CN102608329A - 用于苯丙酮尿症产前诊断的母体羊水苯丙氨酸检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种氨基酸代谢紊乱疾病诊断技术，具体说是一种用于苯丙酮尿症产前诊断的母体羊水苯丙氨酸检测方法。首先将采集的母体羊水超声处理、离心处理、过滤，取过滤后的上清液作为待检样品，采用内标法测定待检羊水滤液中苯丙氨酸的含量。通过对母体羊水中苯丙氨酸的含量分析，可以提示母体中胎儿是否为PKU患儿。减少该病的发生、彻底解除该病的危害、提高人口素质。

Description

用于苯丙酮尿症产前诊断的母体羊水苯丙氨酸检测方法

技术领域

本发明涉及一种氨基酸代谢紊乱疾病诊断技术，具体说是一种用于苯丙酮尿症产前诊断的母体羊水苯丙氨酸检测方法。

背景技术

苯丙酮尿症（PKU）是严重威胁人类健康的一种常染色体隐性遗传性苯丙氨酸代谢异常病，是苯丙氨酸先天性代谢异常所致。临床主要表现为智能低下，惊厥发作和色素减少。由于该病一旦形成，便难以治愈，终生不能正常饮食，甚至死亡，因此世界各国对PKU诊治研究非常重视。中国专利申请00819857公开了一种“用于先天性代谢异常的检测方法和检测设备”，通过对新生儿血液中苯丙氨酸的检测诊断是否患有苯丙酮尿症。但是，这种检测诊断方法无法对胎儿进行诊断，也就无法避免先天患有氨基酸代谢紊乱疾病胎儿的出生。因此探索PKU产前诊断方法，减少该病的发生，减少病人数量，彻底解除该病的危害，对提高人口素质具有重要临床价值和社会意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于苯丙酮尿症产前诊断的母体羊水苯丙氨酸检测方法，在胎儿出生前即可诊断是否患有苯丙酮尿症，减少该病的发生、彻底解除该病的危害、提高人口素质。

为达到上述目的，本发明采用如下的技术方案：

A）采集胚胎成熟后的母体羊水，将母体羊水冷冻到4℃—5℃时将其放入超声清洗器中超声处理5—10分钟；

B）保持温度为4℃—5℃，将上述超声处理后的母体羊水放入低温高速离心机，低温高速离心机转速20000—21000转/分钟，离心15分钟；取离心处理后的母体羊水上清液，以0.22μm滤膜过滤；取过滤后的液体，得到待检羊水滤液；

C）采用内标法测定待检羊水滤液中苯丙氨酸的含量。

在步骤A），采集胚胎成熟后的母体羊水之后，将其冷冻在-80℃—-100℃环境下，超声处理前解冻到4℃—5℃。

在步骤C），首先将苯丙氨酸标准品配制成浓度为250μg/ml的苯丙氨酸溶液，取内标D₈标记苯丙氨酸配制成浓度为20μg/ml的内标D₈标记苯丙氨酸溶液，将上述苯丙氨酸溶液和内标D₈标记苯丙氨酸溶液混合配制成多种不同浓度的标准浓度溶液，将待检羊水滤液与等体积的内标D₈标记苯丙氨酸溶液混合得到待检样品，将待检样品和多种不同浓度的标准浓度溶液编号放入检测仪器测定待检样品中苯丙氨酸的含量。

上述技术方案，通过对母体羊水中苯丙氨酸的含量分析，可以提示母体中胎儿是否为PKU患儿。减少该病的发生、彻底解除该病的危害、提高人口素质。

具体实施方式

本发明所述用于苯丙酮尿症产前诊断的母体羊水苯丙氨酸检测方法，包括如下步骤：

A）采集胚胎成熟后的母体羊水，将其冷冻在-80℃—-100℃环境下保存，超声处理前解冻到4℃—5℃，将其放入超声清洗器中超声处理5—10分钟；

B）保持温度为4℃—5℃，将上述超声处理后的母体羊水放入低温高速离心机，低温高速离心机转速20000—21000转/分钟，离心处理15分钟；取离心处理后的母体羊水上清液，以0.22μm滤膜过滤；取过滤后的液体，得到待检羊水滤液；

C）采用内标法测定待检羊水滤液中苯丙氨酸的含量。首先将苯丙氨酸标准品配制成浓度为250μg/ml的苯丙氨酸溶液，取内标D₈标记苯丙氨酸配制成浓度为20μg/ml的内标D₈标记苯丙氨酸溶液，将上述苯丙氨酸溶液和内标D₈标记苯丙氨酸溶液混合配制成多种不同浓度的标准浓度溶液，将待检羊水滤液与等体积的内标D₈标记苯丙氨酸溶液混合得到待检样品，将待检样品和多种不同浓度的标准浓度溶液编号放入检测仪器测定待检样品中苯丙氨酸的含量。

具体检测的实施方式可以有多种，下面简单举例说明。

实施例1：

仪器与材料

仪器设备：串联四级杆液质联用（LC-MS/MS），低温冰箱（-80℃），超声破碎机，高速冷冻离心机（2,5000转/分钟），微量移液器。

仪器工作条件

色谱条件：串联四级杆液质联用（LC-MS/MS）6410B（美国安捷伦），色谱条件：高效液相色谱HP1260（美国安捷伦），快速分析色谱柱：ZORBAX SB-C₁₈（50mm*2.1mm I,d,1.8μm）;流动相A：水（含0.1%甲酸）85%，B：乙腈15%；流速：0.2ml/min，柱温箱温度37℃。

质谱条件：离子源：ESI，正离子模式；检测方法：MRM；气体流速：6L/min;气体温度：300℃；Fragmentor :135;Skimmer:15;CE:10V。定量分析离子对苯丙氨酸（m/z 166-120）,标记苯丙氨酸（m/z 174-128）。

试剂材料：纯水，甲酸（色谱纯），乙腈（色谱纯），苯丙氨酸标准品，同位素标记的D₈-苯丙氨酸，0.22μm滤膜过滤。

检验步骤：

A）按照“中华人民共和国母婴保健法”规定的有关条例采集母体羊水，采集到的母体羊水储存在—80℃ 低温冰箱保存。实验前将样品在4℃恒温箱内解冻，然后在超声清洗器中超声处理5分钟。选用孕周在20周以上、30周以内的胚胎成熟后的母体羊水，其主要成分为胎儿的尿液、胃肠道、脐带、胎盘表面等等，在检测前选用超声破碎羊水中的部分组织和表皮细胞，以便获得最佳测定效果。

B）取超声处理后的母体羊水1ml，保持温度4℃，采用低温高速离心机21000转/分离心15分钟，取离心处理后的母体羊水上清液500μl，以0.22μm滤膜过滤，取过滤后的液体，得到待检羊水滤液。

C）采用内标法测定，内标为D₈标记苯丙氨酸。取2.5mg苯丙氨酸标准品，溶于10ml浓度为1%的甲酸水溶液，得到浓度为250μg/ml的苯丙氨酸溶液；取内标D₈标记苯丙氨酸2.0mg,溶于100ml浓度为1%的甲酸水溶液，制成浓度为20μg/ml的内标D₈标记苯丙氨酸溶液。

分别取上述苯丙氨酸溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.0ml，放入5ml容量瓶中，用上述内标D₈标记苯丙氨酸溶液定容到5ml，震荡混匀，制成五个标准浓度溶液，分别为5 μg/ml、10 μg/ml 、20 μg/ml 、40 μg/ml 、50 μg/ml。

取待检羊水滤液100μl加入等体积的内标D₈标记苯丙氨酸溶液，旋窝震荡混匀，得到待检样品。

将五个标准浓度溶液与待检样品编号，放入仪器配套的样品杯中，由仪器自动进样器进样，进样量为5μl。按上述所设仪器条件测定，每个样品测定时间为2分钟。

仪器所测数据由仪器所带分析软件Masshunter Quantitaive Analysis处理，以样品的吸收峰面积积分方式计算，再由标准浓度曲线比对得出样品中苯丙氨酸浓度。

取不同母体羊水样品3份，连续测定10次，其重现性（相对偏差RSD）为3.7%,2.9%,4.2%;回收率分别为：98.4%±2.6，97.2%±3.4，99.1%±2.1。表明本方法结果可靠。

通过对母体羊水中苯丙氨酸的含量分析，可以提示母体中胎儿是否为PKU患儿。当母体羊水中苯丙氨酸含量超过13.5μg/ml时，可以提示母体中的胎儿有可能为苯丙酮尿症患儿。

实施例2:

仪器材料与工作条件同实施例1。

检验步骤：

A）按照“中华人民共和国母婴保健法”规定的有关条例采集母体羊水，采集到的母体羊水储存在—100℃ 低温冰箱保存。实验前将样品在5℃恒温箱内解冻，或者直接将采集到的母体羊水冷冻到5℃，然后在超声清洗器中超声处理10分钟。

B）取超声处理后的母体羊水1ml，保持温度5℃，采用低温高速离心机20000转/分离心15分钟，取离心处理后的母体羊水上清液500μl，以0.22μm滤膜过滤，取过滤后的液体，得到待检羊水滤液。

C）采用内标法测定待检羊水滤液中苯丙氨酸的含量的步骤同实施例1。

上述母体羊水的保存、超声处理和离心处理的工作条件可以再上述设定的范围内自由选择。其实施例不再一一叙述。

Claims (3)

1.用于苯丙酮尿症产前诊断的母体羊水苯丙氨酸检测方法，其特征在于包括如下步骤：

A）采集胚胎成熟后的母体羊水，将母体羊水冷冻到4℃—5℃时将其放入超声清洗器中超声处理5—10分钟；

B）保持温度为4℃—5℃，将上述超声处理后的母体羊水放入低温高速离心机，低温高速离心机转速20000—21000转/分钟，离心15分钟；取离心处理后的母体羊水上清液，以0.22μm滤膜过滤；取过滤后的液体，得到待检羊水滤液；

C）采用内标法测定待检羊水滤液中苯丙氨酸的含量。

2.根据权利要求1所述的用于苯丙酮尿症产前诊断的母体羊水苯丙氨酸检测方法，其特征在于：

在步骤A），采集胚胎成熟后的母体羊水之后，将其冷冻在-80℃—-100℃环境下，超声处理前解冻到4℃—5℃。

3.根据权利要求1所述的用于苯丙酮尿症产前诊断的母体羊水苯丙氨酸检测方法，其特征在于：

在步骤C），首先将苯丙氨酸标准品配制成浓度为250μg/ml的苯丙氨酸溶液，取内标D₈标记苯丙氨酸配制成浓度为20μg/ml的内标D₈标记苯丙氨酸溶液，将上述苯丙氨酸溶液和内标D₈标记苯丙氨酸溶液混合配制成多种不同浓度的标准浓度溶液，将待检羊水滤液与等体积的内标D₈标记苯丙氨酸溶液混合得到待检样品，将待检样品和多种不同浓度的标准浓度溶液编号放入检测仪器测定待检样品中苯丙氨酸的含量。