CN109251976A

CN109251976A - 基于poct模式的cyp2c9和vkorc1基因型快速检测试剂盒

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Publication number: CN109251976A
Application number: CN201810152207.9A
Authority: CN
Inventors: 罗德朋; 贺庭祯; 向霄; 熊伟; 黎帮勇; 钟越; 刘黎; 崔奇新; 董锐
Original assignee: CHONGQING JINGYIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: CHONGQING JINGYIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2018-02-14
Filing date: 2018-02-14
Publication date: 2019-01-22

Abstract

本发明提供一种基于POCT模式的CYP2C9和VKORC1基因型快速检测试剂盒，所述试剂盒含有用于检测CYP2C9和VKORC1基因型的荧光定量PCR引物和探针以及细胞裂解液，所述PCR引物的序列如SEQ ID NO.1‑2和SEQ ID NO.5‑6所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.3‑4和SEQ ID NO.7‑8所示。本试剂盒可实现即时检测，无需DNA提纯，可将样本直接加入试剂中进行PCR反应，特别适合DNA含量较低样本(如口腔脱落细胞)的快速、准确检测，检测准确率达99％以上，检测灵敏度高，可以准确检测低至0.125ng基因组DNA；整个检测耗时短，1小时内可得检测结果，能在第一时间给医生提供用药依据，降低患者用药风险。

Description

基于POCT模式的CYP2C9和VKORC1基因型快速检测试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种基于POCT模式的CYP2C9和VKORC1基因型快速检测试剂盒。

背景技术

华法林是目前临床使用比较广泛的一种香豆素类口服抗凝药，具有抗凝和溶栓的双重作用。华法林可用于机械心脏瓣膜置换术术后、非瓣膜性心房颤动以及深静脉血栓等患者的抗凝治疗。但是华法林的抗凝治疗指数范围狭窄，如果剂量不足达不到治疗效果，剂量稍微过量则会引起出血，重者危及病人生命。同时，华法林血浆药物浓度和疗效存在明显的个体差异，即使同一个体在不同时期所需的剂量也可能不同。华法林的剂量受到遗传基因多态性的影响。研究表明，不同患者使用抗凝药物华法林的剂量可以相差20倍，亚洲人的维持剂量比白种人要低30％-40％。因此，如何在临床用药前能够快速检测并有针对性的对华法林进行用药指导，成为当下亟待解决的问题。

CYP2C9(Cytochrome P450 2C9)和VKORC1(vitamin K epoxide reductasecomplex subunit 1)的基因多态性是影响华法林用量个体差异最主要的遗传因素之一。

CYP2C9位于染色体区10q24.2上，全长约为55kb，由9个外显子构成，是细胞色素P450中亚家族的一员。据统计，目前约有16％的临床药物由CYP2C9负责代谢，主要包括华法林、醋酸香豆素、甲苯磺丁脲等。CYP2C9*3是外显子7的第1061位核苷酸A突变为C，导致多肽链第359位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸。具有功能意义的基因突变导致CYP2C9酶活性降低，可使CYP2C9酶底物药物疗效下降，产生多种药物不良反应，甚至危及生命。研究表明，CYP2C9*3的杂合子可以降低对S-华法林的代谢。

VKORC1位于染色体16p11.2区域，全长约4100bp。VKORC1编码区和非编码区存在大量的多态性位点，其中对华法林剂量有影响的单核苷酸多态性位点主要是启动子区1639G>A(rs9923231)。VKORC1-1639GG被称为野生纯合基因型，VKORC1-1639GA是杂合突变基因型，与野生基因型相比，携带杂合突变基因型的患者需要华法林剂量相对较低；VKORC1-1639AA是突变纯合基因型，与野生纯合基因型相比，携带突变纯合基因型的患者需要的华法林剂量更低一些。研究表明VKORC1-1639G>A的基因突变频率在不同种族间也存在显著差异。

目前，针对华法林药物遗传基因CYP2C9*3和VKORC1基因型检测方法主要有PCR-芯片杂交法、测序法、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、PCR-荧光探针法。

测序法和基因芯片法对检测结果具有很高的精度，但其需要依赖大型精密仪器设备、固定实验室以及专业操作人员，DNA样本制备要求高。因此，这两种检测方法成本高，步骤繁琐，耗时长，在临床上很难进行推广。PCR-RFLP法虽然降低了测序法和基因芯片法中的仪器和试剂的成本，但其操作复杂，步骤繁多，也不适用于临床。公开号为CN107447035A的中国专利申请采用了PCR-荧光探针法虽然降低了测序法和基因芯片法中的仪器和试剂的成本，但是由于该反应体系只能扩增纯化后的基因组DNA样本，所以必须采用多步骤多管操作，在临床推广上也不理想。

因此，这些技术都难以解决华法林药物服用者的临床检测的迫切性问题、难以实现POCT模式下快速、准确的要求。

发明内容

本发明的目的是提供一套用于检测CYP2C9和VKORC1基因型的荧光定量PCR引物组合和探针组合。

本发明的另一目的是提供一种基于POCT模式的CYP2C9和VKORC1基因型快速检测试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明提供一套用于检测CYP2C9和VKORC1基因型的荧光定量PCR引物组合和探针组合，包括上游引物、下游引物、野生型探针和突变型探针。

检测CYP2C9和VKORC1基因的引物组合包括：

检测CYP2C9的引物：

CYP2C9*3上游引物：5’-CATGCAAGACAGGAGCCAC-3’；

CYP2C9*3下游引物：5’-GTAGGAGAAACAAACTTACCTTGGGA-3’；

检测VKORC1的引物：

VKORC1上游引物：5’-CCAAAATGCTAGGATTATAGGC-3’；

VKORC1下游引物：5’-GTCAAGCAAGAGAAGACCTG-3’。

所述探针组合中的探针如SEQ ID NO.3-4和SEQ ID NO.7-8所示。

作为优选，所述探针组合包括：

检测CYP2C9的探针：

CYP2C9*3野生型探针:5’-AGAAGGTCAA+TGTATC-3’；

CYP2C9*3突变型探针:5’-AGAAGGTCAA+GGTATC-3’；

检测VKORC1的探针：

VKORC1野生型探针:5’-CGCACC+CGGCCAAT-3’；

VKORC1突变型探针:5’-CACCGCACC+TGGCC-3’；

其中，“+”表示右侧的单碱基为LNA修饰。

所述探针需在5’端连接报告荧光基团，在3’端连接荧光淬灭基团。

所述报告荧光基团与淬灭基团可选用本领域常用的报告荧光基团与淬灭基团。

在本发明的具体实施方式中，所述野生型探针采用的报告荧光基团为FAM，突变型探针采用的报告荧光集团为Texas Red，淬灭荧光基团为MGB。

本发明还提供含有所述引物和探针的检测试剂或试剂盒。

本发明还提供一种基于POCT模式的CYP2C9和VKORC1基因型快速检测试剂盒，所述试剂盒至少含有所述引物和探针以及细胞裂解液；

其中，所述细胞裂解液由十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚组成。

具体地以十二烷基硫酸钠0.0005-0.015％w/v和聚乙二醇辛基苯基醚0.001-0.03％w/v作为200×细胞裂解液母液。使用时，按比例稀释。

优选地，所述细胞裂解液(200×母液)为：

十二烷基硫酸钠0.009％w/v，聚乙二醇辛基苯基醚0.01％w/v；或

十二烷基硫酸钠0.005％w/v，聚乙二醇辛基苯基醚0.02％w/v；或

十二烷基硫酸钠0.005％w/v，聚乙二醇辛基苯基醚0.001％w/v；或

十二烷基硫酸钠0.015％w/v，聚乙二醇辛基苯基醚0.003％w/v。

本发明所述试剂盒中还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、标准阳性模板、采样棒(例如，一次性口腔拭子)、样品收集管等中的至少一种。

优选地，所述Taq DNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶。

本领域技术人员应当理解，为了取得最佳的检测效果，在进行PCR反应检测时，应当针对不同的检测对象(不同位点)在独立的反应体系中分别进行检测。

与本发明所述试剂盒配套的PCR反应体系中各组分的终浓度为：0.5-1.5×PCR反应缓冲液、DNA聚合酶0.04-0.1U/μL、dNTPs0.1-0.5mM、上游引物0.2-0.8μM、下游引物0.2-0.8μM、野生型探针0.2-0.7μM、突变型探针0.2-0.7μM、Mg²⁺1-2.5mM和1×细胞裂解液。

优选地，所述CYP2C9的PCR反应体系中各组分的终浓度为：1.1×PCR反应缓冲液、DNA聚合酶0.05U/μL、dNTPs0.2mM、上游引物0.5μM、下游引物0.5μM、野生型探针0.4μM、突变型探针0.4μM、Mg²⁺2.5mM和1×细胞裂解液；

所述的VKORC1的PCR反应体系中各组分的终浓度为：1.1×PCR反应缓冲液、DNA聚合酶0.05U/μL、dNTPs0.2mM、上游引物0.5μM、下游引物0.5μM、野生型探针0.3μM、突变型探针0.3μM、Mg²⁺2.5mM和1×细胞裂解液。

优选地，与本发明所述试剂盒配套的PCR反应程序为：95℃5min，1个循环；95℃8s，63℃35s，50个循环。

将本发明的试剂盒应用于实际样本检测，所述检测样本可以来自口腔内壁、舌头、手掌、耳朵等部位，来自上述位置的脱落细胞经裂解液裂解后释放出的DNA均可用于该试剂盒的基因检测，由于刮取口腔内壁样本方法简便快捷，且样本量适中，因此选取口腔样本为最优。一般情况下在20秒内即可完成取样和加样步骤。

(1)取样前准备

取样前患者须用清水漱口2次，每次不少于5秒，漱口后吞咽2-3次，尽量避免口腔内壁残留唾液。取样者须穿戴手套、口罩。待上述准备完成后，方可进行取样。

(2)取样与加样

采样工具为一次性口腔拭子。具体采样过程如下：

1)分别从试剂盒与拭子包装袋中取出反应液与拭子，然后拔掉试剂塞(图1-a)；

2)取下拭子端盖,该过程中注意勿接触试剂塞(图1-b)；

3)使拭子端部近90°接触口腔内腮壁，均匀刮拭5次(上下为1次)，力度以腮部微突为宜(图1-c)；

4)取样后立即将拭子插入反应液中，按压使其与试剂管密封，避光暂存(如图1-d)。

检测结果分析：反应结束后经过分析系统可直观准确地对检测结果进行分析和解读，一共可产生以下三种结果。

①野生纯合型

该检测结果在分析系统中表现为有且仅有绿色荧光曲线呈指数增长趋势，并且有且仅有绿色荧光通道产生Ct值(cycle threshold，指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)。(图2、图5)

②突变纯合型

该检测结果在分析系统中表现为有且仅有红色荧光曲线呈指数增长趋势，并且有且仅有红色荧光通道产生Ct值。(图3、图6)

③杂合型

该检测结果在分析系统中表现为绿色荧光曲线和红色荧光曲线均呈指数增长趋势，并且绿色荧光通道和红色荧光通道均产生Ct值。(图4、图7)

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)可实现即时检测，无需DNA提纯，可将样本直接加入试剂中进行PCR反应，1小时内即可得到对应基因位点的检测信息；故可在第一时间给医生提供用药依据，从而避免患者用药错误。

(二)在试剂反应体系中加入了细胞裂解液，可直接裂解细胞并释放出细胞核中DNA，使样本加入、DNA提取与PCR反应在同一支试剂管里闭管进行。

(三)本试剂盒样本(DNA或口腔细胞)检测准确率达99％以上。

(四)本发明检测方法，取样过程无痛无创，操作简便，单次取样加样20s内即可完成。

(五)检测灵敏度高，可以准确检测低至0.125ng的基因组DNA。对于保存时间过长以及口腔拭子等DNA含量较低的样本能准确检测。

(六)本试剂盒在常温下至少可放置72h，2-8℃至少可放置15天，-20℃至少可放置12个月。

(七)本发明采用了新颖的加样至结果一步化的操作方式，免去了繁琐的中间环节，1小时内即可出检测结果，解决了紧急病人治疗迫切的问题。单一步骤，单管试剂，闭管操作，大幅度降低了环境污染的可能性。

(八)本发明还配套使用了智能分析程序，可直接对数据进行自动分析，即刻得出无偏性的基因型检测结果和用药指导报告，摆脱了实验室束缚，对环境和操作人员没有特殊要求。

(九)本发明使用的探针可采用常用的分子信标，也可采用同时有着MGB(minorgroovebinding)和LNA(locknucleicacid)双重修饰的Taqman探针，但Taqman探针较分子信标本身具有更大优势，Taqman探针不仅大大降低了本底信号强度，并且进一步提高了探针的特异性、灵敏度和准确性。

(十)本发明还采用了热启动酶，通过优化试剂体系，使其能够包容口腔杂质和环境温度变化带来的风险。

附图说明

图1为检测过程中口腔细胞的取样及加样操作流程图。

图2为CYP2C9*3野生纯合型检测结果图。

图3为CYP2C9*3突变纯合型检测结果图。

图4为CYP2C9*3杂合型检测结果图。

图5为VKORC1野生纯合型检测结果图。

图6为VKORC1突变纯合型检测结果图。

图7为VKORC1杂合型检测结果图。

图8-图13分别为CYP2C9*3试剂A组三种基因型Ct值统计图、B组三种基因型Ct值统计图、C组三种基因型Ct值统计图、A组三种基因型终点荧光值(EPF)统计图、B组三种基因型终点荧光值(EPF)统计图、C组三种基因型终点荧光值(EPF)统计图。注：“*”表示与对照组相比，该组数据差异显著(P≤0.05)；未标示的表示与对照组相比，该组数据差异不显著(P>0.05)。

图14-图19分别为VKORC1试剂A组三种基因型Ct值统计图、B组三种基因型Ct值统计图、C组三种基因型Ct值统计图、A组三种基因型终点荧光值(EPF)统计图、B组三种基因型终点荧光值(EPF)统计图、C组三种基因型终点荧光值(EPF)统计图。注：“*”表示与对照组相比，该组数据差异显著(P≤0.05)；未标示的表示与对照组相比，该组数据差异不显著(P>0.05)。

图20-图21分别为CYP2C9*3试剂和VKORC1试剂各配方Ct值差异性比较。注：上图数据经多重比较检验统计学差异，将均值由大到小比较，相同字母表示差异不显著(p≥0.05)，不同字母表示差异显著(P≤0.05)。

图22-图23分别为CYP2C9*3试剂和VKORC1试剂各配方EPF值差异性比较。注：上图数据经多重比较检验统计学差异，将均值由大到小比较，相同字母表示差异不显著(p≥0.05)，不同字母表示差异显著(P≤0.05)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。

实施例1用于检测CYP2C9和VKORC1基因的PCR反应液的配置

本实施例所配制的PCR反应液为23.5μL体系，原料及其终浓度如下：

DNA聚合酶0.05U/μL；

dNTPs 0.2mM；

5×反应缓冲液1.1×；

MgCl₂ 2.5mM；

细胞裂解液1×；

上游引物0.5μM；

下游引物0.5μM；

突变型探针0.5μM；

野生型探针0.5μM；

超纯水补齐至23.5μL。

其中，反应缓冲液为Colorless Reaction Buffer；dNTPs、MgCl₂、5x ColorlessReaction Buffer、DNA聚合酶采用GoTaq DNA Polymerase均购自上海普洛麦格生物制品有限公司。

所述细胞裂解液由十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚组成；

其中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.0005-0.015％(w/v)；聚乙二醇辛基苯基醚的浓度为0.001-0.03％(w/v)。

实施例2LNA修饰探针提高分型正确率

LNA是一种寡核苷酸衍生物，与DNA/RNA具有相似的结构，因此能够对DNA和RNA进行有力的识别和结合。LNA用于寡核苷酸的修饰后，能够增加引物或探针的热稳定性，使其退火温度提高3～8℃。本试剂盒开发的探针采用LNA修饰，经软件预测，修饰后的野生型探针和突变型探针与模板结合的Tm值均提高了约3℃。为了证明LNA修饰探针和未经LNA修饰探针的差异是否可以提高分型成功率，于是我们进以下列对比实验。PCR反应体系见表2-1，分别检测三种基因型，每个基因型三组重复，反应程序见表1。

表1

本实验所用探针引物序列如下：

CYP2C9*3上游引物SEQ ID NO.1：

5’-CATGCAAGACAGGAGCCAC-3’；

CYP2C9*3下游引物SEQ ID NO.2：

5’-GTAGGAGAAACAAACTTACCTTGGGA-3’；

CYP2C9*3野生型探针SEQ ID NO.3：

5’-AGAAGGTCAA+TGTATC-3’；

CYP2C9*3突变型探针SEQ ID NO.4：

5’-AGAAGGTCAA+GGTATC-3’；

CYP2C9*3野生型未修饰探针SEQ ID NO.9：

5’-AGAAGGTCAATGTATC-3’；

CYP2C9*3突变型未修饰探针SEQ ID NO.10：

5’-AGAAGGTCAAGGTATC-3’；

VKORC1上游引物SEQ ID NO.5：

5’-CCAAAATGCTAGGATTATAGGC-3’；

VKORC1下游引物SEQ ID NO.6：

5’-GTCAAGCAAGAGAAGACCTG-3’；

VKORC1野生型探针SEQ ID NO.7：

5’-CGCACC+CGGCCAAT-3’；

VKORC1突变型探针SEQ ID NO.8：

5’-CACCGCACC+TGGCC-3’；

VKORC1野生型未修饰探针SEQ ID NO.11：

5’-CGCACCCGGCCAAT-3’；

VKORC1突变型未修饰探针SEQ ID NO.12：

5’-CACCGCACCTGGCC-3’。

(注：“+”表示右侧碱基为LNA修饰)

表2-1PCR反应体系表

实验结果：

表2-2.三种基因型Ct值统计

注：“-”表示无Ct值。

表2-3.三种基因型的终点荧光值(EPF)统计

从表2-2可以看出，未经LNA修饰探针组的杂合子的绿色通道无Ct值出现，经LNA修饰探针组三种基因型均有Ct值出现。从表2-3可以看出，经LNA修饰探针组三种基因型荧光值比未经LNA修饰探针组的荧光值大，CYP2C9*3位点野生及突变纯合子LNA修饰组的EPF值与未LNA修饰组的相比差异显著(P≤0.05)，杂合子LNA修饰组的EPF值与未LNA修饰组的相比差异极显著(P≤0.01)；VKORC1位点野生及突变纯合子LNA修饰组的EPF值与未LNA修饰组的相比差异极显著(P≤0.01)，杂合子LNA修饰组的EPF值与未LNA修饰组的相比差异显著(P≤0.05)。结果表明，探针经LNA修饰后，增强了探针与靶序列的结合效率，进而提高了检测结果的检出限。

实施例3准确性测试

本试剂盒采用口腔黏膜脱落细胞作为扩增样本，但是被检人员的生活习惯和基因序列存在多样性，可能对试剂产生干扰。因此本实验通过扩大取样人员数，对试剂进行大批量测试，以验证试剂检测的准确性。我们使用无菌拭子采集三种基因型不同人员的口腔黏膜脱落细胞进行测试(其中测试人员的基因型均经过测序法确证)，取样方法参照附图1操作流程，样本总数为600例，试剂配方如下表3-1所示。

表3-1.PCR反应总体系配方表

实验结果：

表3-2.三种基因型的正确率统计

由表3-2得出，CYP2C9*3和VKORC1两个位点的试剂分别在600例样本测试中，检测准确率均达到99％以上。表明两个位点的试剂在规范的取样操作下，其试剂检测准确率不受个体间口腔环境和遗传多样性的影响。

实施例4检测灵敏度测试

不同人群口腔黏膜脱落细胞数呈现个体差异，因此我们需要对CYP2C9*3/VKORC1基因型快速检测试剂盒进行灵敏度测试。我们分别在反应试剂中加入不同样品DNA(杂合型)总量，分别为：1ng、0.5ng、0.25ng、0.125ng、0.1ng五个梯度进行测试，每组重复三次，结果如下表4-1所示：

表4-1.CYP2C9*3/VKORC1基因型快速检测试剂盒检测不同样品量的检测结果

结果显示，当反应试剂中加入的样品DNA量逐次递减时，DNA量大于等于0.125ng时，其准确率均达到100％，当DNA量减少至0.1ng时，CYP2C9*3/VKORC1的准确率均有所降低，但也都达到了99％，满足试剂的准确性不低于99％的标准。因此本发明的CYP2C9*3/VKORC1基因型快速检测试剂盒在符合检测准确率标准的前提下，所加入的DNA模板量最低仅需35个拷贝数。

实施例5抗干扰能力检测

本试剂盒采用口腔黏膜脱落细胞直接扩增的方式进行检测，口腔环境复杂多变，尤其是在进食后未漱口状态下，食物残留物可能对反应试剂产生干扰，为了检测试剂在不同口腔残留物下的准确率，我们设计了如下实验。首先，选取被检人员(其基因型经测序法确证)取样前30min禁食为对照组，处理组设置为吃甜食、喝碱性茶、吃酸性食物、麻辣食品和喝中药后立即取样，所有样品使用同一批次试剂，每组样品设置野生纯合子120例，杂合子120例，突变纯合子60例，试剂配方如表3-1所示，检测结果如下表所示：

表5-1.试剂抗干扰能力测试结果

结果显示，与对照组禁食后取样相比，吃甜食、喝碱性茶、吃酸性食物、麻辣食品和喝中药后立即取样，CYP2C9*3/VKORC1试剂检测准确率均不同程度降低。表明口腔内容物杂质，可以抑制PCR反应扩增效率，影响试剂的检测准确率。由于本实验所设置的处理组有限，而在临床应用时，人群中有大量不可预知的口腔内容物干扰。因此，本试剂在使用时，需要确保取样检测前30min内禁食，同时用清水漱口2次，每次不少于5s，这样就可以最大程度的避免口腔内容物对反应试剂的干扰，保证检测的准确率。

实施例6环境对检测试剂盒的影响试验

本试剂是基于POCT模式开发，因此必须满足临床检测应用时可以耐受开放复杂的外部环境。于是我们检测了CYP2C9*3/VKORC1基因型快速检测试剂盒在不同环境下的检测准确率。我们分别选取两种不同洁净度的开放空间：日常办公区(总面积为200平方米，共有50人正常活动，环境温度为27℃，湿度为77％)、空气洁净度等级为一百万级的洁净室。采集不同基因型样品(其基因型经测序法确证)，每个人员在两个区域分别进行两次重复实验，试剂配方参照表3-1，检测结果统计如下表6-1所示。

表6-1.两个取样区的基因型检测结果正确率统计

结果显示，CYP2C9*3基因型在洁净区取样的准确率比在办公区高0.67％，VKORC1基因型在洁净区取样的准确率比在办公区高0.34％。表明取样环境的洁净度对检测结果准确率有一定影响，但并不影响两个位点基因的正确分型。因此，本发明试剂在开放复杂的操作环境下，可以正常分型，对环境的洁净度无特殊要求，完全满足医院等复杂开放场合的正常使用，但是洁净的取样环境对于保障检测结果的准确性有益。

实施例7试剂盒在不同温度条件下(常温、2-8℃、-20℃)放置的稳定性检测

本试剂盒基于POCT模式开发，能够实现医院床旁检测，因此要求试剂能够在常温条件下具有一定的耐受，不影响其准确率。因此我们检测了试剂在常温、2-8℃、-20℃保存条件下的稳定性。所以需检测试剂在常温下放置一定时长后，对试剂检测准确率的影响。我们配置了大批量试剂，将其随机分成3个温度条件组，8个处理时长组，共24个处理组，分组情况见表7-1，对照组为：配置后立即上机检测(2-8℃配制，30min内完成108支样品的取样上样上机)，每个处理组共108支试剂，每种基因型检测36支。按照SOP操作，采集被取样者(其基因型经测序法确证)口腔黏膜脱落细胞。按表1程序进行荧光PCR反应。

表7-1.试剂放置条件和放置时长分组情况表

CYP2C9*3试剂的实验结果：Ct值和终点荧光值(EPF)均值统计结果分别见图8-图13。VKORC1试剂的实验结果：Ct值和终点荧光值(EPF)均值统计结果分别见图14-图19。

表7-2.三种基因型分型正确率统计表

由以上数据可以得出，不同处理组的Ct值、EPF值与对照组分别相比较，各放置条件，放置时间越长，与对照相比显著性差异越大，表明常温放置、2-8℃放置、-20℃放置时间过久会造成试剂检测结果准确率降低。从表7-2可以得出，各处理组108例数据，A/B/C三个温度条件的1～7组分型正确率为100％，A/B/C三个温度条件的第8组，出现分型错误。表明试剂在常温条件下保存有效期至少7天，不会影响试剂的准确率；2-8℃条件下试剂保存有效期不低于15天，不会影响试剂的准确率；-20℃条件下试剂保存有效期至少12个月，不会影响试剂的准确率。综上所述，本试剂盒试剂具备一定的温差缓冲能力，拥有优良的稳定性。医护人员在室温条件下进行检测使用时，短暂(常温5天内)的常温放置，并不影响分型准确性，满足床旁检测的POCT模式。

实施例8引物探针不同浓度筛选实验

本试剂盒中所使用的引物探针经设计完成后，需要在反应体系下优化最佳浓度配比。通过设计引物探针不同浓度配比，进行Ct值和荧光增量对比，筛选出Ct值最小，荧光增量最高的浓度配比。

表8-1引物探针浓度确定实验PCR反应总体系配方表

实验结果：

1)Ct值统计：

表8-2CYP2C9*3/VKORC1位点各配方Ct值均值统计

注：“-”表示无Ct值。

终点荧光值(EPF)统计：

表8-3CYP2C9*3/VKORC1位点各配方终点荧光值(EPF)均值统计

本实施例测定了CYP2C9*3/VKORC1两个位点的试剂，在野生探针0.5μM、突变探针0.5μM的浓度条件下，正/反向引物不同浓度体系的分型扩增结果。在此基础上对上、下游引物浓度分别为0.5μM时，优化野生型探针和突变型探针浓度体系的分型扩增结果，以上结果均能正确分型。判定差异显著阈值P≤0.05，即为差异显著。

CYP2C9*3和VKORC1的五个配方Ct值差异不大，CYP2C9*3位点配方五的EPF值和其他配方都是差异显著的，且均值最大，标准偏差最小，因此CYP2C9*3上游引物、下游引物、野生探针、突变探针的最佳浓度配比为0.5μM、0.5μM、0.4μM、0.4μM。VKORC1位点配方四的EPF值和其他配方均差异显著，且均值最大，标准偏差最小，VKORC1上游引物、下游引物、野生探针、突变探针的最佳浓度配比为0.5μM、0.5μM、0.3μM、0.3μM。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 重庆京因生物科技有限责任公司

<120> 基于POCT模式的CYP2C9和VKORC1基因型快速检测试剂盒

<141> 2018-02-09

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catgcaagac aggagccac 19

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtaggagaaa caaacttacc ttggga 26

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agaaggtcaa tgtatc 16

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agaaggtcaa ggtatc 16

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccaaaatgct aggattatag gc 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtcaagcaag agaagacctg 20

<210> 7

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcacccggc caat 14

<210> 8

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caccgcacct ggcc 14

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agaaggtcaa tgtatc 16

<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agaaggtcaa ggtatc 16

<210> 11

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgcacccggc caat 14

<210> 12

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

caccgcacct ggcc 14

Claims

1.一种检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物组合，其特征在于，检测CYP2C9和VKORC1基因的引物组合包括：

检测CYP2C9的引物：

CYP2C9*3上游引物：5’-CATGCAAGACAGGAGCCAC-3’；

CYP2C9*3下游引物：5’-GTAGGAGAAACAAACTTACCTTGGGA-3’；

检测VKORC1的引物：

VKORC1上游引物：5’-CCAAAATGCTAGGATTATAGGC-3’；

VKORC1下游引物：5’-GTCAAGCAAGAGAAGACCTG-3’。

2.与权利要求1所述引物组合配套使用的探针组合，其特征在于，所述探针组合中的探针如SEQ ID NO.3-4和SEQ ID NO.7-8所示。

3.根据权利要求2所述的探针组合，其特征在于，所述探针组合包括：

检测CYP2C9的探针：

CYP2C9*3野生型探针:5’-AGAAGGTCAA+TGTATC-3’；

CYP2C9*3突变型探针:5’-AGAAGGTCAA+GGTATC-3’；

检测VKORC1的探针：

VKORC1野生型探针:5’-CGCACC+CGGCCAAT-3’；

VKORC1突变型探针:5’-CACCGCACC+TGGCC-3’；

其中，“+”表示右侧的单碱基为LNA修饰。

4.含有权利要求1所述引物组合和权利要求2或3所述探针组合的检测试剂或试剂盒。

5.一种检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括权利要求1所述的引物组合与权利要求2或3所述的探针组合。

6.根据权利要求5所述的PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液还包括DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液、MgCl₂和细胞裂解液。

7.根据权利要求6所述的PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液中各组分的终浓度为：0.5-1.5×PCR反应缓冲液、DNA聚合酶0.04-0.1U/μL、dNTPs0.1-0.5mM、上游引物0.2-0.8μM、下游引物0.2-0.8μM、野生型探针0.2-0.7μM、突变型探针0.2-0.7μM、Mg²⁺1-2.5mM和1×细胞裂解液；

其中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.0005％-0.015％(w/v)；聚乙二醇辛基苯基醚的浓度为0.001-0.03％(w/v)。

8.根据权利要求7所述的PCR反应液，其特征在于，CYP2C9的PCR反应体系中各组分的终浓度为：1.1×PCR反应缓冲液、DNA聚合酶0.05U/μL、dNTPs0.2mM、上游引物0.5μM、下游引物0.5μM、野生型探针0.4μM、突变型探针0.4μM、Mg²⁺2.5mM和1×细胞裂解液；

VKORC1的PCR反应体系中各组分的终浓度为：1.1×PCR反应缓冲液、DNA聚合酶0.05U/μL、dNTPs0.2mM、上游引物0.5μM、下游引物0.5μM、野生型探针0.3μM、突变型探针0.3μM、Mg²⁺2.5mM和1×细胞裂解液。

9.基于POCT模式的CYP2C9和VKORC1基因型快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求6-7任一所述的PCR反应液。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒进行荧光定量PCR时，其工作程序为：95℃预变性5min，循环1次；95℃变性8s，63℃退火及延伸35s，循环50次。