CN110819701A

CN110819701A - 用于荧光定量pcr检测cyp2d6基因多态性的方法

Info

Publication number: CN110819701A
Application number: CN201911297015.8A
Authority: CN
Inventors: 李晓娇; 智慧芳; 倪君君
Original assignee: Jilin Hehe Medical Laboratory Co Ltd
Current assignee: Jilin Hehe Medical Laboratory Co Ltd
Priority date: 2019-12-16
Filing date: 2019-12-16
Publication date: 2020-02-21

Abstract

本发明提供一种用于荧光定量PCR检测CYP2D6基因多态性的引物探针组合，包括引物和双探针如序列表所示；同时提供一种荧光定量PCR检测CYP2D6基因多态性的方法。本发明采用实时荧光定量PCR Taqman‑MGB探针的方法检测CYP2D6基因多态性，并且采用了野生型与突变型双探针的检测方法，不但提高了特异性，还降低了成本；Taqman‑MGB探针在实验结果的准确性、重复性、特异性、灵敏度等方面均优于普通的探针。因此，本发明建立的CYP2D6基因多态性的方法存在结果准确、特异性灵敏度高、无毒害无污染、成本低廉、快速高效等优点。

Description

用于荧光定量PCR检测CYP2D6基因多态性的方法

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其是涉及用于荧光定量PCR检测CYP2D6基因多态性的引物探针组合及检测方法。

背景技术

CYP2D6是细胞色素P450酶系中重要的一种氧化代谢酶，在生物体的内源性物质和外源性物质的代谢中发挥重要作用。它主要表达于小肠、肝脏和肺，位于人类染色体22q13.1，总长约为7Kb，有9个外显子，8个内含子，编码497种氨基酸。目前已发现CYP2D6基因的70多种遗传变异，这些基因多态性的不同突变类型对酶活性和药物代谢的影响不一。CYP2D6根据各基因型的活性划分为：弱代谢型(PMs)、中间代谢型(IMs)、强代谢型(EMs)、超强代谢型(UMs)。导致CYP2D6酶活性缺失的多态性可影响他莫昔芬、安替比林、可待因、β受体阻滞剂如美托洛尔和卡维地洛、氯丙咪嗪、去甲替林、地昔帕明、多虑平、丙咪嗪、马普替林、奥匹哌醇、三甲丙咪嗪、昂丹司琼、曲马多等的体内代谢，从而影响这些药物的疗效和不良反应的发生。

CYP2D6*10，是中国人中主要的基因突变类型，是CYP2D6外显子1上C188→T的点突变引起蛋白酶第34位Pro(P)变成Ser(S)，致使形成活性低且不稳定的代谢酶，是引起功能改变的主要因素，CYP2D6*10突变型纯合子(T/T)，为弱代谢型，酶活性最低，代谢慢，最易发生不良反应。我国人群中，出现最多的是杂合子(w/m)，所占比例大于40％，其次是突变型纯合子(m/m)约占40％，而野生型纯合子(w/w)最少，少于20％，说明我国携带正常活性等位基因者所占比例最少，而突变纯合子比较多。而后者减弱对药物的代谢，在服用同一剂量药物时更易发生药物不良反应。

目前，对于CYP2D6基因多态性检测的方法有很多种，如限制性长度多态性分析(RFLP)、直接测序法、印记杂交法、Taqman技术、等位基因特异性扩增法(ARMS)等。其中，最常用的测序法能够直接检测突变位点的位置和类型，但该方法操作步骤繁琐，检测周期长，灵敏度低，且扩增产物容易产生污染。

发明内容

为了解决上述缺陷，本发明的技术目的是提供用于荧光定量PCR检测CYP2D6基因多态性的引物探针组合及检测方法，该方法运用引物与双探针组合的检测方法，具有结果准确、特异性灵敏度高、无毒害无污染、成本低廉、快速高效等优点。

为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：一种用于荧光定量PCR检测CYP2D6基因多态性的引物探针组合，包括引物对和双探针，其核苷酸序列：上游引物由SEQ ID NO.1所示，下游引物由SEQ ID NO.2所示，荧光探针1由SEQ ID NO.3所示，荧光探针2由SEQ ID NO.4所示。

本发明的引物探针组合尤其是针对CYP2D6基因的CYP2D6*10c.100C＞T位点的检测所特别设计的，可以高效率、高特异性、准确地扩增出CYP2D6基因的特异性基因片段。本发明的引物探针组合，荧光探针在5′末端区域标记有荧光基团，在3′末端区域标记有淬灭基团，荧光探针1和荧光探针2的荧光基团不相同。其中所述荧光基团选自FAM、TET、VIC、ROX、Texas Red-X、Cy3、Cy5中的至少一种，优选FAM、TET、VIC、ROX中的至少一种；淬灭基团选自TAMRA、BHQ、DABCYL、NFQ-MGB中的至少一种，优选TAMRA、BHQ、NFQ-MGB中的至少一种。根据本发明一种最优选的实施方案，荧光探针的选择是：荧光探针1的5′端标记有FAM的荧光基团，荧光探针2的5′端标记有VIC荧光基团，荧光探针的3′端均标记有NFQ-MGB的淬灭基团。

本发明采用实时荧光定量PCR Taqman-MGB探针的方法检测CYP2D6基因多态性，并且采用了野生型与突变型双探针的检测方法，不但提高了特异性，还降低了成本；Taqman-MGB探针在实验结果的准确性、重复性、特异性、灵敏度等方面均优于普通的探针。因此，本发明建立的CYP2D6基因多态性的方法存在结果准确、特异性灵敏度高、无毒害无污染、成本低廉、快速高效等优点。

经过多次试验证明，本发明提供的引物探针组合具有较好的特异性和扩增准确性，可以应用于制备荧光定量PCR检测CYP2D6基因多态性的试剂盒，通过制备成成品试剂盒，可以在采集了样品试验后，快速准确地得出CYP2D6基因多态性的结果。

所述试剂盒，主要是包括本发明提供的引物探针组合，其中引物的终浓度优选为：上下游引物的终浓度均为0.2-1.0μM；荧光探针的终浓度均为0.05-1.0μM。其他PCR试剂可以根据常规技术选择，例如优选的技术方案是，还包含DNA聚合酶、缓冲液、尿嘧啶DNA糖基酶、dNTPs和超纯水。

在制作成品试剂盒时，还可以根据实际需要，选择性的配制用于提取样品DNA的试剂或者专业的DNA提取试剂盒；可以更方便快捷地得到待检测样品的DNA，增强本发明的检测成品试剂盒的使用方便和快捷性。所述待测样品可以为任何含有基因组DNA的血液、细胞、组织或口腔拭子样品。

在本发明提供的引物探针的基础上，本发明进一步提供一种用于荧光定量PCR检测CYP2D6基因多态性的检测方法，采用所述的引物探针进行荧光定量PCR检测。

根据一种优选的实施方式，所述检测方法的具体步骤是：

(1)从待测样品中提取基因组DNA，作为扩增模板；

(2)配制包含所述引物探针组合和所述扩增模板的荧光定量PCR反应体系，各反应体系中，上下游引物的终浓度均为0.2-1.0μM；荧光探针的终浓度均为0.05-1.0μM；

PCR扩增体系包括：2×TaqMan PCR反应混合物(DNA聚合酶、缓冲液、尿嘧啶DNA糖基酶、dNTPs(含dUTP))、扩增CYP2D6*10c.100C＞T位点的上下游引物和野生型、突变型特异性荧光探针、超纯水和DNA模板，反应体系体积为10-50μl；

(3)荧光PCR扩增反应，条件：90-98℃，预变性，5-20min；90-98℃，变性，10-50s；55-69℃，退火，60-120s；68-75℃，延伸，10-300s；30-50个循环；

(4)扩增完成后，根据散点图自动读取基因型，每个点代表一个样品，每个数据集代表一种基因型：野生型(*1/*1CC)、杂合突变型(*1/*10CT)、纯合突变型(*10/*10TT)、空白对照(NTC)。

本发明适用任何市面上常见的荧光定量PCR仪，具体包括ABI荧光定量PCR仪(ABI7300，ABI7500，ABI ViiA7、ABI Stepone plus(Stepone))；Roche(罗氏)荧光定量PCR仪LightCycler480；Bio-rad(伯乐)荧光定量PCR仪CFX96TM等。可根据不同PCR仪选用不同荧光探针进行PCR扩增。

本发明采用实时荧光定量PCR Taqman-MGB探针的方法检测CYP2D6基因多态性，并且采用了野生型与突变型双探针的检测方法，不但提高了特异性，还降低了成本；MGB-Taqman探针在实验结果的准确性、重复性、特异性、灵敏度等发面均优于普通的探针。因此，本发明建立的CYP2D6基因多态性的方法存在结果准确、特异性灵敏度高、无毒害无污染、成本低廉、快速高效等优点。

本发明检测方法的优点和效果如下：

(1)单管内同时加入突变型和野生型两种探针，操作简单、减少成本、结果分析更清晰明了，提高了检测效率，可进行大批量样本的检测，有利于临床操作。

(2)使用Taqman-MGB特异性探针对基因多态性检测，特异性强、结果准确性高。检测结果与测序结果完全一致。

(3)整个检测过程均在同一个PCR管内进行，无需开盖分析，不易造成气溶胶污染；无需进行电泳分析，不接触有毒有害试剂。

(4)从样本接收、DNA提取到PCR扩增全部检测过程可在4小时内完成。可同时检测大批量样本，提高了检测效率，节约了时间成本。

本发明的检测方法能快速、准确、高效的检测CYP2D6*10多态性，使假阳性和假阴性的发生概率降到了最低，并为根据CYP2D6*10的基因多态性结果给出阿米替林次用量提供了技术支持。

附图说明

图1为各基因型分布情况。

具体实施方式

为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明。非特殊说明，本发明实施所采用的试剂均为市售商品，本发明实施所采用的数据库均为公开的在线数据库。以下实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1

一种检测CYP2D6基因多态性的方法待测DNA样本的制备方法，包括如下步骤：用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取基因组DNA，并采用NP80-touch(德国IMPLEN)测定DNA的浓度及纯度，然后保存基因组DNA。

实施例2

1.引物和探针设计

本发明根据CYP2D6*10基因位点的碱基序列分别设计特异性引物和特异性荧光探针，特异性引物通过Primer Premier 5.0在包含SNP位点的两端设计引物，通过软件分析选择最适合的引物；特异性探针位于一对引物之间的区域，其中Tm值应当在60-70℃之间，通常比引物高5-10℃。其中检测野生型的探针5’端采用荧光报告基团(FAM)标记，检测突变型的探针5’端采用荧光报告基团(VIC)标记，3’端采用非荧光淬灭基团(NFQ)标记，同时探针上还链接有MGB修饰基团；在实际操作中可根据实际情况更换荧光报告基团，只要保证野生型和突变型探针的荧光报告基团不一致。

本发明的引物及探针见表1：

表1 PCR引物探针序列

2.体系配制及PCR扩增

通过荧光定量PCR反应扩增出CYP2D6基因目的片段，引物和探针分别按照1∶1混合，反应体系见表2，按照表3的反应程序进行扩增；实验过程设置空白对照，以超纯水为模板。

表2 PCR扩增反应体系

试剂成分	体积
		2×TaqMan PCR Mix	12.5μl
Probe Mix	3μl
		Primer Mix	3μl
DNA	2μl
		水	4.5μl

表3多重PCR反应条件

*表示接受荧光信号位置。

实施例2选用ABI 7500用于扩增，但本发明不仅局限于ABI 7500，它适用任何荧光定量PCR仪，可根据不同PCR仪选用不同荧光探针进行检测。

3.基因分型结果判读

扩增完成后，根据散点图自动读取基因型(图1)，每个点代表一个样品，每个数据集代表一种基因型：野生型(*1/*1CC)、杂合突变型(*1/*10CT)、纯合突变型(*10/*10TT)、空白对照(NTC)。

本发明检测结果与“金标准”测序方法比较，结果符合率为100％，其检测方法有很好的特异性。

实施例3：试剂盒的配制

根据上述实验结果，本实施例提供一种优选的用于荧光定量PCR检测CYP2D6基因多态性的试剂盒，所述试剂盒中包含以下试剂：

1、2×TaqMan PCR Mix：DNA聚合酶、缓冲液、尿嘧啶DNA糖基酶、dNTPs(含dUTP)；

2、Probe Mix：荧光探针的终浓度均为0.6μM；

3、Primer Mix：引物对，F上游引物和R下游引物终浓度均为0.6μM，；

4、样品DNA提取试剂；

5、样品采集收纳盒(如包含口腔拭子和拭子收纳盒/管)；

6、超纯水。

所述试剂在试剂盒中合理安放，再放入试剂盒的使用说明(可选择性再配置PCR试管或孔板或移液枪)，所述使用说明包括待测样品的采集步骤，采集后放入收纳盒/管中，再进行DNA提取步骤，最后按照上述的检测方法进行PCR扩增过程。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 吉林和合医学检验有限公司

<120> 用于荧光定量PCR检测CYP2D6基因多态性的方法

<130> ss191-253

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ctcctggtgg acctgatgca 20

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gtgttctgga agtccacatg cag 23

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

acgctaccca ccaggc 16

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

cacgctactc accaggc 17

Claims

1.一种用于荧光定量PCR检测CYP2D6基因多态性的引物探针组合，其特征在于，包括引物对和双探针，其核苷酸序列：上游引物由SEQ ID NO.1所示，下游引物由SEQ ID NO.2所示，荧光探针1由SEQ ID NO.3所示，荧光探针2由SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述检测CYP2D6基因多态性是检测CYP2D6基因的CYP2D6*10c.100C＞T位点。

3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光探针在5′末端区域标记有荧光基团，在3′末端区域标记有淬灭基团，荧光探针1和荧光探针2的荧光基团不相同。

4.根据权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、TET、VIC、ROX、Texas Red-X、Cy3、Cy5；淬灭基团选自TAMRA、BHQ、DABCYL、NFQ-MGB。

5.根据权利要求3或4所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光探针，荧光探针1的5′端标记有FAM的荧光基团，荧光探针2的5′端标记有VIC荧光基团，所有荧光探针的3′端均标记有NFQ-MGB的淬灭基团。

6.权利要求1-5任一项所述的引物探针组合在制备用于荧光定量PCR检测CYP2D6*10c.100C＞T位点基因多态性的试剂盒中的应用。

7.一种用于荧光定量PCR检测CYP2D6基因多态性的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-5任一项所述的引物探针组合。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包含DNA聚合酶、缓冲液、尿嘧啶DNA糖基酶、dNTPs和超纯水。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包含待测样品DNA提取试剂或DNA提取试剂盒。

10.一种用于荧光定量PCR检测CYP2D6基因多态性的检测方法，其特征在于，采用权利要求1-5任一项所述的引物探针组合对待测样品进行荧光定量PCR检测，包括步骤：

(1)从待测样品中提取基因组DNA，作为扩增模板；

(4)扩增完成后，根据散点图自动读取基因型，每个点代表一个样品，每个数据集代表一种基因型：野生型：*1/*1CC；杂合突变型：*1/*10CT；纯合突变型：*10/*10TT；空白对照：NTC。