法和应用。本发明设计一种用于检测ADRB1基因G1165C多态性的分型探针引物，其序列结构为：A‑DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDrDDDDM‑B。本发明提供一种用于检测ADRB1基因G1165C多态性的试剂盒，另提供一种ADRB1基因G1165C多态性的检测方法。本发明的引物可消除或大大减少了引物二聚体，且热稳定的热启动RNase H2立即在核糖的5'处切割引物，释放封闭基团并允许引物延伸，仅需要2条分型探针引物和1条通用引物即可实现SNP位点的分型，且检测时信号高、特异性强。

Description

检测ADRB1基因G1165C多态性的引物、试剂盒及其检测方法和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种检测ADRB1基因G1165C多态性的引物、试剂盒及其检测方法和应用。

背景技术

高血压作为一种慢性非传染性疾病，是我国患病率较高、致残率较高及疾病负担较重的慢性疾病。与发达国家相比，我国高血压患病人数多，虽然近年来高血压的知晓率、治疗率及控制率有所提高，但仍处于较低水平，高血压控制率地区差异较大，为我国慢性病的预防和控制带来极大挑战。

目前临床对于高血压的控制方法主要是改变饮食习惯和生活方式等非药物措施和药物治疗两方面。其中，药物治疗是控制血压最有效的措施。治疗高血压的药物品种繁多，而且抗高血压药需长期服用，在实际治疗过程中，不同个体对于药物反应的差异性很大，影响因素包括年龄、并发症、营养状况、遗传背景、药物相互作用及环境等，其中遗传背景的影响尤为重要。药物进入人体内，经过吸收、转运、代谢、效应及清除的过程发挥作用，携带不同基因型的患者在上述药物作用过程中可能呈现反应的程度不同，表现为药物反应性的个体差异。通过检测药物代谢酶和药物靶点基因，可指导临床医生针对特定患者选择合适的降压药物和给药剂量，提高降压药物治疗的有效性和安全性。

鉴于此，多数患者都会经历“试药”过程，包括试品种、试剂量、试给药频次、试服药时间等，直至各项生理指标达标。而这种“试药”的模式，对高血压患者来讲无疑是痛苦的，还会造成资源和时间的浪费，以及难以预知的药物不良反应。

肾上腺素受体(β-adrenergic receptor)为肾上腺素受体的一个亚家族，属于G蛋白偶联受体超家族，包含β1、β2和β3三种不同亚型。该类受体通过与Gs蛋白偶联调节细胞内cAMP和L型Ca²⁺通道的开放频率，是β受体激动剂和β受体阻滞剂的作用靶点。β1受体编码基因ADRB1多态性可影响β受体阻断剂如美托洛尔的疗效。

目前用于ADRB1基因多态性(G1165C)的方法主要有直接测序法、ARMS PCR法、基因芯片和液相芯片法。直接测序的法结果较为准确，但其操作流程较复杂，耗时较长，成本较高。ARMS PCR法采用了相对Ct差的方法进行判定基因型，无法通过一管进行基因型的区分。基因芯片法及液相芯片法同样操作过程复杂，检测成本高，检测周期较长。

因此，研发一种快速、准确且低成本的新型检测方法成为了高血压临床治疗药物开发和药物使用管理的迫切需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种检测ADRB1基因G1165C多态性的引物、试剂盒及其检测方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明的发明构思如下：

鉴于ADRB1 Gly389Arg(rs1801253)多态性导致产生位点Arg389和Gly389两种类型的受体，其中Arg389型受体与G蛋白偶联效率高于Gly389型受体。长期研究发现Arg389纯合子高血压患者应用美托洛尔后血压下降的程度是Gly389Arg杂合子基因型个体的3倍；Arg389纯合子基因型心衰患者应用卡维地洛和美托洛尔治疗后左室射血分数改善情况更佳。若在应用β1受体阻滞药前进行ADRB1多态性检测，并根据其基因型调整用药剂量，可以提高疗效，减少不良反应的发生。

为解决ADRB1基因多态性(G1165C)的方法现有技术的弊端，本发明的方法采用rhAmp SNP分型技术，并在此基础上进行了改进，它基于RNase H2依赖性PCR(rhPCR)，可为SNP分析提供高信号和特异性。rhAmp SNP基因分型将独特的两种酶系统与3'末端封闭的DNA-RNA杂交引物结合在一起，以检测SNP位点。

本发明具体采用如下技术方案：

设计一种用于检测ADRB1基因G1165C多态性的分型探针引物，其序列结构为：

A-DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDrDDDDM-B。

其中，A或B为荧光标记基团或NFQ标记；D为与模板DNA匹配的DNA碱基序列；D为SNP位点的碱基；M为与模板DNA错配的DNA碱基；r为与模板DNA匹配的RNA碱基，且为RNase H2酶的识别位点。

优选的，所述荧光标记基团为FAM、VIC、Cy5、Rox中的一种；所述NFQ标记为淬灭基团BHQ1、BHQ2、MGB中的一种。

优选的，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

提供一种用于检测ADRB1基因G1165C多态性的试剂盒，包括引物，所述引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的野生型探针引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的突变型探针引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的通用引物。

优选的，还包括10×PCR检测反应液、酶混合液、所述引物、阳性对照品或阴性对照品。

优选的，所述10×PCR检测反应液包括pH值为8.5的200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、浓度为20mmol/L的硫酸镁溶液、浓度为500mmol/L的氯化钾溶液和体积比为0.2％的甘油溶液；所述酶混合液包括1U/μL～5U/μL的耐热DNA聚合酶和0.05U/μL～0.2U/μL RNase H2酶；所述引物浓度为0.2～1.0uM；所述阳性对照品为野生基因型ADRB1-Wt质粒和/或突变型ADRB1-Mut质粒，所述质粒浓度为1000copys/ul；所述阴性对照品为灭菌水。

另提供一种ADRB1基因G1165C多态性的检测方法，包括以下步骤：

(1)取所述的试剂盒，配置预混液PCR-mix；

(2)提取样本DNA，进行DNA浓度测定并稀释至10ng/μL，备用；

(3)根据所述样本、阴性对照、阳性对照的数量向相应数量的反应管中加入18μL的PCR-mix，并取步骤2)备用的的样本DNA、阴性对照、阳性对照各2μL加入到上述PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；

(4)将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试。

优选的，在所述步骤(1)中，所述预混液PCR-mix组分为：10×Buffer 2μL、MgCl21.6μL、dNTP 1.6μL、野生型探针引物0.4μL、突变型探针引物0.4μL、通用引物0.6μL、Taq酶0.2μL、RNase H2酶0.2μL、灭菌水11μL。

优选的，在所述步骤(4)中，所述荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性5min，循环数1；95℃变性20s，60℃退火35s，72℃延伸20s，循环数40。

将所述分型探针引物、所述的试剂盒或所述的检测方法在降压药物筛选或评估中应用。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

本发明的封闭引物的激活发生在与其完全匹配的靶标杂交后，从而消除或大大减少了引物二聚体，且热稳定的热启动RNase H2立即在核糖的5'处切割引物，释放封闭基团并允许引物延伸。即本发明仅需要2条分型探针引物和1条通用引物即可实现SNP位点的分型，且检测时信号高、特异性强。

附图说明

图1为1号管中ADRB1-Wt引物的扩增曲线；

图2为2号管中ADRB1-Mut引物的扩增曲线；

图3中3号管中ADRB1-Wt引物和ADRB1-Mut引物的扩增曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例：一种用于检测ADRB1基因G1165C多态性的检测方法

本发明的方法采用rhAmp SNP分型技术，并在此基础上进行了改进，它基于RNaseH2依赖性PCR(rhPCR)，可为SNP分析提供高信号和特异性。rhAmp SNP基因分型将独特的两种酶系统与3'末端封闭的DNA-RNA杂交引物结合在一起，以检测SNP位点。封闭的引物的激活发生在与其完全匹配的靶标杂交后，从而消除或大大减少了引物二聚体。热稳定的热启动RNase H2立即在核糖的5'处切割引物，释放封闭基团并允许引物延伸。本发明的方法仅需要2条分型探针引物和1条通用引物即可实现SNP位点的分型。

分型探针引物具体序列结构如下：

Reporter-DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDrDDDDM-NFQ。

其中，Reporter为荧光标记基团FAM、VIC、Cy5、Rox等中的一种；NFQ为淬灭基团BHQ1、BHQ2、MGB等中的一种；且，上述Reporter与NFQ标记可以位置互换；D为与模板DNA匹配的DNA碱基；D为SNP位点的碱基；M为与模板DNA错配的DNA碱基；r为与模板DNA匹配的RNA碱基，同时为RNase H2酶的识别位点，只有当r前面的D(SNP)位点与模板完全匹配时，RNaseH2酶才会切割rDDDDM-NFQ序列，使得分型探针引物的3’端暴露，可以在Taq酶的延伸下进行扩增，同时分型探针的淬灭基团与发光基团分离，因此产生荧光信号，从而区分SNP位点。

本发明的方法采用rhAmp SNP，可以准确在一管内区分SNP基因型，具体表现在2方面：

其一：分型探针引物的3‘末端进行了阻断修饰，使得引物二聚体产生的可能很小；

其二：RNase H2酶可以特异性识别探针引物是否完全与模板杂交，只有完全杂交才能启动切割识别序列，确保准确区分SNP位点。

基于上述构思设计检测ADRB1基因G1165C多态性的方法，具体如下：

(1)设计引物

基于ADRB1基因的野生型(核苷酸序列如SEQ ID NO.1)和突变型(核苷酸序列如SEQ ID NO.2)碱基序列和ADRB1 G1165C(rs1801253)SNP位点多态性，设计的引物和探针碱基序列如下：

野生型探针引物(Wt)：

ADRB1-W t：VIC-AAGGCCTTCCAGGgACTC-Bhq1；

突变型探针引物(Mut)：

ADRB1-Mut：FAM-AAGGCCTTCCAGCgACTC-Bhq1；

通用引物：

ADRB1通用引物：CATCGTCGTCGTCGTCGTC。

(2)设计试剂盒

ADRB1位点G1165C基因分型检测试剂盒的主要组分为：

10×PCR检测反应液，所述10×PCR检测反应液包括pH值为8.5的200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、浓度为20mmol/L的硫酸镁溶液、浓度为500mmol/L的氯化钾溶液、体积比为0.2％的甘油溶液；酶混合液包括1U/μL～5U/μL的耐热DNA聚合酶和0.05U/μL～0.2U/μL RNase H2酶；qPCR反应体系中引物浓度为0.2～1.0uM，所述引物为上述野生型探针引物、突变型探针引物和通用引物；试剂盒中用到还包括阳性对照品及阴性对照品，其中阳性对照品为质粒，野生基因型ADRB1-Wt及突变型ADRB1-Mut均为1000copys/ul；阴性对照品为灭菌水。

(3)设计检测试剂盒的使用方法

ADRB1位点G1165C基因分型检测试剂盒的使用步骤为：

1)取出包装盒中的10×buffer、dNTP、MgCl₂、taq酶、RNase H2酶、引物探针混合液及阳性对照品，室温放置，待其温度平衡至室温后，将各组分分别混匀，得预混液PCR-mix，备用；

预混液PCR-mix组分如表1所示：

表1预混液PCR-mix

2)根据样本性质，使用相应的DNA提取试剂盒进行样本DNA提取，进行DNA浓度测定并稀释至10ng/μL，备用；

3)根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量向相应数量的反应管中加入18μL的PCR-mix，并取步骤2)备用的的样本DNA、阴性对照、阳性对照各2μL加入到上述PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；

4)将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试；

荧光定量PCR反应条件如表2所示：

表2 PCR反应条件

5)结果分析：

检测所得扩增曲线与阈值线的交点，即为Ct值(即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；判断样本孔中FAM及VIC的Ct值，其中FAM代表突变信号，VIC代表野生信号，若FAM有信号VIC无信号则为纯合突变；VIC有信号FAM无信号则为纯合野生；FAM及VIC都有信号则为杂合突变。

试验例1：ADRB1基因引物探针准确度验证试验

(1)根据ADRB1 G1165C(rs1801253)序列信息，分别合成野生型ADRB1-Wt质粒及突变型ADRB1-Mut质粒，将其稀释至1000copys/ul，备用；

(2)取实施例中的用于ADRB1位点的野生型探针引物(Wt)，突变型探针引物(Mut)及通用引物；

(3)根据表1配制qPCR反应液，每孔18ul，分装至8联排管1号，2号及3号管中，其中1号管加入野生型ADRB1-Wt质粒2ul；2号管加入突变型ADRB1-Mut质粒2ul；3号管加入野生型ADRB1-Wt质粒及突变型ADRB1-Mut质粒各1ul；

(3)将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试；反应程序参考表2。

检测所得曲线如图1、2和3所示：

图1中1号管中ADRB1-Wt引物高效扩增ADRB1-Wt质粒，而对ADRB1-Mut质粒几乎不扩增；图2中2号管中ADRB1-Mut引物高效扩增ADRB1-Mut质粒，而对ADRB1-Wt质粒几乎不扩增；图3中3号管中加入ADRB1-Wt及ADRB1-Mut质粒，其对应的VIC和FAM均产生相当的荧光信号。

可知，实施例的探针引物和通用引物可为SNP分析提供高信号和特异性。

试验例2：ADRB1位点G1165C基因分型检测试剂盒准确度验证试验

收集30份血液(EDTA抗凝剂)样本，血液样本采用市面上的血液基因组提取试剂盒。样本分别进行ADRB1基因的测序。

采用实施例的ADRB1位点G1165C基因分型检测试剂盒检测上述样本，结果如表3所示：

表3样本检测结果

可知，1-30号样本根据上述判断标准(VIC信号为G/G基因型，FAM信号为C/C基因型，FAM/VIC信号为C/G基因型，见实施例)进行基因分型，结果与测序结果一致。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

序列表

<110> 郑州华沃生科技有限公司

<120> 检测ADRB1基因G1165C多态性的引物、试剂盒及其检测方法和应用

<130> 2021

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 300

<212> DNA

<213> human(Artificial Sequence)

<400> 1

ccttcttcct ggccaacgtg gtgaaggcct tccaccgcga gctggtgccc gaccgcctct 60

tcgtcttctt caactggctg ggctacgcca actcggcctt caaccccatc atctactgcc 120

gcagccccga cttccgcaag gccttccagg gactgctctg ctgcgcgcgc agggctgccc 180

gccggcgcca cgcgacccac ggagaccggc cgcgcgcctc gggctgtctg gcccggcccg 240

gacccccgcc atcgcccggg gccgcctcgg acgacgacga cgacgatgtc gtcggggcca 300

<210> 2

<211> 300

<212> DNA

<213> human(Artificial Sequence)

<400> 2

ccttcttcct ggccaacgtg gtgaaggcct tccaccgcga gctggtgccc gaccgcctct 60

tcgtcttctt caactggctg ggctacgcca actcggcctt caaccccatc atctactgcc 120

gcagccccga cttccgcaag gccttccagc gactgctctg ctgcgcgcgc agggctgccc 180

gccggcgcca cgcgacccac ggagaccggc cgcgcgcctc gggctgtctg gcccggcccg 240

gacccccgcc atcgcccggg gccgcctcgg acgacgacga cgacgatgtc gtcggggcca 300

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 3

aaggccttcc agggactc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 4

aaggccttcc agcgactc 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 5

catcgtcgtc gtcgtcgtc 19

Claims

1.一种用于检测ADRB1基因G1165C多态性的分型探针引物，其特征在于，野生型探针引物为： ADRB1-Wt：VIC-AAGGCCTTCCAGGgACTC-Bhq1，突变型探针引物为：ADRB1-Mut：FAM-AAGGCCTTCCAGCgACTC-Bhq1，其中所述大写碱基为DNA碱基，所述小写碱基为RNA碱基。

2.一种用于检测ADRB1基因G1165C多态性的试剂盒，其特征在于包括引物，所述引物为权利要求1所述的野生型探针引物、突变型探针引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的通用引物。

3.依据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括10×PCR检测反应液、酶混合液、阳性对照品和阴性对照品。

4.依据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述10×PCR检测反应液包括pH值为8.5的200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、浓度为20mmol/L的硫酸镁溶液、浓度为500mmol/L的氯化钾溶液和体积比为0.2％的甘油溶液；所述酶混合液包括1U/μL～5U/μL的耐热DNA聚合酶和0.05U/μL～0.2U/μL RNase H2酶；所述引物浓度为0.2～1.0uM；所述阳性对照品为野生基因型ADRB1-Wt质粒和/或突变型ADRB1-Mut质粒，所述质粒浓度为1000copys/ul；所述阴性对照品为灭菌水。

5.一种ADRB1基因G1165C多态性非疾病诊断治疗目的的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取权利要求3所述的试剂盒，配置预混液PCR-mix；

（2）提取样本DNA，进行DNA浓度测定并稀释至10ng/μL，备用；

（3）根据所述样本、阴性对照、阳性对照的数量向相应数量的反应管中加入18μL的PCR-mix，并取步骤（2）备用的样本DNA、阴性对照、阳性对照各2μL加入到上述PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；

（4）将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试。

6.依据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，所述预混液PCR-mix组分为：10×PCR检测反应液2μL、MgCl2 1.6μL、dNTP 1.6μL、野生型探针引物0.4μL、突变型探针引物0.4μL、通用引物0.6μL、Taq酶0.2μL、RNase H2酶0.2μL、灭菌水11μL。

7.依据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，在所述步骤（4）中，所述荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性5min，循环数1；95℃变性20s，60℃退火35s，72℃延伸20s，循环数40。