CN1302121C - 苯丙酮尿症诊断的dna芯片 - Google Patents

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CN1302121C CNB2004100726217A CN200410072621A CN1302121C CN 1302121 C CN1302121 C CN 1302121C CN B2004100726217 A CNB2004100726217 A CN B2004100726217A CN 200410072621 A CN200410072621 A CN 200410072621A CN 1302121 C CN1302121 C CN 1302121C
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Abstract

本发明公开了一种苯丙酮尿症诊断的DNA芯片，在载玻片、硅片、膜或高分子材料的表面预定区域排列和固定有检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的特异DNA探针，形成小密度的DNA探针阵列，为了有效地将探针连接和固定在载体上，在探针上连接了6～30个T碱基的氨基连接臂。在一显微镜载玻片大小的载体表面，固定6×4DNA探针，因此可同时检测苯丙氨酸羟化酶中国人常见的基因突变位点(R111X，Y204C，R243Q，W326X，Y356X，R413P)，且有平行分析和多重分析特点。在特定的洗脱条件可以区分全配杂交和单碱基失配杂交，并且可以清楚的辨别纯合子和杂合子之间的区别。适合于早期诊断、产前筛查苯丙酮尿症。

Description

苯丙酮尿症诊断的DNA芯片
技术领域
本发明涉及一种DNA诊断芯片，尤其是一种苯丙酮尿症诊断的DNA芯片。
背景技术
苯丙酮尿症(phenylketonurian，PKU)是一种先天性遗传代谢病，属常染色体隐性遗传病。患儿因体内苯丙氨酸羟化酶发生基因突变，致使苯丙氨酸在肝脏中代谢紊乱，出现严重的智能障碍，甚至死亡。在欧美地区发病率为1/10000，在我国是1/16000，杂合子频率为1/50。
PKU患儿由于苯丙氨酸羟化酶的缺乏使苯丙氨酸在体内大量堆积，并经旁路代谢途径产生一系列的毒性代谢产物使患儿产生一系列的明显中毒症状。患儿在刚出生时，由于无苯丙氨酸的摄入因此无临床表现，随着患儿的进食而连续出现智力进行性下降，皮肤色素浅，肌张力高，惊厥发生，汗和尿中有特殊的臭味，最后生活不能自理，智力严重障碍。PKU是一种常染色体隐性遗传病，患儿的父母为致病基因的携带者而患儿为纯合子。引起PKU的基因的PAH，该基因位于12q22-24.2全长约90kb，包括13个外显子和12个内含子。
现有技术的疾病相关基因突变的检测方法主要有(1)PCR-RFLP(restriction fragment length Polymorphism)，该方法利用多种限制性内切酶对基因扩增产物进行酶切，不同的基因序列将产生不同的电泳图谱则(Mercier，B.et al，Eur.J.Imunogenetics，21，105，1994)。该方法只能应用于当突变改变了某一酶切位点时。该方法的改进是在突变位点引入酶切位点法，即PCR-AIRS(attificial introduction ofrestriction on sites)(Cotton，R.G.H.Mut.ReS，285，125，1993)。(2)PCR-SSO(Sequence specific oligonucleotide)或PCR-ASO(allelespecific oligonucleotide)(Cotton，R.G.H.Mut.Res，285，125，1993；Saiki，R.K.et al，Nature，324，163，1986)，待测基因经PCR扩增后，分别与15-20bp标记的野生型和突变型探针杂交。该方法需进行同位素标记或地高辛、生物素、过氧化物酶等标记，分析过程复杂，不适宜快速分析。(4)PCR-SSP(sequence specific primers)或ASPCR(allelespecific PCR)，其原理是根据已知突变位点的性质在引物中设计一错配碱基，使之仅能扩增突变型或野生型基因。该方法较为快速简便。(Wu，D.Y，et al，Proc.Nail.Acad.Set.USA，86，2757，1989；Rust；S，et al，Nucleic Acids Research，21，3623，1993；Newton；R.et al，Nucleic Acids Research，17，2503，1989)。(4)PCR-SSCP(singl estrandedconformatlon polymorphism)，SSCP是指单链DNA分子在中性PAGE中电泳迁移率随其构象改变的性质。因此可作为基因变异的检测方法，最早由orita用于癌基因点突变和人基因组多态性研究(orita，M，et al，Proc.Nail.Acad.Set.USA，86，2766，1989)，此法仅能检测基因变异的存在，而不能确定突变的部位和内容。(5)DNA测序法是最直观准确的方法。但技术复杂价格昂贵，不能作为常规方法。
综上所述，在有关疾病相关基因突变诊断的现有技术中，存在操作繁杂，所需时间长，成本较高，难以自动化及大量样本平行分析等问题。因为PKU病症可以利用低苯丙氨酸饮食进行治疗。所以PKU的早期诊断非常重要。在美国、英国等发达国家，出生婴儿都要进行PKU诊断筛选。现有的PKU基因诊断筛选主要是利用RFLP方法检测苯丙氨酸羟化酶基因的突变，由于苯丙氨酸羟化酶基因的相关突变非常多，RFLP方法难以应付。
绝大多数遗传病目前还没有有效的治疗方法，因此预防就显得尤为重要。若能在妊娠早期诊断出胎儿是否患病，对患病胎儿进行人工流产，可防止患儿出生。产前遗传筛检，辅以人工流产，已证明是一种有效预防严重危害健康的遗传病的方法。
但是，由于苯丙氨酸羟化酶基因只在肝细胞中特异表达，不能用血细胞、羊水、绒毛细胞进行酶活性检测，因而只能进行基因突变分析。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种在显微镜载玻片大小的载体表面，固定6X4DNA探针，可同时检测苯丙氨酸羟化酶常见的基因突变位点，且有平行分析和多重分析的苯丙酮尿症诊断的DNA芯片。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种苯丙酮尿症诊断的DNA芯片，在载体的表面预定区域排列和固定有检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的特异DNA探针，形成小密度的DNA探针阵列，所说的探针的核心碱基为(下文“野生型”用“Wild”表示，“突变型”用“Mut”表示)：
R111X    Wild   CTTATCTCGTGAAAGCT
         Mut    CTTATCTCTTGAAAGCT
         Mut    CTTATCTCCTGAAAGCT
         Mut    CTTATCTCATGAAAGCT
Y204C    Wild   TGTACTCATAGCAAGCA
         Mut    TGTACTCAAAGCAAGCA
         Mut    TGTACTCAGAGCAAGCA
         Mut    TGTACTCACAGCAAGCA
R243Q    Wild   CACAGGTCGGAGGCG
         Mut    CACAGGTGGGAGGCG
         Mut    CACAGGTAGGAGGCG
         Mut    CACAGGTTGGAGGCG
W326X    Wild   CAGATTTACTGGTTTACTGTG
         Mut    CAGATTTACTTGTTTACTGTG
         Mut    CAGATTTACTAGTTTACTGTG
         Mut    CAGATTTACTCGTTTACTGTG
Y356X    Wild   GCCTACAGTACTGCTTATCA
         Mut    GCCTACAGTAATGCTTATCA
         Mut    GCCTACAGTAGTGCTTATCA
         Mut    GCCTACAGTATTGCTTATCA
R413P    Wild    GTCGTAGCGAACTGA
    Mut    GTCGTAGAGAACTGA
    Mut    GTCGTAGGGAACTGA
    Mut    GTCGTAGTGAACTGA
所述的载体是载玻片、硅片、膜、高分子材料中的一种。
为了有效地将探针连接和固定在载体上，在所述探针核心碱基的5’端连接了6～30个T碱基的氨基连接臂。
所述T碱基的氨基连接臂最好为18个。
本发明的有益效果是：在一显微镜载玻片大小的载体表面，固定6X4DNA探针，因此可同时检测苯丙氨酸羟化酶中国人常见的基因突变位点(R111X，Y204C，R243Q，W326X，Y356X，R413P)，且有平行分析和多重分析特点。在特定的洗脱条件可以区分全配杂交和单碱基失配杂交，并且可以清楚的显示纯合子和杂合子之间的区别。适合于早期诊断、产前筛查苯丙酮尿症。
附图说明
图1为苯丙酮酸尿症诊断DNA专用芯片模式图。
图中，玻片上点有6x 4x3(每个点重复3次)突变序列探针，从左到右是R413P，Y204C，R243Q，Y356X，W326X，R111X。A，G，C，T代表此处的探针与同类探针相区别的碱基。黑点代表正常基因型杂交所得的结果模式图。
图2为检测Y356X突变的苯丙酮酸尿症患者的结果模式图(其中Y356X为杂合子C&A突变位点信号)。
图3为检测正常人基因型的杂交结果图。
图4为检测Y356X基因型的杂交结果图(即自左向右第四行为C&A碱基的杂合子)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
本发明利用生物芯片技术在一种载体，如载玻片、硅片、膜或高分子材料上固定可检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的特异DNA探针，形成小密度(24/microscope slide)的DNA探针阵列。用载体表面的特异性DNA探针杂交方法来检测苯丙氨酸羟化酶基因中国人种常见突变。
导致中国人苯丙酮酸尿症的苯丙氨酸羟化酶基因常见的突变位点主要有6种，分别是R111X，Y204C，R243Q，R243Q，Y356X，R413P。
DNA探针设计：选取与PKU相关的6种苯丙氨酸羟化酶基因突变，合成相对应的野生型和突变型DNA探针，固定于载体表面。设计的相关探针的核心碱基如下：
R111X    Wild   CTTATCTCGTGAAAGCT
         Mut    CTTATCTCTTGAAAGCT
         Mut    CTTATCTCCTGAAAGCT
         Mut    CTTATCTCATGAAAGCT
Y204C    Wild   TGTACTCATAGCAAGCA
         Mut    TGTACTCAAAGCAAGCA
         Mut    TGTACTCAGAGCAAGCA
         Mut    TGTACTCACAGCAAGCA
R243Q    Wild   CACAGGTCGGAGGCG
         Mut    CACAGGTGGGAGGCG
         Mut    CACAGGTAGGAGGCG
         Mut    CACAGGTTGGAGGCG
W326X    Wild   CAGATTTACTGGTTTACTGTG
         Mut    CAGATTTACTTGTTTACTGTG
         Mut    CAGATTTACTAGTTTACTGTG
         Mut    CAGATTTACTCGTTTACTGTG
Y356X    Wild   GCCTACAGTACTGCTTATCA
         Mut    GCCTACAGTAATGCTTATCA
         Mut    GCCTACAGTAGTGCTTATCA
         Mut    GCCTACAGTATTGCTTATCA
R413P    Wild   GTCGTAGCGAACTGA
         Mut    GTCGTAGAGAACTGA
         Mut    GTCGTAGGGAACTGA
         Mut    GTCGTAGTGAACTGA
所述的载体是载玻片、硅片、膜、高分子材料中的一种。
为了有效地将探针连接和固定在载体上，在所述探针核心碱基的5’端连接了6～30个T碱基的氨基连接臂。
所述T碱基的氨基连接臂最好为18个。
下面对本发明进行进一步详细的说明：
1、基因组DNA的制备
按照Takara公司Genome DNA Extraction kit的说明提取DNA，每300uL人抗凝血溶解于100uL水中，4℃保存。实验时每25uLPCR体系加入1uLDNA。标记PCR50μlPCR扩增体系，掺入部分cy5 dCTP替换掉部分dC，从而使PCR产物标记上cy5。PCR扩增条件是94℃30s、55℃30s、72℃30s，30个循环。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色检测。PCR产物经无水乙醇沉淀法沉淀，10μl MilliQ过滤水溶解。
2、DNA芯片的设计和制备
(1)探针设计和制备
寡核甘酸探针：根据NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)提供的关于3，6，7，10，11，12号外显子区域进行设计。探针合成时在核心碱基5’端进行特殊修饰，即连接18个T碱基的氨基连接臂，即5’-NH2-(T)18-核心碱基。合成后用反向柱纯化，紫外定量。
oligochip制备：寡核苦酸探针以3xSSC点样液溶解到浓度为40umol/L，用基因芯片点样仪将寡核苷酸探针点到经醛基化处理的载玻片上，每个探针重复点样3次，点样方式见图1，以验证检测结果的可重复性。
(2)寡核甘酸基因芯片前处理
制备好的基因芯片在小于30％的相对湿度(25℃左右)干燥12小时。于0.1％SDS浸洗2次，接着以蒸馏水清洗2次，浸入蒸馏水中摇晃2min，空气凉干。将玻片置入沸水中，3min，变性DNA，然后置入冰冷乙醇中，30s，以固定变性DNA。
用NaBH4溶液(100ml含20％乙醇的PBS溶液中加入1.36NaBH4)作用10min，封闭玻片表面的醛基。晾干后用于预杂交和杂交。
(3)预杂交、杂交和杂交后处理
然后取出5-10ml的PCR标记产物浓缩后加10ml预杂交液稀释即配成杂交液，与基因芯片杂交。预杂交和杂交时，按2ml/cm2将预杂交液或杂交液转移到盖玻片上，利用盖玻片与玻片之间的毛细现象将溶液均匀平铺在玻片上，将玻片置于加有适当水分的杂交盒中。杂交温度为37℃，杂交时间为1-3h。芯片杂交完成后用洗液A(1x55C，0.2％SDS)：洗液B(0.2xSSC)和洗液C(0.1x5SC)各清洗5min，空气凉干后即可扫描。
(4)扫描和结果判定
扫描仪为Axon公司的GenePix4100A。荧光索Cy3、Cy5的激发波长为530nm，检测波长为585nm，650nm。扫描分辨率为10pm：设定激光强度及PMT为80％。扫描1-2次。将芯片扫描结果与DNA序列进行比较判断芯片检测。
下面对本发明的苯丙酮尿症诊断的DNA芯片的使用进行进一步的详细说明：
利用本发明的芯片检测R413P突变的苯丙酮酸尿症患者。按以上方法进行检测。用共聚焦荧光显微镜或荧光扫描仪检测DNA芯片杂交信号。结果如图2、3，4。
综上所述，本发明的DNA芯片应用于检测苯丙酮尿症相关基因突变。与已有的苯丙酮尿症诊断芯片相比，具有以下特点：
1、现有的苯丙酮尿症芯片中，一般仅包含一个正常和突变位点，而本发明的每类探针设计中包括所有四种可能存在的位点，尽可能地检测人群中发生的突变。
2、每个探针的长度也有所不同，现有的已申请专利的苯丙酮尿症芯片为所有的探针都是15个碱基，而本发明针对每个探针的情况设计了长度不等的探针，有效控制了检测条件的一致性和平行性。
3、探针的结构进行了优化，每个探针上连接了6～30个T碱基的氨基连接臂，可以有效连接和固定在载玻片上。
4、在样本的检测方面，由于有效的标记方法，可以清晰分辨纯合子以及杂合子的存在。
本发明能够同时检测多个苯丙酮尿症位点的突变，当然，随着新的位点的设计和验证工作的不断进行，可以把检测新的苯丙酮尿症位点的探针加到该芯片上。

Claims (4)

1、一种苯丙酮尿症诊断的DNA芯片，其特征在于在载体的表面预定区域排列和固定有检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的特异DNA探针，形成小密度的DNA探针阵列，所说的探针的核心碱基为：
R111X      野生型  CTTATCTCGTGAAAGCT
           突变型  CTTATCTCTTGAAAGCT
           突变型  CTTATCTCCTGAAAGCT
           突变型  CTTATCTCATGAAAGCT
Y204C      野生型  TGTACTCATAGCAAGCA
           突变型  TGTACTCAAAGCAAGCA
           突变型  TGTACTCAGAGCAAGCA
           突变型  TGTACTCACAGCAAGCA
R243Q      野生型  CACAGGTCGGAGGCG
           突变型  CACAGGTGGGAGGCG
           突变型  CACAGGTAGGAGGCG
           突变型  CACAGGTTGGAGGCG
W326X      野生型  CAGATTTACTGGTTTACTGTG
           突变型  CAGATTTACTTGTTTACTGTG
           突变型  CAGATTTACTAGTTTACTGTG
           突变型  CAGATTTACTCGTTTACTGTG
Y356X      野生型  GCCTACAGTACTGCTTATCA
           突变型  GCCTACAGTAATGCTTATCA
           突变型  GCCTACAGTAGTGCTTATCA
           突变型  GCCTACAGTATTGCTTATCA
R413P      野生型  GTCGTAGCGAACTGA
           突变型  GTCGTAGAGAACTGA
           突变型  GTCGTAGGGAACTGA
           突变型  GTCGTAGTGAACTGA
2、根据权利要求1所述的苯丙酮尿症诊断的DNA芯片，其特征在于所述的载体是载玻片、硅片、膜、高分子材料中的一种。
3、根据权利要求1所述的苯丙酮尿症诊断的DNA芯片，其特征在于为了有效地将探针连接和固定在载体上，在所述探针核心碱基的5’端连接了6～30个T碱基的氨基连接臂。
4、根据权利要求3所述的苯丙酮尿症诊断的DNA芯片，其特征在于所述T碱基的氨基连接臂为18个。
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