CN101054601A - 一种检测细胞色素p450酶系突变位点的寡核苷酸探针及基因芯片 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一套用于检测CYP450酶基因热点突变位点的寡核苷酸探针及其用途，属于临床分子诊断领域。探针分别设计在CYP450各亚型酶DNA全基因序列上，具有较高的灵敏度和特异性。本发明还提供了一种检测细胞色素P450酶系突变位点的基因芯片，能够对临床DNA标本进行基因分型检测，可用于多种方面，如P450基因型诊断、指导临床用药、预防药物不良反应等。

Description

一种检测细胞色素P450酶系突变位点的寡核苷酸探针及基因芯片

技术领域

本发明属于DNA基因型的核酸检测技术范畴。具体的说，本发明涉及一套能够检测人体肝细胞色素CYP450酶系统中的亚型酶CYP1A2*1F、CYP1A2*1C、CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2D6*10、CYP2D6*2和CYP3A4*18的代表性突变位点基因型的寡核苷酸探针，该套探针的序列及用途。

背景技术

细胞色素P450广泛存在于动物、真核有机体、植物、真菌和细菌中，是必不可少的结构酶。细胞色素P450参与药物在肝内降解的第I相反应。据估计，60％普通处方药需要通过细胞色素P450系统进行生物转化。细胞色素P450超家族依次可分为家族、亚家族和亚型。人类已确定357个细胞色素P450基因和33个假基因，分为18个家族，42个亚家族，各基因尚存在着大量等位基因，调控180多个人类细胞色素P450亚型蛋白质。大量等位基因的存在是细胞色素P450引起药物氧化代谢个体差异和种族差异的生化基础。细胞色素P450系统广泛分布于肝、肾、脑、皮肤、肺、胃肠道、胎盘组织，肾上腺、主动脉等处组织，细胞的内质网，线粒体和核膜内均有细胞色素P450表达。细胞色素P450催化反应可发生在体内不同的组织器官，但最重要的器官是肝脏。细胞色素催化体内多种反应，包括氧化N还原作用，环氧化作用，UN脱羟基作用，VN脱羟基作用，WN氧化和羟基化作用。细胞色素P450可代谢大约25万种外源性物质，包括药物，环境中的化合物和污染物，自然界中植物产物，杀虫剂，卤化烃，多环芳香烃、芳基胺、燃烧的成分，除草剂等。

目前，困扰临床医疗及制药行业最常见的问题是不同病人对同一药物的反应不同，表现为不同的药物疗效和毒副作用。1998年的一项统计表明：美国医院中每年有10万病人因为药物的毒副作用而死亡，是美国人身死亡的第四大原因(Lazarou，1998)。1995年的一份评估显示，1994年全美国由于不合适的药物处方使用带来的健康护理系统上的额外花销和浪费竟比这些药物本身的价值还要高出36亿美元(Johnson，1995)。另外，在新药研发过程中，相当一部分具有良好药理活性的药物因在三期临床实验中少数个体严重的毒副作用而被剔除，造成前期巨大投入的浪费和新药研制成本居高不下。研究表明，临床药物治疗产生的药物不良反应的产生主要分为两大类，一类是由于P450代谢酶与药物的相互作用引起的，最常见的是P450的诱导和抑制；另一类是由P450酶基因多态性引起的，造成酶代谢功能的变化，而且这种变化存在显著的患者之间的个体差异。因此，药物代谢酶基因多态性与药物反应个体差异之间的相关性研究是药物基因组学研究中的重要组成部分，也是目前研究比较深入的领域。从理论上讲，所有的药物代谢酶都具有遗传多态性。绝大多数药物代谢酶的多态性是一种单基因性状，是由于同一基因位点上具有多个等位基因引起的。等位基因所编码的代谢酶具有不同的代谢能力：正常野生型表现为快代谢型(EM，extensive metabolism)；绝大多数突变型等位基因，因碱基的突变、插入或缺失而造成酶代谢能力降低，表现为慢代谢型(PM，poormetabolism)；极少数突变型因基因多拷贝重复造成酶的过量表达，表现为超快代谢型(UM，ultrarapid metabolism)。这种多态性造成了不同个体间药物代谢反应的差异，是产生药物毒副作用、降低或丧失药物疗效的主要原因之一。

通过对受试者的基因型分子诊断来实现临床个体化医疗，需要对个体基因型进行检测，而基因分型技术作为目前常用的基因分型方法，大致可分为两类：一类是基于凝胶电泳的技术，如PCR反应结合限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)，多重PCR，等位基因特异性扩增(AS-PCR)等。基于构象的SNP检测方法相对简单快速，但是不能给出序列信息，因而无法确定具体突变位点与突变形式，不能区分一个片段中的多个突变，而且对操作者技术要求较高，难以推广；另一类是基于荧光标记杂交反应的基因分型技术，包括寡核苷酸连接分析，焦磷酸法DNA测序，直接杂合子测序以及等位基因特异性引物延伸等。这类方法需要投入大量的资金用与购置专用仪器和探针等配套试剂，只有实现高通量检测，降低使用成本，才能得到广泛运用。

DNA芯片(DNA microarrays)是近年来发展成熟的一种高通量基因检测技术，是分子生物学发展史上的又一重大技术突破，其特点是实验操作和数据处理的集成化、微型化、自动化。DNA芯片能够进行快速多基因平行检测，是一种发展前景广阔的多基因大规模检测新技术。DNA芯片技术检测的关键之处在于设计、筛选一系列高特异性、高灵敏度、高稳定性的匹配探针，固定于玻璃片等固相载体上，利用样品与探针的杂交反应，经扫描、分析后即可得出正确的结果。就本实验而言，通过一次简单操作就可确定多个受试个体DNA样本中多个位点的基因型，极大地提高了检测效率，为临床基因诊断及个体化医疗提供了简便、快捷的技术手段。

发明内容

本发明提供了一套用于检测常见CYP450代谢酶基因热点突变位点的寡核苷酸探针，包含以下各组探针的组合：

1.CYP1A2*1F DNA-163G＞A位点检测探针

2.CYP1A2*1C DNA-3860A＞C位点检测探针

3.CYP2C9*3DNA1075A＞C位点检测探针

4.CYP2C19*2DNA681G＞A位点检测探针

5.CYP2C19*3DNA991G＞A位点检测探针

6.CYP2D6*10DNA188C＞T位点检测探针

7.CYP2D6*2DNA4268G＞C位点检测探针

8.CYP3A4*18DNA878T＞C位点检测探针

本发明还提供了各部分探针的核苷酸序列，并对其长度进行了优化，以提高探针的检测特异性和灵敏度，详见表1-1。

利用上述寡核苷酸探针，可通过核酸杂交反应对人体基因组DNA样本进行检测，尤其适用于基于基因芯片技术的检测。利用探针可同时检测出纯合野生型、纯合突变型和杂合突变型三种基因型位点的DNA片段，从而直接判断得到分型结果。

另一方面，本发明还提供了用于检测细胞色素P450酶系突变位点的基因芯片，包括固定在固相载体上的与检测位点DNA正链的碱基序列一致的寡核苷酸片段，其中特征片段相应于SEQ ID NO：1～16的序列。

本发明还提供了一种检测细胞色素P450酶系突变位点的方法，包括如下步骤：

(1)选用前述的基因芯片；

(2)标记特异性引物，扩增待测DNA样品；

(3)在适于与所选基因芯片进行杂交的条件下，加入待测样品的PCR产物并反应足够时间；

(4)扫描分析杂交反应结果。

具体的说，本发明内容是这样实现的：

首先在NCBI的核酸数据库中查找选取的CYP450酶各亚型酶基因组DNA的全序列，下载序列文档，利用分子生物学软件Primer5.0在选取位点上下游各15个碱基范围内寻找特异性的探针，在包含检测位点的一定范围内设计特异性扩增引物，将特异性扩增DNA片段长度限制在150-250碱基之间。共设计8对16条寡核苷酸探针。寡核苷酸探针序列与上述基因特定区域DNA正链的碱基序列一致(探针序列见表1-1)。

利用上述的一套探针，可以通过杂交反应对人体基因组DNA样本进行检测，尤其适用于基于DNA芯片原理的检测，具有较高的灵敏度和特异性。在进行基于DNA芯片原理的检测时，需要把探针全部或其中一部分用适当的方法固定于固相载体上(如玻璃片、硅基片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等)，成为M×N排布的探针阵列，即为DNA芯片。然后利用优化的相应的PCR引物扩增待检人体基因组DNA样本，选择引物的要求是能够扩增出基因组DNA标本的包含探针所在区域的片段。在扩增的同时引入荧光标记、生物素标记或其他合适的标记物。扩增产物作为探针检测的靶分子，在一定条件下与芯片共保温30分钟至数小时，利用荧光扫描仪或其他相应的检测设备即可以检测到杂交信号。根据待测位点探针信号的比值可以判定出该位点的基因型。

本发明提供的探针能够快速、准确、高效地检测出人体基因组DNA样本中各待测位点的基因型。本发明提供的基因芯片与检测方法可以广泛用于临床个体DNA基因型诊断，在对预防临床用药导致的毒副作用、指导医生临床合理治疗、建立高效的个体化医疗体系、开展CYP450遗传学调查等方面具有显著的实用价值。

附图说明

图1为CYP450基因八个PCR产物电泳检测结果。从右至左依次为：DL2000Marker；1.CYP1A2*1F；2.CYP1A2*1C；3.CYP2C9*3；4.CYP2C19*2；5.CYP2C19*3；6.CYP2D6*10；7.CYP2D6*2；8.CYP3A4*18。

图2为八个位点二重PCR扩增产物电泳检测结果。从右至左依次为：DL2000Marker；5/8.CYP2C19*3和CYP3A4*18；3/7.CYP2C9*3和CYP2D6*2；2/4.CYP1A2*1C和CYP2C19*2；1/6.CYP1A2*1F和CYP2D6*10。

图3为CYP450酶热点SNP位点检测基因芯片探针排列：数字1-10分别表示一张芯片可同时检测10个标本；右图为探针矩阵放大效果图；箭头下表中，W表示野生型探针，M表示突变型探针，字母右侧的数字1-8依次表示：1.CYP1A2*1F；2.CYP1A2*1C；3.CYP2C9*3；4.CYP2C19*2；5.CYP2C19*3；6.CYP2D6*10；7.CYP2D6*2；8.CYP3A4*18。

图4为基因芯片与野生型和突变型重组质粒的荧光标记PCR产物杂交扫描结果(左侧为野生型质粒，右侧为突变型质粒)，杂交图均系二重PCR扩增产物杂交结果。

图5为基因芯片与四个不同临床DNA样本的荧光标记PCR产物杂交扫描结果，杂交图均系二重PCR扩增产物杂交结果。

具体实施方式：

为了进一步说明一套用于同时检测上述CYP450各亚型酶八个位点寡核苷酸探针的实施方式和用途，参照以下实施例进行说明。实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明的范围，本领域技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。

实施例1.检测CYP450八个SNP位点的寡核苷酸探针的筛选和优化

1.寡核苷酸基因芯片的制备和寡核苷酸探针的设计和筛选优化

探针分别设计在人体CYP450酶系统各亚型酶DNA序列上，具有较高的灵敏度和特异性，寡核苷酸探针序列与上述基因特定区域DNA正链的碱基序列一致。探针合成时在其3’端氨基修饰，用于探针与载玻片表面的活性醛基发生反应并固定到载体表面。将备选寡核苷酸探针纯化、定量后，用基因芯片点样仪点到醛基活化的载玻片上，制成探针微阵列。

以基因组DNA为模板的PCR产物经试剂盒纯化后，用T4DNA连接酶连接至PGEM^T4-载体上，转化感受态大肠杆菌dH5α。经测序验证重组质粒为野生型后，再以野生型重组质粒为模板，采用突变引物构建特定位点引入突变碱基的目的片段，经过纯化，连接转化，经测序验证获得突变型重组质粒。以重组质粒作模板进行特异性扩增，用荧光标记的PCR产物与基因芯片杂交，得到各探针的杂交图(优化的质粒杂交见附图4)。针对不同的基因片段，根据芯片杂交结果选择各自特异性好，灵敏度高的探针。探针长度在15-18碱基之间。(探针序列见表1-1)

表1-1：检测CYP450八个SNP位点的寡核苷酸探针备选序列

探针名称	探针序列(5’-3’)	探针长度(BP)
			1W1M2W2M3W3M4W4M5W5M6W6M7W7M8W8M	gc ctc tcg gat tca agcgc ctc tca gat tca agtgt ggg cac agg acgtgt ggg ccc agg acgaga gat aca ttg acc ttcaga gat acc ttg acc ttccac ccc ctg gat cca gcac ccc ctg aat cca gtta ttt ccc ggg aac ccatta ttt ccc agg aac ccagca cgc tac cca cca ggcgca cgc tac tca cca ggccct ggt gag ccc atc cccct ggt gac ccc atc cctcc gat ctg gag ctctcc gat ccg gag ctc	16171515181816161818181817171515

2.扩增含有靶基因片断的PCR引物的设计和优化

根据CYP450各亚型酶DNA全基因序列设计引物，引物序列见表1-2。利用引物扩增的PCR产物序列中包含各靶基因片段上的探针序列。所有反向引物序列5’端用荧光素Cy3标记，以保证PCR产物经杂交反应后，带有荧光的反向互补链与核苷酸探针结合产生可检测信号。分别对八对引物进行四套二重PCR扩增条件的优化(优化的PCR反应电泳检测结果见附图2)。

              表1-2：用于扩增含有探针序列靶基因片段的引物序列

基因名称	引物序列(5’---3’)	产物长度(bp)	备注
				CYP1A2CYP2C9CYP2C19CYP2D6CYP3A4	agc tac aca tga tcg agc tat accac acc tgt aat tcc agc tac tccag ctc tca gat tct gtg atg ctctga gat gga gac att cat tca ttcacg tgt gat tgg cag aaa ccg gag cggg act tcg aaa aca tgg agt tgc agagc aat ttc tta act tga tggatc ttt tcc aga tat tca ccccag agc ttg gca tat tgt atc tat acgat cag gaa gca atc aat aaa gtc ctga tag tgg cca tct tcc tgc tccag tat ggt gtg ttc tgg aag tcccgc atg gag ctc ttc ctc ttc ttcacc cca ttc tag cgg ggc aca gcccc tac att gat ctg att tac ctaa tga agg aga gaa cac tgc tc	190164212216236150155232	正向引物反向引物正向引物反向引物正向引物反向引物正向引物反向引物正向引物反向引物正向引物反向引物正向引物反向引物正向引物反向引物

实施例2.寡核苷酸探针的特异性和灵敏度评价

1.基因芯片制备  将寡核苷酸探针用点样液(6×SSC，0.1％SDS)稀释至终浓度50μmol/L，取5ul转移至384孔板。用Cartesian芯片制备仪将探针点到醛基片上(探针排列见附图3，芯片分别与CYP450酶基因组DNA的荧光标记PCR产物杂交结果见附图5)。

热点突变位点CYP450寡核苷酸芯片特异性检测

在优化好的两套二重PCR扩增和杂交反应条件下，检测了36个临床DNA样本，以DNA样本为模板进行四套二重PCR扩增，产物与芯片杂交。其中出现信号的探针均与其杂交的产物片段对应，任何一个片段单独杂交时该位点探针以外的探针不出现信号。这说明所选取的用于检测上述八个CYP450酶基因SNP位点的探针是特异的，也说明本实验建立在四套二重PCR基础上，同时检测CYP450酶八个SNP位点的基因分型芯片是可靠的。

以上实施例的技术要点如下：

1.寡核苷酸合成  寡核苷酸(引物或探针)采用标准亚磷酰胺化学方法在自动合成仪(ABI8909)上合成。所有荧光引物在合成中用Cy3亚磷酰化试剂在5’端进行标记。所有寡核苷酸探针在3′端进行氨基修饰，氨基与探针序列之间以间隔臂(聚乙二醇磷酰化试剂)相连。合成完毕用浓氨水55℃作用15小时脱保护/切割，OPC柱纯化。紫外定量，冻存备用。

2.多重PCR扩增  20ul常规PCR反应体系中，正、反向引物浓度均0.5μM，dNTP为100μM，1U Taq DNA聚合酶，1×PCR反应缓冲液，50-100ng模板DNA；扩增条件为：预变性(94℃，5min)；35个循环：变性(94℃，30sec)，退火(58℃，30sec)延伸(72℃，40sec)；延伸(72℃，5min)。

多重不对称PCR反应中，两对引物之间浓度的改变对目的基因的扩增效率有明显的影响，每个基因的正向与反向荧光引物的比例和杂交信号的强弱密切相关。经过多次实验优化，使一个反应管中两个产物均能达到相近而且较好的扩增效率和杂交信号。优化的结果为：一套二重PCR反应中的正向引物浓度分别为0.1μM、0.1μM，反向荧光标记引物浓度分别为0.5μM、0.5μM。20ul反应体系中，dNTP为200μM，MgCl₂为3mmol，2U TaqDNA聚合酶，1×PCR反应缓冲液；扩增条件为：预变性(94℃，5min)；35个循环：变性(94℃，30sec)，退火(58℃，30sec)延伸(72℃，40sec)；延伸：(72℃，5min)。

3.热点突变位点CYP450寡核苷酸芯片制备寡核苷酸探针用点样液(6×SSC，0.1％SDS)稀释至终浓度50μmol/L，取5ul转移至384孔板。用Cartesian芯片制备仪将探针点到醛基片(Telechem)上，点样仪内保持温度为23℃，相对湿度大于85％。寡核苷酸芯片制备完毕后，置于载玻片盒内室温放置备用。点样后的芯片在使用前至少在室温放置24h。

4.热点突变位点CYP450寡核苷酸芯片杂交与检测

4.1寡核苷酸基因芯片预处理  寡核苷酸芯片用0.2％SDS清洗2次，接着以水清洗2次，晾干后用于杂交。

4.2杂交和杂交后处理  荧光标记的PCR产物变性(98℃、5min，冰浴、5min)后与杂交液(8×SSC，3％甲酰胺，0.2％SDS)混匀，取10μl转移至芯片反应区，芯片置于杂交盒内，连同杂交盒浸入42℃水浴中反应60分钟，杂交后的芯片依次在洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中于室温各洗涤1min。置室温晾干。

4.3扫描和结果判定  芯片用芯片扫描仪GenePix 4000B进行扫描，用GenePix Pro 4.0软件分析结果。

                                核苷酸序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所

<120>一种检测细胞色素P450酶系突变位点的寡核苷酸探针及基因芯片

<160>16

<210>1

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

GCCTCTCGGA TTCAAG    16

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

CGCCTCTCAG ATTCAAG    17

<210>3

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

TGTGGGCACA GGACG    15

<210>4

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

TGTGGGCCCA GGACG    15

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

AGAGATACAT TGACCTTC    18

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

AGAGATACCT TGACCTTC    18

<210>7

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

CACCCCCTGG ATCCAG 16

<210>8

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

CACCCCCTGA ATCCAG    16

<210>9

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

TTATTTCCCG GGAACCCA    18

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

TTATTTCCCA GGAACCCA    18

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

GCACGCTACC CACCAGGC    18

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

GCACGCTACT CACCAGGC    18

<210>13

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

CCTGGTGAGC CCATCCC    17

<210>14

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

CCTGGTGACC CCATCCC    17

<210>15

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

TCCGATCTGG AGCTC    15

<210>16

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

TCCGATCCGG AGCTC    15

Claims (7)

1.一套检测细胞色素P450酶系突变位点的寡核苷酸探针，其特征在于包含检测以下各组基因突变位点的全部或部分探针的组合：

(1)CYP1A2*1F的DNA-163G＞A位点检测探针；

(2)CYP1A2*1C的DNA-3860A＞C位点检测探针；

(3)CYP2C9*3的DNA1075A＞C位点检测探针；

(4)CYP2C19*2的DNA681G＞A位点检测探针；

(5)CYP2C19*3的DNA991G＞A位点检测探针；

(6)CYP2D6*10的DNA188C＞T位点检测探针；

(7)CYP2D6*2的DNA4268G＞C位点检测探针；

(8)CYP3A4*18的DNA878T＞C位点检测探针。

2.如权利要求1所述的一套寡核苷酸探针，其特征在于各组探针的核苷酸序列为：

探针(1)核苷酸序列为SEQ-1和SEQ-2；

探针(2)核苷酸序列为SEQ-3和SEQ-4；

探针(3)核苷酸序列为SEQ-5和SEQ-6；

探针(4)核苷酸序列为SEQ-7和SEQ-8；

探针(5)核苷酸序列为SEQ-9和SEQ-10；

探针(6)核苷酸序列为SEQ-11和SEQ-12；

探针(7)核苷酸序列为SEQ-13和SEQ-14；

探针(8)核苷酸序列为SEQ-15和SEQ-16。

3.如权利要求1所述的一套寡核苷酸探针，其特征在于同时包含八组探针。

4.一种检测细胞色素P450酶系突变位点的基因芯片，包括固定在固相载体上的与检测位点DNA正链的碱基序列一致的寡核苷酸片段，其中特征片段相应于SEQ IDNO：1～16的序列。

5.一种检测细胞色素P450酶系突变位点的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)选用权利要求4所述的基因芯片；

(2)标记特异性引物，扩增待测DNA样品；

(3)在适于与所选基因芯片进行杂交的条件下，加入待测样品的PCR产物并反应足够时间；

(4)扫描分析杂交反应结果。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(2)中引物标记采用荧光标记或生物素标记。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(3)所述反应条件为42℃水浴中反应60分钟。

Images