CN101887060A - 一种利用荧光显色定量检测新生儿血中苯丙氨酸浓度的试剂盒 - Google Patents
一种利用荧光显色定量检测新生儿血中苯丙氨酸浓度的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明名称:苯丙氨酸定量检测试剂盒(荧光法)本发明所属技术领域:生物、医药和医疗器械。本发明的目的:1、新生儿苯丙酮尿症筛查的荧光法定量检测试剂盒,克服细菌抑制法半定量、不易自动化和易受抗生素干扰的缺点;2、替换了:a、采用0.22um规格微孔滤膜进行无菌过滤,避免了对使用者人体和环境的危害且避免试剂在运输过程中的危险隐患;b、原有国外试剂中使用高浓度乙醇进行萃取实验,高浓度乙醇挥发性大,实验结果误差较大。通过我们使用三氯乙酸和双蒸水的结合替代了高浓度乙醇萃取方式,从而避免了由于试剂本身原因造成实验结果误差偏大,降低使用风险。
Description
技术领域
本发明涉及临床化学诊断试剂应用设备技术领域,属于一种利用荧光显色定量专门检测新生儿血中苯丙氨酸浓度的试剂盒
背景技术
目前,公知的现在国内用于检测新生儿血中苯丙氨酸浓度最广泛的实验方法是细菌抑制法和荧光法。
细菌抑制法存在的不足,该方法是一种办定量方法,主观性强,灵敏度低,实验时间较长等,另外,人工处理检验数据,手工登记检验记录,不利于数据的存储和备查,给新生儿疾病中心规范化管理带来潜在风险。
目前国内所采用荧光显色检测新生儿检测试剂盒全部靠国外进口产品,往往与特定检测仪器配套使用,而不能用于其它检测仪器,而且该试剂盒和所配套仪器设备价格昂贵,不利于新生儿筛查的普及,非一般的新生儿疾病筛查中心所能承担。另外,进口试剂盒所需的萃取液为高浓度的酒精挥发很强,实验结果误差很大,而且进口试剂盒在液体配制中加有国内禁控产品叠氮钠作为防腐剂。在实际操作中对人具有一定危险。
发明内容
本发明的目的是提供一种结果准确可靠、无创伤性、安全、灵敏度高、使用成本低的新生儿筛查试剂盒。该试剂盒是一种基于96孔微量反应板的荧光定量法,可以在任何荧光检测仪器上使用,而且改进了萃取液的浓度,使实验结果更加准确,另外该试剂盒的成本只是进口试剂盒的四分之一。能够促进新生儿苯丙酮尿症的大规模筛查。让每个新生儿都能接受检查。减少国家和社会的压力,为提高全民人口素质做出我们的贡献。
为实现上述目的,本发明技术方案为:一种利用荧光显色定量检测新生儿血中苯丙氨酸浓度的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒由琥珀酸缓冲液、二肽溶液、茚三酮溶液、铜溶液、萃取液、标准血片、质控血片、96孔微孔板、盖膜组成。
上述琥珀酸缓冲液的配制方法为:
用分析天平准确称取琥珀酸所需量,加入容量瓶,加入双蒸水80%的量进行溶解,调PH值至5.8±0.01,用双蒸水进行定容,再用0.22um规格微孔滤膜对琥珀酸缓冲液进行过滤,按照规定量分装到试剂瓶内,拧紧瓶盖放入2~8℃冰箱保存备用。
该试剂与国外试剂盒不同点在于,我们研制人员在保持该缓冲液无菌这个环节采用0.22um规格微孔滤膜在十万级操作间内对琥珀酸缓冲液进行无菌过滤,替代了以往使用叠氮钠防腐剂的方法。目的在于:1)对该试剂较长时间的保存;2)避免由于使用叠氮钠防腐剂造成人体、环境的危害;3)避免了试剂在运输过程危险隐患。
上述二肽溶液包括L-亮氨酸、L-丙氨酸,其配制方法为:
(1)用分析天平准确称取L-亮氨酸、L-丙氨酸所需量,加入容量瓶;
(2)加入双蒸水80%的量进行溶解。待完全溶解后,最后用双蒸水进行定容,获得二肽溶液。将配制好的二肽溶液按照规定量分装到试剂瓶内,拧紧瓶盖放入2~8℃冰箱保存备用。
所述的茚三酮溶液制备方法:
用分析天平称量茚三酮,用双蒸水溶解,完全溶解后,即可。
所述的铜溶液配制方法:
用分析天平准确称取碳酸钠,溶于蒸馏水(80%量),拧紧瓶盖放入2~8℃冰箱保存备用
用分析天平准确称取酒石酸加纳溶于蒸馏水(80%量),拧紧瓶盖放入2~8℃冰箱保存备用。
用分析天平准确称取硫酸铜溶于蒸馏水(80%量),拧紧瓶盖放入2~8℃冰箱保存备用。
分别配好的三个溶液后,按循序即硫酸铜倒入无水碳酸钠,酒石
酸钾钠两种混合液中,磁力搅拌器不停搅拌,避免产生沉淀,混合后双蒸水定容即可,按照规定量分装到试剂瓶内,拧紧瓶盖放入2~8℃冰箱保存备用。
所述萃取液配制方法:
用分析天平准确称取所需配制总量的30%的三氯乙酸固体,放入适量烧杯中,加入双蒸水70%的量进行充分溶解。进行定容,将配制好的三氯乙酸溶液按照规定量分装到试剂瓶内,拧紧瓶盖放入2~8℃冰箱保存备用。
该试剂配制时与国外试剂盒不同点在于,进口试剂盒所需的萃取液为高浓度的酒精,挥发很强,实验结果误差很大,给使用者造成一定风险。而我们演职人员使用是三氯乙酸和双蒸水结合配制出萃取液。目的在于:1)避免了由于试剂本身技术原因造成的结果误差偏大。降低使用者风险。2)该试剂可以和其它配套试剂同样条件下保存,降低生产成本。
所述的标准、质控血片制备方法:
将全血用4-8层纱布过滤,然后离心3000转20分钟,弃取血浆,再用生理盐水洗3次,3000转离心20分钟,弃取上清,最后一次离心4000转30分钟,用60g/L牛血清白蛋白调好比例,混匀
测血球压积为55-65%为宜
将血球按A-F标准和质控C1-C2用配制好的标准、质控品,按所需量加到血球中,混匀即可滴定标准质控血片。
所述使用方法包括以下步骤:
苯丙氨酸测定:
1.实验前将试剂盒先放在室温(18~25℃)平衡,铜溶液仍放在2~8℃冰箱内,即取即用。、
2.反应混合液:琥珀酸缓冲液、二肽溶液和茚三铜溶液按5∶1∶2比例混合,避光保存,4小时内用完。
3.用专用打孔器打下直径3mm标准品、质控品、样本的滤纸血斑,放入透明微孔板相应的孔中;
4.每孔加入80ul萃取液,盖膜,室温振荡30分钟(振荡时避免血片上下跳动,以免萃取不完全);
5.每孔取出萃取液50ul转移到白色微孔板的相对应孔中;
6.每孔加入反应混合液50ul,盖膜,振荡15秒,60℃温育1小时或37℃温育2小时;
7.从温育箱中取出微孔板,放入冰箱(-18~-20℃)冷冻3~5分钟;
8.每孔加冷的铜溶液200ul(2~8℃冰箱内取出),避光在室温温育15~30分钟;
9.上机测定,荧光仪使用的激发波长390nm,发射波长486nm。
苯丙氨酸测定结果的解释
在含有琥珀酸缓冲液、二肽溶液和茚三酮溶液的混合液中,茚三酮可以和苯丙氨酸反应,产生一种荧光物质,其中二肽可提高此荧光反应,琥珀酸缓冲液控制PH 5.8±0.1,可保证理想的荧光值和最大的特异性,加入铜溶液后可以使荧光化合物更加稳定并终止反应。使用荧光读数仪(激发光390nm,发射光486nm)测定荧光物质的强弱,即可反映苯丙氨酸的浓度。在含有琥珀酸缓冲液、二肽溶液和茚三酮溶液的混合液中,茚三酮可以和苯丙氨酸反应,产生一种荧光物质,其中二肽可提高此荧光反应,琥珀酸缓冲液控制PH 5.8±0.1,可保证理想的荧光值和最大的特异性,加入铜溶液后可以使荧光化合物更加稳定并终止反应。加入用三氯乙酸配制出的萃取液可以降低实验误差,使用荧光读数仪(激发光390nm,发射光486nm)测定荧光物质的强弱,检测苯丙氨酸的浓度,然后采用数据分析处理软件对数据进行处理。实现新生儿在72小时内筛查的目的,由于应用了化学发光的定量检测技术,结果准确可靠,实现了无创伤性、安全、灵敏度高的新生儿筛查,本发明具有较高的市场推广价值。
注意事项:
1、不同批号的试剂不能混用;
2、本产品为一次性使用产品;
3、超出有效期的试剂不可再用;
4、所有的试剂和样本在使用前要达到室温(18~26℃);
5、铜溶液除外(从2~8℃冰箱中即取即用);
6、当从标准品、质控品上打孔时,注意从低浓度到高浓度。
7、实验结束所有物品,采用高温、过氧乙酸或84液等浸泡处理(生物制品应视为有潜在危害性)。
8、试剂盒中标准、质控品的浓度如有改变,将随试剂盒送通知单同时电话告知。
说明书附图说明:
1、图1:整体试剂盒外观图;
2、图2:试剂盒俯视图;
3、图3-图7:试剂溶液承载瓶;
4、图8-图9:检测用微孔板;
5、图10:标准血片。
Claims (7)
1.一种定量检测滤纸干血片中新生儿苯丙氨酸浓度的体外诊断试剂盒,其特征在于:所述试剂由琥珀酸缓冲液、二肽溶液、茚三酮溶液、铜溶液、萃取液、96孔微孔板(透明)、标准血片组成。
2.如权利要求1所述的苯丙氨酸定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于:所述琥珀酸缓冲液配制方法:
(1)用分析天平准确称取琥珀酸所需量,放入适量的烧杯中;
(2)加入配制总量的80%的双蒸水进行溶解;
(3)调PH值至5.8±0.01,用双蒸水进行定容;
(4)再用0.22um规格微孔滤膜对琥珀酸缓冲液进行过滤,将过滤好的琥珀酸缓冲液按照规定量分装到试剂瓶内,拧紧瓶盖放入2~8℃冰箱保存备用。
该权利中所述琥珀酸缓冲液配制时与国外试剂盒不同点在于,我们研制人员在保持该缓冲液无菌这个环节采用0.22um规格微孔滤膜在十万级操作间内对琥珀酸缓冲液进行过滤,代替了以往使用的叠氮钠防腐的方法。目的在于:1)对该试剂较长时间的保存。2)避免造成人体、环境的危害。3)避免了试剂在运输过程危险隐患。
3.如权利要求2所述苯丙氨酸定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于:所述二肽溶液包括L-亮氨酸、L-丙氨酸,其配制方法:
(1)用分析天平准确称取L-亮氨酸、L-丙氨酸所需量,加入容量瓶;
(2)加入配制总量的双蒸水80%的量进行溶解。待完全溶解后,最后用双蒸水进行定容,获得二肽溶液。将配制好的二肽溶液按照规定量分装到试剂瓶内,拧紧瓶盖放入2~8℃冰箱保存备用。
4.如权利要求3所述苯丙氨酸定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于:所述茚三酮溶液,其配制方法为:
(1)用分析天平准确称量茚三酮所需量;
(2)加入配制总量的双蒸水80%的量进行溶解,待完全溶解后,最后用双蒸水进行定容,获得茚三酮溶液。将配制好的茚三溶液按照规定量分装到试剂瓶内拧紧瓶盖放入2~8℃冰箱保存备用。
5.如权利要求4所述苯丙氨酸定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于:所述铜溶液包括碳酸钠溶液、酒石酸加纳溶液和硫酸铜溶液,其配制方法为:
(1)碳酸钠溶液的配制:
用分析天平准确称取碳酸钠所需量,加入容量瓶,加80%量蒸馏水,完全溶解后,将配制好的溶液封装好放入2~8℃冰箱保存备用。
(2)酒石酸加纳溶液的配制:
用分析天平准确称取酒石酸加纳所需量,加入容量瓶,加80%量蒸馏水,完全溶解后,将配制好的溶液封装好放入2~8℃冰箱保存备用;
(3)硫酸铜溶液的配制:
用分析天平准确称取硫酸铜所需量,加入80%量蒸馏水,完全溶解后,将配制好的溶液封装好放入2~8℃冰箱保存备用备用;
(4)铜溶液的配制:
将配好的三个备用溶液按顺循序即硫酸铜倒入无水碳酸钠,酒石酸钾钠两种混合液中,磁力搅拌器不停搅拌,完全溶解后,用双蒸水定容,将配制好的溶液按照规定量分装到试剂瓶内,拧紧瓶盖放在2~8℃冰箱保存备用。
6.如权利要求5所述苯丙氨酸定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于:所述萃取液配制方法为:
1)用分析天平准确称量配制总量的30%的三氯乙酸固体,放入适量烧杯内;
2)加入适量双蒸水溶解后,进行定容;
3)将配制好的萃取液按照规定量分装到试剂瓶内,拧死瓶盖放在2~8℃冰箱保存备用。
该权利中所述萃取液配制时与国外试剂盒不同点在于,进口试剂盒所需的萃取液为高浓度的酒精挥发很强,实验结果误差很大。而我们研制人员使用的是三氯乙酸和双蒸水结合配制出萃取液。目的在于:1)避免了由于试剂本身原因造成的结果误差偏大。2)可以和其它配套试剂同样保存,降低生产成本。
7.如权利要求6所述苯丙氨酸定量检测试剂盒的制备方法,其特征在于:所述标准血片、质控血片的的制备方法为:
(1)将全血用4-8层纱布过滤;
(2)然后离心3000转20分钟,弃取血浆;
(3)再用生理盐水洗3次,3000转离心20分钟,弃取上清;
(4)最后一次离心4000转30分钟,用60g/L牛血清白蛋白调好比例,混匀测血球压积为55-65%;
(5)将血球分成8份加入不同浓度的苯丙氨酸(A-F)标准和质控(C1-C2)用配制好的标准按照不同的浓度滴到903#滤纸上,自然阴干(2-4个小时),放入装有干燥剂的塑料袋里2-8度贮存备用。
苯丙氨酸测定:
1.实验前将试剂盒先放在室温(18℃~25℃)平衡,铜溶液仍放在2~8℃冰箱内,即取即用。
2.反应混合液:琥珀酸缓冲液、二肽溶液和茚三铜溶液按5∶1∶2比例混合,避光保存,4小时内用完;
3.用专用打孔器打下直径3mm标准品、质控品、样本的滤纸血斑,放入透明微孔板相应的孔中;
4.每孔加入80ul萃取液,盖膜,室温振荡30分钟(振荡时避免血片上下跳动,以免萃取不完全);
5.每孔取出萃取液50ul转移到白色微孔板的相对应孔中;
6.每孔加入反应混合液50ul,盖膜,振荡15秒,60℃温育1小时或37℃温育2小时;
7.从温育箱中取出微孔板,放入冰箱(-18~-20℃)冷冻3~5分钟;
8.每孔加冷的铜溶液200ul(2~8℃冰箱内取出),避光在室温温育15~30分钟;
9.上机测定,荧光仪使用的激发波长390nm,发射波长486nm。
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Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102323259A (zh) * | 2011-06-19 | 2012-01-18 | 浙江大学 | 将烟囱顶96孔pcr板用于批量测定氨基酸含量的方法 |
CN102608329A (zh) * | 2012-03-08 | 2012-07-25 | 郭健 | 用于苯丙酮尿症产前诊断的母体羊水苯丙氨酸检测方法 |
CN102798691A (zh) * | 2011-05-21 | 2012-11-28 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种检测血中苯丙氨酸二肽的新方法 |
CN103196897A (zh) * | 2013-02-22 | 2013-07-10 | 北京源德生物医学工程有限公司 | 一种苯丙氨酸定量检测试剂盒及其检测方法 |
WO2014110887A1 (zh) * | 2013-01-21 | 2014-07-24 | 广州市丰华生物工程有限公司 | 一种血片支架、血片支架组件、滤纸干血片打孔机及血片支架在体外诊断试剂中的应用 |
CN105445468A (zh) * | 2014-08-19 | 2016-03-30 | 苏州新波生物技术有限公司 | 苯丙氨酸检测试剂盒 |
CN110441524A (zh) * | 2019-07-22 | 2019-11-12 | 浙江大学 | 检测苯丙酮尿症标记物的抗体在制备诊断试纸中的应用 |
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Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102798691A (zh) * | 2011-05-21 | 2012-11-28 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种检测血中苯丙氨酸二肽的新方法 |
CN102323259A (zh) * | 2011-06-19 | 2012-01-18 | 浙江大学 | 将烟囱顶96孔pcr板用于批量测定氨基酸含量的方法 |
CN102608329A (zh) * | 2012-03-08 | 2012-07-25 | 郭健 | 用于苯丙酮尿症产前诊断的母体羊水苯丙氨酸检测方法 |
WO2014110887A1 (zh) * | 2013-01-21 | 2014-07-24 | 广州市丰华生物工程有限公司 | 一种血片支架、血片支架组件、滤纸干血片打孔机及血片支架在体外诊断试剂中的应用 |
CN103196897A (zh) * | 2013-02-22 | 2013-07-10 | 北京源德生物医学工程有限公司 | 一种苯丙氨酸定量检测试剂盒及其检测方法 |
CN105445468A (zh) * | 2014-08-19 | 2016-03-30 | 苏州新波生物技术有限公司 | 苯丙氨酸检测试剂盒 |
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