CN101013137A - 一类检测缺血性修饰白蛋白的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

一类检测缺血性修饰白蛋白(IMA)的试剂盒及其检测方法，试剂盒中含有不同的分离去除背景干扰物质的装置，可以是离心超滤IMA检测试剂盒、免疫磁珠IMA检测试剂盒，免疫层析IMA检测试剂盒、免疫层析膜IMA测试板试剂盒或免疫渗滤膜IMA测试板试剂盒。分离去除背景干扰物质后，可提高检测IMA试剂盒及其检测方法的特异性，采用该试剂盒，利用医院中现有常用设备，在半小时左右就能测得IMA值来诊断心肌缺血症状。特别适合床边快速检测试剂盒的开发，使用方便，成本低，是一个很有开发前景的产品。

Description

一类检测缺血性修饰白蛋白的试剂盒及其检测方法
发明领域
本发明涉及一类检测缺血性修饰白蛋白的试剂盒及其检测方法。这类试剂盒是采用白蛋白钴结合试验并在去除白蛋白背景干扰后，检测未与人白蛋白结合的钴离子，所得数值大小可诊断病人是否有心肌缺血症状。
技术背景
急性冠状动脉综合症(Acute Coronary Syndrome，简称ACS)是由于急性心肌缺血导致胸部不适和其他症状的一大类病症，是临床上常见的心脏、血管急症，也是造成急性死亡的主要原因。ACS涵盖了一组连续进展的病症，包括不稳定性心绞痛(Unstable Angina，简称UA)、非ST段升高的心肌梗死(non-ST SegmentElevation Myocardial Infarction，简称NSTEMI)、  ST段升高的心肌梗死(简称STEMI)和心源性猝死。ACS的病理基础是冠状动脉内不稳定斑块形成血栓，临床上很多患者会发展到心肌梗死(Myocardial Infarction，简称MI)，甚至心脏猝死，它是威胁人类生命的主要病症之一。心肌缺血是ACS最常见的发病原因，临床上往往有相当一部分症状隐匿的患者被漏诊而未入院治疗，这些漏诊患者实际上是心肌缺血患者，其死亡危险性比住院病人高一倍。心肌缺血的临床表现常常是模糊而又多样的，症状可能包括胸痛(绞痛)、上腹部和臂部不适、喘气、恶心和呕吐。然而，这些症状可能难以捉摸且不易识别。
缺血是一种由于代谢变化引起的部分身体缺氧，病因通常是血管狭窄或阻塞。最常见的两种缺血形式是心血管型和脑血管型。心血管型心肌缺血是身体给心脏的供氧能力下降，在中国是造成病死第二大最主要的原因，脑缺血是脑卒中的预兆，脑卒中在中国则是第三大死因。2005年中国心脑血管疾病造成2,600,000死亡，有超过30％人群有心血管疾病，急性冠心病发病率每十年增加50％。另外，多达三到四百万中国人将患所谓无临床表现的“无症状心肌缺血”病。
心电图(Electrocardiogram，简称ECG)对于急性心肌梗死(Acute MyocardialInfarction，简称AMI)和UA有较高的特异性。但灵敏度低于50％，ACS患者来急症室就诊时，大约一半ECG是正常的。心肌肌钙蛋白[心肌肌钙蛋白T(CardiacTroponin T，简称cTn T)和心肌肌钙蛋白I(Cardiac Troponin I，简称cTn I)]，肌酸激酶同工酶MB(Creatine Kinase isoenzyme，简称CK-MB)是特异的心肌标志物，但仅在不可逆的细胞损害以及细胞膜的完整性被破坏之后，在血中才会升高。短期和可逆的缺血发作，不会导致这些标志物血中水平升高，因此，传统的检查方法都不能作为诊断心肌缺血的“金标准”，临床工作者一直在致力于寻找一种灵敏的心肌缺血的理想生化标志物，能在ACS早期可逆阶段检出，从而有助于急性缺血患者的正确诊断和及时治疗。
当从急症患者的血清中寻找生化诊断标志物时，美国Bar-Or D等(US7,070,937，2006年，US6,492,179，2002年，US6,475,743，2002年，US6,461,875，2002年，US5,290,519，1994年，US5,227,307，1993年)发现来自几个ACS(UA或MI早期)患者血清中，其白蛋白结合外源性钴(Co2+)的能力降低，后来证实这种白蛋白与心肌缺血密切相关，这种因心肌缺血而改变的白蛋白，称之为缺血修饰白蛋白(Ischemia Modified Albumin，简称IMA)。白蛋白钴结合试验(AlbuminCobalt Binding test，简称ACB试验)主要用来测定IMA。IMA临床可用于心肌缺血的诊断，提高对ACS诊断的正确性及ACS危险性分级，以降低对非缺血病人的收治率和心血管高危个体的漏诊率，节省医疗资源。
美国Bar-Or D(以下简称Bar-Or D方法)等发明了IMA的快速检测方法和试剂盒。该发明的基本原理为：正常对照组的血清样品中白蛋白以活性形式存在，加入过度已知量的钴离子溶液后，钴离子即可与白蛋白结合，溶液中未结合钴离子浓度较低；而心肌缺血病人的血清样品中含有较多缺血性修饰白蛋白，加入同样浓度钴离子溶液后，由于IMA与钴离子结合的能力弱，溶液中存在较高浓度的未结合钴离子，未结合钴离子与显色剂发生颜色反应后，采用分光光度比色仪在450-500nm处检测样品吸光度，所得数据与一已知标准IMA曲线进行对照，即可得出IMA值，其测定值用每毫升单位(U/ml)表示。具体测试步骤如下：在被测血清中加入过度已知量的钴离子溶液形成混合液，摇匀在18-37℃温育至少4-5分钟，反应pH7-9较佳；将二硫苏糖醇(1，4-Dithiothreitol，简称DTT)显色剂与上述混合液摇匀反应，随后加入氯化钠溶液，采用全自动生化分析仪，在450-500nm处检测样品吸光度，所得OD值与一个已知标准的IMA动力学曲线进行对照，即可得到IMA值，其测定值用每毫升单位(U/ml)表示。
虽然IMA的检测在诊断心肌缺血方面具有明显的优势，但是目前上述已有技术的缺血性修饰白蛋白的检测方法明显存在下列的不足，严重影响了临床的进一步推广使用：
1.已有技术IMA试剂盒及检测方法不能在中小型生化分析仪或分光光度仪上使用
目前美国Invemess公司销售的IMA检测试剂盒只能在极少数几种日立和罗士型号的全自动生化仪上使用，而这几种型号的全自动生化仪在我国医院中没有。一般来说，只要有上机参数，生化试剂盒就应能在各个厂牌的全自动生化仪上使用，已有技术不能在一般生化仪上使用可能的原因是其IMA试剂盒检测的IMA阴阳性OD值没有很明显的差异，信号太弱需要特别放大。由于手工分光光度仪上或中小型生化分析仪不能将微小的光电信号差别进行成千上万倍的有效放大，不适合使用。而我国医院的急诊化验室一般不配备大型生化分析仪，但ACS都为急诊病人，这为IMA指标在临床快速诊断心肌缺血方面推广使用形成了障碍。
2.已有技术IMA动力学曲线OD值很小的变动就可使IMA值在很大的范围内变动
根据Bar-Or D方法IMA动力学曲线，横座标OD值从阴性低值到阳性高值只在小于0.3范围内变动，而纵座标IMA值在200左右单位的大范围内变动，就是说OD值轻微变动，会引起IMA值很大的变化，这样，IMA阴性高值样品很容易变成阳性，IMA阳性低值样品很可能被高估，这种变化可能是由系统误差引起的，并不一定是由样品本身内在差异所引起，从而会造成病人缺血性状况的高估或低估，会使临床判断造成错误。
3.已有技术试剂盒及检测方法特异性不高
已有技术试剂盒检测IMA的阳性预测值(Positive Predictive Value，简称PPV)较低，主要是IMA阴性样品OD值非特异性升高，当背景干扰足够大时就可使IMA阴性结果超过临界值变成IMA假阳性，使得IMA的阳性预测值较低，某种程度上降低了IMA在临床上的使用价值。
综上所述，急性冠状动脉综合症病情险恶，IMA是早期缺血的理想参考指标，但已有技术试剂盒及检测方法上的不足又限止了其进一步推广使用，因此迫切需要开发一种检测IMA的试剂盒并通过去除背景干扰，特别是能降低IMA阴性样品的OD值从而能提高IMA的特异性；需要一种不会由于OD值微小变化就使IMA值产生较大变化的动力学曲线；需要一种能满足普遍的中小型自动生化分析仪甚至一般分光光度仪手工检测IMA的试剂盒；一种床边快速试剂以满足临床ACS诊断急切、简便和正确的需要。
发明内容
本发明提供一类检测缺血性修饰白蛋白的试剂盒及其检测方法。试剂盒是由CoCl2·6H2O(10mg/100ml-500mg/100ml)的钴离子溶液、0.05M-0.20M，pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液、0.25-3.5mg/ml的DTT显色剂和分离去除背景干扰物质的装置或含有DTT显色剂的分离去除背景干扰物质的装置组成。分离去除背景干扰物质的装置可以基于物理或免疫手段。本发明采用物理性的离心超滤分离或免疫性的包括免疫层析膜分离、亲和层析柱分离、免疫渗滤膜分离或免疫磁珠分离。装置采用离心超滤管和配套离心管，是为离心超滤缺血性修饰白蛋白检测试剂盒；装置采用固定有抗白蛋白抗体的免疫层析膜IMA测试板，是为免疫层析膜缺血性修饰白蛋白测试板试剂盒；装置采用与抗白蛋白抗体偶联的亲和层析柱，是为亲和层析缺血性修饰白蛋白检测试剂盒；装置采用固定有抗白蛋白抗体的免疫渗滤膜IMA测试板，是为免疫渗滤膜缺血性修饰白蛋白测试板试剂盒；装置采用与抗白蛋白抗体偶联的免疫磁珠，是为免疫磁珠缺血性修饰白蛋白检测试剂盒。
本发明一类检测IMA试剂盒及其检测方法的原理基本上与已有技术Bar-Or D方法相同，为了克服已有技术的不足，对试剂盒构成和检测方法作了改进，主要是在显色反应前将混合液中的各种形式的白蛋白除去并与末结合的钴离子分离，然后检测分离相中未结合的钴离子，测得IMA值，以诊断病人是否有心肌缺血症状。
本发明使用检测缺血性修饰白蛋白的试剂盒，检测IMA方法的的步骤如下：(参见图1)：(1)过度已知量的钴离子溶液，磷酸盐缓冲液与病人生物样品如全血、血清、血浆、体液或组织液混合，在18-37℃孵育5分钟，成混合液pH7-9；(2)使用离心超滤分离或免疫手段分离从混合液中分离去除背景干扰物质；(3)将DTT显色剂与分离出的未结合钴离子进行显色反应；(4)采用分光光度比色或反射光分析测定有色化合物颜色的强度；(5)所得数据与标准曲线相对照，即可得到IMA值，以诊断病人是否有心肌缺血症状。
第1步所述混合液中包含结合的和未结合的钴离子，以及所有的自然形式出现的白蛋白，白蛋白-钴复合物和缺血性修饰白蛋白；混合液中加入磷酸盐缓冲液，为了是增强第3步分离出的未结合钴离子的显色效果。
在第2步中背景干扰是指DTT显色剂与混合液中的未结合的钴离子以外的其它物质也发生了显色反应，并在分光光度比色分析测定时也会产生一个光密度值并与未结合的钴离子产生的光密度值叠加，从而影响了IMA测定的特异性。
将一正常人血清样品作梯度稀释后，发现空白对照样品的分光光度比色测定OD值随梯度稀释而降低，而未作稀释原倍血清的OD值最高(见表1)。
表1 空白对照血清样品作梯度稀释后测定的OD值
No.1   No.2   No.3   No.4   No.5   No.6
  血清浓度 100％   80％   60％   40％   20％   10％
  空白对照样品OD值 0.183   0.169   0.158   0.157   0.153   0.104
血清中的主要成分为蛋白质，其中白蛋白最多，显示各种形式的白蛋白可能是空白对照产生OD值的主要原因。在检测病人样品中包括所有的自然形式出现的人白蛋白，白蛋白-钴复合物和缺血性修饰白蛋白，因此检测IMA方法中的背景干扰可能来自血清蛋白特别是各种形式的白蛋白。
检测IMA方法中去除背景干扰物质主要是将混合液中的各种形式的白蛋白与未结合的钴离子分离，为未结合的钴离子与DTT显色剂的颜色生成创造一个背景干扰较小的环境，目的是显示未结合钴离子与DTT显色剂生成一个真实的颜色强度，降低IMA阴性的OD值，提高IMA试剂盒及其检测方法的特异性。
本发明检测IMA方法推荐的分离手段可以是物理的或免疫的，物理的采用离心超滤分离；免疫手段就是利用抗原抗体反应的专一性，采用抗人白蛋白抗体捕获白蛋白，从而分离未结合的钴离子。免疫学去除背景干扰方法有特异性强，样品用量更少，成本更低，操作简便，更适合应用在床边和家庭个人使用的快速IMA试剂盒的开发。本发明检测IMA方法涉及的抗体所针对的白蛋白位点应不在自然形式出现的人白蛋白-N末端，而应能结合所有的人白蛋白，这包括所有的以自然形式出现的人白蛋白，白蛋白-钴复合物和缺血性修饰白蛋白，从而达到分离白蛋白的目的。免疫层析膜分离、亲和层析柱分离、免疫渗滤膜分离和免疫磁珠分离都是本发明推荐的手段。
将去除所有各种形式的白蛋白的干扰物质步骤放在混合液形成和显色反应两步骤之间进行，就是不让背景干扰物质，特别是各种形式的白蛋白参与与DTT显色剂的反应。
对同一IMA阴性或阳性样品进行白蛋白背景分离前后空白对照OD值比较，实验显示分离去除白蛋白背景以后的空白对照OD值低于未分离去除前的，证实经白蛋白分离去除后已排除背景干扰物质，从而使空白对照OD值降低，见表2。白蛋白背景分离后IMA阴性或阳性样品空白对照的OD值基本相同，表明样品显色反应后的测定值仅决定于未结合的钴离子，特异性提高。
表2 白蛋白背景分离前后同一IMA阴性或阳性空白对照样品测定的OD信比较
  IMA阴性样品   IMA阳性样品 均值
  样品1   样品2   样品3   样品1  样品2  样品3
白蛋白背景分离前   0.183   0.169   0.158   0.157  0.153  0.104 0.114
白蛋白背景分离后   0.058   0.069   0.062   0.058  0.057  0.067 0.062
将一正常人样品作梯度稀释后，进行白蛋白背景分离前后空白对照OD值比较，实验显示去除白蛋白背景以后，空白对照OD值趋于一致，并没有随梯度稀释而降低；而白蛋白背景分离前空白对照OD值会随着血清浓度的降低而降低，证实去除白蛋白背景后已排除背景干扰物质，可提高IMA试剂盒及其检测方法的特异性，见表3。
表3 白蛋白背景分离前后同一血清空白对照样品梯度稀释后OD值比较
血清浓度 100％   80％   60％   40％   20％   10％   均值
白蛋白背景分离前 0.183   0.169   0.158   0.157   0.153   0.104   0.114
白蛋白背景分离后 0.058   0.069   0.062   0.058   0.057   0.067   0.062
按照试剂盒中采用的分离去除背景干扰物质装置的不同，本发明提供如下5种检测缺血性修饰白蛋白的试剂盒：
1.离心超滤缺血性修饰白蛋白检测试剂盒
离心超滤IMA检测试剂盒由CoCl2·6H2O 50mg/100ml的钴离子溶液、0.1M，pH7.4的磷酸盐缓冲液、0.5mg/ml的DTT显色剂、离心超滤管和配套离心管组成。由过度已知量的钴离子溶液、磷酸盐缓冲液和病人生物样品一起形成的混合液通过离心超滤去除白蛋白背景干扰物质，主要是去除各种形式的白蛋白，这包括所有以自然形式出现的人白蛋白，白蛋白-钴复合物和缺血性修饰白蛋白。然后检测分离相中未结合的钴离子，所得IMA数值可作为临床医生判断病人是否有心肌缺血症状的依据。离心超滤管只按限定的蛋白质分子量大小物理性地分离混合物，但对未结合的钴离子是零截留，选用小于白蛋白分子量66KD的离心超滤管，由于白蛋白的分子量为66KD，这样离心超滤后能将绝大部分白蛋白截留，而分离相中的未结合的钴离子浓度与在混合相中的相等。使用离心超滤IMA检测试剂盒检测IMA的方法步骤参见实施例1。考虑到IMA检测试剂盒主要用于ACS患者的诊断，因此整个试验的时间要求最好不超过半小时，使用离心超滤技术去除白蛋白具有装置与操作简单，时间短，用血量少的优点。本发明离心超滤IMA检测试剂盒推荐使用Microcon(Millipore公司)微量离心超滤管；依据白蛋白分子量为66KD的情况，我们选用能物理性地将白蛋白分子与血清分离的MICROCON 30KD离心超滤管(依据一般超滤的经验，要将某分子分离干净，应选用比该分子小一倍的离心超滤管)。
2.免疫磁珠缺血性修饰白蛋白检测试剂盒
免疫磁珠IMA检测试剂盒由CoCl2·6H2O 100mg/100ml的钴离子溶液、0.1M，pH7.8的磷酸盐缓冲液、1.0mg/ml的DTT显色剂、与抗白蛋白抗体偶联的免疫磁珠组成。由过度已知量的钴离子溶液、磷酸盐缓冲液和病人生物样品一起形成的混合液，在显色反应前采用与抗白蛋白抗体偶联的免疫磁珠捕获白蛋白去除背景干扰物质，主要是去除各种形式的白蛋白，这包括所有以自然形式出现的人白蛋白，白蛋白-钴复合物和缺血性修饰白蛋白。然后检测分离相中未结合的钴离子，所得IMA数值可为临床医生诊断病人是否有心肌缺血症状的依据。免疫磁珠IMA检测试剂盒检测IMA的方法步骤参见实施例3。
3.亲和层析缺血性修饰白蛋白检测试剂盒
亲和层析IMA检测试剂盒由CoCl2·6H2O 300mg/100ml的钴离子溶液、0.2M，pH8.0的磷酸盐缓冲液、2.0mg/ml的DTT显色剂、与抗白蛋白抗体偶联的亲和层析柱组成。由过度已知量的钴离子溶液、磷酸盐缓冲液和病人生物样品一起形成的混合液，在显色反应前采用与抗白蛋白抗体偶联的亲和层柱去除背景干扰物质，主要是去除各种形式的白蛋白，这包括所有以自然形式出现的人白蛋白，白蛋白-钴复合物和缺血性修饰白蛋白。然后检测分离相中未结合的钴离子，所得IMA数值可作为临床医生判断病人是否有心肌缺血症状的依据。亲和层析IMA检测试剂盒检测IMA的方法步骤参见实施例5。
4.免疫层析膜缺血性修饰白蛋白测试板试剂盒
免疫层析膜IMA测试板试剂盒由CoCl2·6H2O 400mg/100ml的钴离子溶液、0.15M，pH7.0的磷酸盐缓冲液、免疫层析膜IMA测试板组成。免疫层析膜IMA测试板的立体分解结构示意图见图2，免疫层析膜IMA测试板有盖板和底座，盖板上有二个加样孔和二个观察窗，底座上有免疫层析膜IMA测试条和样品白蛋白含量测试条，它们的底部分别粘附于硬质塑料衬垫并固定在底座上，免疫层析膜IMA测试条上有与第一加样孔相对应的第一样品区、白蛋白捕获区、显色区和第一吸收垫；样品白蛋白含量测试条上有与第二加样孔相对应的第二样品区、金胶垫、测试区和第二吸收垫。
由过度已知量的钴离子溶液、磷酸盐缓冲液和病人生物样品一起形成的混合液通过第一加样孔滴在第一样品区上，混合液由第一样品区向前移动进入白蛋白捕获区，通过免疫层析膜上固定的抗体去除背景干扰物质白蛋白后，进入DTT(2.5mg/ml)显色区，根据颜色强度可反映出未结合钴离子的量，所得IMA数值可作为临床医生判断病人是否有心肌缺血症状的依据。另外将原倍样品滴在第二加样孔中，原倍样品由第二样品区向前移动，通过金胶垫与测试区的白蛋白抗体复合物结合，随后金胶垫中的金标抗白蛋白抗体向前移动与测试区的白蛋白抗体复合物结合产生紫红色，紫红色的深浅程度与样品中的白蛋白含量成正比，即可测得白蛋白含量，该数值可用来校准可能发生的因白蛋白含量过高或过低时引起的IMA判断的不正确性。免疫层析膜IMA测试板试剂盒检测IMA的方法步骤参见实施例4。
5.免疫渗滤膜缺血性修饰白蛋白测试板试剂盒
免疫渗滤膜缺血性修饰白蛋白测试板试剂盒是由CoCl2·6H2O 200mg/100ml的钴离子溶液、0.1M，pH7.6的磷酸盐缓冲液、免疫渗滤膜IMA测试板组成。免疫渗滤膜IMA测试板的立体分解结构示意图见图3，免疫渗滤膜IMA测试板有样品槽、槽口板和底板，样品槽镶嵌在槽口板的槽口中，样品槽上有二个进样孔：第一进样孔孔中上层是细胞过滤器，下层是固定着抗白蛋白抗体的免疫渗滤膜；第二进样孔孔中只有细胞过滤器。对应于第一进样孔的用于检测未结合钴离子的第一显色剂(DTT，2.0mg/ml)垫，和对应于第二进加样孔的用于检测样品中的白蛋白含量的第二显色剂(溴甲酚绿，2.0mg/ml)垫都粘附于吸收垫上，并固定于底板上。
由过度已知量的钴离子溶液，磷酸盐缓冲液和病人生物样品一起形成的混合液滴入第一进样孔中，当混合液通过孔中上层细胞过滤器时，滤掉各种血细胞，如红细胞，白细胞和各种血小板等，接着通过下层固定着抗白蛋白抗体的免疫渗滤膜去除白蛋白背景干扰物质，包括所有以自然形式出现的人白蛋白，白蛋白-钴复合物和缺血性修饰白蛋白，分离出的未结合的钴离子通过渗滤向下到达第一显色剂垫上形成有色化合物，颜色强度可反映出未结合钴离子的量，测得IMA值，所得IMA数值可为临床医生诊断病人是否有心肌缺血症状。另外将原倍病人样品滴入第二进样孔中过滤除去各种血细胞，再向下到达第二显色剂垫上，样品中的白蛋白与显色剂反应形成有色化合物，颜色强度反映出样品中的白蛋白含量，测得白蛋白含量，该数值可用来校准可能发生的因白蛋白含量过高或过低时引起的IMA判断的不正确性。免疫渗滤膜IMA测试板试剂盒检测IMA的方法步骤参见实施例6。
使用本发明一类IMA检测试剂盒检测IMA时，病人样品最好用无溶血血清或静脉全血。用户应使用试剂盒附件提供的校准品建立标准曲线，并使用质控品用于日常的质量控制。用户可在各种类型的分光光度比色仪、反射光分析仪或大中小型全自动生化仪上将本发明IMA检测试剂盒所测得的校准品数据为横坐标，依据IMA校准品上标示的IMA单位为纵坐标，使用统计软件就可绘制每种试剂盒的标准曲线，用于病人样品的IMA结果的计算和判断；IMA检测试剂盒附件提供的质控品用于日常IMA检测的质量控制，IMA质控品分为低、中和高值三种，其标示的IMA数值是一个范围，只要用户应用本发明试剂盒所测得数值在该质控品所标示的范围内，就说明整个检测操作正常。用户可在日常的IMA检测工作中附带检测质控品，可用来考核所得数据是否在允许的误差范围内。
早期胸痛半数以上的患者无明显症状和体征，心肌损伤标志物多为阴性，ECG无显著变化，处于ACS诊断的“灰带”。而IMA与传统的心肌坏死指标不同，在缺血发作后5-10min血中浓度即可升高，而不需发生心肌细胞的不可逆损伤，因此用本发明试剂盒来检测IMA特异性高，提高了阳性预测值。临床也可用来对病人进行ACS危险性分级，可用作早期诊断心肌缺血的重要依据。
临床对不稳定心绞痛病人诊断是否存在急性心肌缺血，则IMA检测更能作为重要的依据，可早期进行治疗，改善病人的愈后状况和减少死亡率。
临床判断病人在运动试验状态下是否发生心肌缺血症状，则可利用本发明IMA检测试剂盒灵敏特异的优点，对运动试验前后病人的血液样品进行检测，目的是通过观察IMA指标上升幅度的大小作为重要依据，甄别病人在实施运动试验期间是否存在心肌缺血症状；
冠状动脉腔内成形术(简称PTCA)，是一种已经成熟并有治疗效果的治疗方法，但冠心病人术后效果不好或几个月后可能再发生狭窄，这可通过特异性高和灵敏度更佳的IMA检测试剂盒来检测IMA，以满足临床在监控血管成形术过程中对IMA指标的需要。
对中风病人的诊断也可应用本发明IMA试剂盒检测IMA作为心肌缺血的依据。
本发明IMA检测试剂盒还可以联合症状和体征观察、cTn和ECG等测定指标一起使用，在临床上进行ACS的诊断，ACS的危险性分级及不稳定心绞痛病人的诊断，以提高ACS诊断的灵敏度。
本发明一类检测缺血性修饰白蛋白的试剂盒及其检测方法的优点：
1.提高了检测的特异性
对于IMA阴性样品，样品中的白蛋白结合了较多的钴离子，未结合的钴离子较少，与显色剂反应后，OD值本应较低。但已有技术试剂盒测得的偏高的阴性OD值与IMA阳性OD值差值较小，甚至高于阳性样品，导致已有技术检测方法的试剂盒特异性差，这是因为以各种形式白蛋白为主的背景干扰物质与显色剂也产生显色反应并与未结合的钴离子的OD值叠加所致。本发明试剂盒及其检测方法中通过去除白蛋白背景干扰物质，使OD值主要与未结合的钴离子相关，从而显示出真实的IMA阴性OD值，这是本发明试剂盒特异性提高的关键。而对于IMA阳性样品，由于IMA不能结合钴离子，未结合的钴离子较多，与显色剂反应后，多数未结合的钴离子贡献了比背景干扰物质大得多的OD值，通过去除白蛋白，对OD值降低的影响不大。这样IMA阴阳性的OD值差距就可明显分开，提高了检测试剂盒及其检测方法的特异性，满足临床判断的需要。
2.有较平坦的动力学反应曲线
本发明试剂盒的动力学反应曲线比较平坦(见图4)，为取得同样IMA值变化，本发明试剂盒和已有技术所要求OD值变化范围是不同的。如OD值变化0.1，本发明试剂盒IMA值变化约为15单位，而已有技术IMA单位变化较大约为75单位。而OD值0.1变化可能是由背景或系统误差引起的，并不一定是由样品本身内在差异所引起。因此本发明试剂盒不会将由系统误差造成IMA值变化导致被测样品IMA病情高估或低估，并其结果能在一般的分光光度仪上就能测出，给临床医生一个更真实的IMA参考结果。
3.适宜在分光光度比色仪和中小型全自动生化分析仪上使用
已有技术由于阴阳性OD值差异小，要求配备特殊的价格昂贵的具有很强光电信号的生化仪器才能使用。我国医院的大型全自动生化分析仪往往放在住院部，而急诊检测科配备的绝大部分是分光光度比色仪和中小型全自动生化分析仪。一般来讲胸痛患者都是急诊病人，需要急诊化验，采用本发明试剂盒，利用现有常规设备，在半小时左右就能测得IMA值来判断心肌缺血的情况。本发明IMA检测试剂盒有广阔的使用空间，可满足各层次医院的需要。
4.特别适合床边快速检测试剂盒的开发，且试剂盒中需要的抗体原料来源广，成本低，使用方便，是一个很有开发前景的产品。
附图说明
图1本发明使用检测缺血性修饰白蛋白试剂盒检测IMA方法的示意图。
图2免疫层析膜缺血性修饰白蛋白测试板试剂盒中免疫层析膜IMA测试板的立体分解结构示意图。
图3免疫渗滤膜缺血性修饰白蛋白测试板试剂盒中免疫渗滤膜IMA测试板的立体分解结构示意图。
图4本发明试剂盒与已有技术方法分别测得的OD值-IMA值的动力学曲线图。
图5离心超滤缺血性修饰白蛋白检测试剂盒建立的标准曲线图。
具体实施方式
实施例1 离心超滤IMA检测试剂盒检测IMA
离心超滤IMA检测试剂盒由钴离子溶液(CoCl2·6H2O，50mg/100ml)、磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.4)、DTT显色剂(1，4-Dithiothreitol，SIGMA公司，0.5mg/ml)、离心超滤管和配套离心管Microcon 30(Millipore公司)组成。
将离心超滤管插入配套离心管中，取100μl被测血清加入离心超滤管中，再加入200μl钴离子溶液和200μl磷酸盐缓冲液，盖紧上盖摇匀，18-37℃孵育五分钟，pH为7.5。10,000G离心15分钟，离心超滤除去混合物中的白蛋白背景干扰物质。取滤出液150μl加入试管中再加入DTT显色剂450μl混匀，采用分光光度比色仪以空白对照(150μl磷酸缓冲液和450μl水混合)调零测定样品的OD值(光径1cm，波长500nm)。所得OD值与标准曲线进行对照，即可测得IMA值，其测定值用每毫升(U/ml)表示。如病人的IMA值高于临界值就为IMA阳性，测得的IMA值可为临床医生诊断心肌缺血的症状。
实施例2 离心超滤IMA检测试剂盒的标准曲线、校准品和质控品的建立
以离心超滤IMA检测试剂盒为例说明建立标准曲线、标准品和质控品的过程。离心超滤IMA检测试剂盒的组成与实施例1相同。
30例心肌缺血阳性样品选自CK-MB、cTn阳性或ECG ST波段波动的急性胸痛急诊病人，100例正常人阴性样品选自不大于50岁，无糖尿病，高血压，高血脂，高胆固醇。血液被抽入普通试管中，十分钟后，将凝集的血液离心分离血清。测试步骤参见实施例1。IMA阴性对照组平均OD值为0.556±0.051，IMA阳性对照组平均OD值为0.803±0.127，IMA在正常人群中呈正态分布，范围(42-78U/ml)，第95百分位数定为75U/ml。所得数据作回归分析绘制标准动力学曲线(见图5)，并得到回归方程Y＝409.24x2-160.75x+28.682。
校准品和质控品是以已建立的动力学曲线为依据，使用EDTA(乙二胺四乙酸)替代血清或白蛋白。当恒量已知浓度的钴离子加入到EDTA中，就会有不同浓度未结合的钴离子，因此与DTT显色剂反应后就可产生不同可比色的产物，这样就可形成动力学反应曲线。EDTA配置浓度见下表4。
表4
  标准/质控品    EDTA浓度(mol/L)     OD值    IMA单位
  标1    0.0045     0.305    30
  标2    0.0041     0.417    40
  标3    0.0036     0.600    85
  标4    0.0033     0.701    125
  标5    0.0029     0.810    175
  质控1    0.0043     0.351    33
  质控2    0.0035     0.624    94
  质控3    0.0030     0.795    168
实施例3 免疫磁珠IMA检测试剂盒检测IMA，应用于对ACS的诊断及ACS危险性的分级
免疫磁珠IMA检测试剂盒由钴离子溶液(CoCl2·6H2O，100mg/100ml)、磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.8)、DTT显色剂(1，4-Dithiothreitol，SIGMA公司，1.0mg/ml)和与抗白蛋白抗体偶联的免疫磁珠组成。免疫磁珠制备：羧化聚苯乙烯磁性微球(上海理工大学)用6-氨基正乙酸(0.025mol/L，pH7.2，含0.15mol/LNaCl)洗涤后，用PBS重新悬浮，校正磁珠浓度。取磁珠悬液加碳化二亚胺，37℃摇15min，用PBS洗涤制成悬液，加羊抗人白蛋白抗体(SIGMA公司，2.0mg/ml)，37℃摇床摇3h，pH7.6，PB溶液复悬，4℃冷藏备用。
病人血液被抽入普通试管中，十分钟后将凝集的血液离心分离血清。取100μl血清加入到相应的试管中，再按序加入钴离子溶液200μl和磷酸盐缓冲液200μl，摇匀18-37℃孵育五分钟，pH为7。再加入500μl免疫磁珠，摇匀18-37℃孵育五分钟。然后在试管底部放上一块磁铁，待免疫磁珠沉入管底后，取上清液300μl加入试管中，再加入DTT显色剂300μl混匀，采用分光光度比色仪以空白对照(150μl磷酸缓冲液和450μl水混合)调零，测定样品的OD值(光径1cm，波长500nm)。所得OD值与标准曲线进行对照，即可测得IMA值，其测定值用每毫升单位(U/ml)表示。
根据心脏病危险因素，症状和体症、ECG、cTn和IMA标志物，对251名ACS低危人群进行危险分层。如采用已有技术美国Bor-Or D方法测的IMA，则有15名患者IMA阳性被升级，而采用本发明免疫磁珠IMA检测试剂盒测的IMA，则有6名患者IMA阳性被升级，而所有排除为IMA阴性患者均未发生ACS，显示本发明试剂盒相对于已有技术大大提高了特异性，可以更加有效地将患者分成高风险组和低风险组。
实施例4 免疫层析膜IMA测试板试剂盒检测IMA，应用于不稳定心绞痛的诊断
免疫层析膜IMA测试板试剂盒是由免疫层析膜IMA测试板、钴离子溶液(CoCl2·6H20，400mg/100ml)、磷酸盐缓冲液(0.15M，pH7.0)组成。免疫层析膜IM测试板的结构如图2所示：免疫层析膜IMA测试板有盖板217和底座218，盖板217上有二个加样孔213、214和二个观察窗215、216。免疫层析膜IMA测试条201和样品白蛋白含量测试条209分别通过硬质塑料衬垫211、212镶嵌固定在底座218上。免疫层析膜IMA测试条201上有与第一加样孔213相对应的第一样品区210、白蛋白捕获区202，显色区203和第一吸收垫204；样品白蛋白含量测试条209上有与第二加样孔214相对应的第二样品区219、金胶垫208、上面固定着抗白蛋白条带206的测试区207和第二吸收垫205。
免疫层析膜IMA测试条201上的第一样品区210由玻璃纤维组成、白蛋白捕获区202由硝酸纤维膜组成，上面固定着羊抗人白蛋白抗体(1.0mg/ml)通过喷涂常温干燥而成、显色区203是吸水纸片组成，由DTT显色剂(1，4-Dithiothreitol，SIGMA公司，2.5mg/ml)通过喷涂常温干燥而成、第一吸收垫204也是吸水纸片组成，上述材料经组合后粘贴在硬质塑料第一衬垫211上然后剪切成条状。样品白蛋白含量测试条209上的第二样品区219由玻璃纤维组成、金胶垫208是内含抗白蛋白金接物二抗的玻璃纤维，由抗白蛋白金接物二抗溶液(1.0mg/ml)滴加在玻璃纤维上常温干燥而成、测试区207是硝酸纤维膜组成，上面固定着羊抗人白蛋白抗体(1.0mg/ml)通过线条式喷涂常温干燥而成、第二吸收垫205也是吸水纸片组成，上述材料经组合后粘贴在硬质塑料第二衬垫212上然后剪切成条状。将免疫层析膜IMA测试条201和样品白蛋白含量测试条209镶嵌固定在底座218上，然后与盖板密封，装入铝箔袋中备用。
使用免疫层析膜IMA检测试剂盒检测IMA以诊断病人不稳定心绞痛症状步骤如下：取200μl病人血液加入普通试管中，然后按序加入200μl钴离子溶液和200μl磷酸盐缓冲液，摇匀18-37℃孵育五分钟，pH为8。将混合液3-5滴通过第一加样孔213滴加在第一样品区210上，同时将原倍全血样品3-5滴通过第二加样孔214滴加在第二样品区219上，稍等15分钟，可以使用反射光学分析仪分别通过二个观测窗215、216检测，所得数值与标准曲线进行比较，就可得出IMA值和白蛋白的含量，与一个已知IMA单位(U/ml)/白蛋白(g/L)标准范围相比较就可知道病人的IMA情况，辅助临床医生诊断病人不稳定心绞痛症状。
使用免疫层析膜IMA检测试剂盒对80名不稳定心绞痛患者进行临床检测，病人就诊时同时采血测定IMA和cTn。试验中cTn阳性率为19％，而IMA阳性率达75％，特异性为87％。而采用已有技术Bar-Or D方法检测同样样品，测得IMA阳性率达85％，特异性为45％。表明本发明IMA检测试剂盒使急诊或床边快速辅助诊断不稳定心绞痛症状的准确度大大提高。
实施例5 亲和层析IMA检测试剂盒检测IMA，应用于判断病人在运动试验状态下是否发生心肌缺血症状
亲和层析IMA检测试剂盒由钴离子溶液(CoCl2·6H2O，300mg/100ml)、磷酸盐缓冲液(0.2M，pH8.0)、DTT显色剂(1，4-Dithiothreitol，SIGMA公司，2.0mg/ml)和与抗白蛋白抗体偶联的亲和层析柱组成。亲和层析柱制备：Sepharose4B(SIGMA公司)经0.05M氯化钠和水冲洗抽干后用溴化氢(pH10.5)活化，抽滤水洗最后用冷0.1M pH9.5碳酸氢钠缓冲液洗后抽干。取羊抗人白蛋白抗体(5.0mg/ml)经水透析后用0.1M pH9.5碳酸氢钠缓冲液透析平衡预冷至4℃后，迅速加入刚活化了的Sepharose 4B凝胶中，4℃缓慢搅拌20h后抽滤。用0.2N甲酸和pH7.5Tris-盐酸缓冲液清洗到流出液无蛋白为止，抽干，4℃冷藏，用与抗白蛋白抗体偶联的Sepharose 4 B装柱(1.0 X 6.0CM)，然后pH7.5Tris-盐酸缓冲液平衡备用。
病人在运动试验前和刚结束情况下各抽一次血样置入试管中，十分钟后，将凝集的血液离心分离血清。取500μl血清分别加入到相应的试管中，然后每管按序加入1,000μl钴离子溶液和1,000μl磷酸盐缓冲液，摇匀18-37℃孵育五分钟，pH为9。混合液逐滴加入亲和层析柱中，待柱中液体流完后取150μl分离液加入试管中，然后加入DTT显色剂450μl混匀，分光光度比色计以空白对照(150μl磷酸盐缓冲液和450μl水混合)调零，测定样品的OD值(光径1cm，波长500nm)。所得OD值与标准曲线进行对照即可测得IMA值，其测定值用每毫升单位(U/ml)表示。
对30名不稳定心绞痛患者在病情相对稳定后做低负荷运动试验，检测结果21个病人出现IMA数值上升，为心肌缺血证据之一，表示今后发生心脏事件的危险性较大，属高危患者，应积极治疗，其中1名为假阳性；而采用已有技术美国Bar-Or D方法作同一批样品检测，则有90％病人出现IMA数值上升，其中7名为假阳性。表明本发明检测IMA试剂盒检测的准确性大于已有技术的方法。
实施例6 免疫渗滤膜IMA测试板试剂盒检测IMA，应用于对冠状动脉腔内成形术后监控诊断。
免疫渗滤膜IMA测试板试剂盒由免疫渗滤膜IMA测试板、钴离子溶液(CoCl2·6H2O，200mg/100ml)、磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.6)组成。免疫渗滤膜IMA测试板的结构如图3所示，有样品槽306，槽口板305和底板304。样品槽306镶嵌在槽口板305的槽口309中，样品槽306上有二个进样孔307和308，第一进样孔307内上层是细胞过滤器310，下层是固定着抗白蛋白抗体的免疫渗滤膜311，第二进样孔308内只有细胞过滤器310，对应于第一进样孔307的用于检测未结合钴离子的IMA显色剂垫301和对应于第二进样孔308的用于检测样品中白蛋白含量的白蛋白显色剂垫302粘附于吸收垫303并固定在底板304上。
第一进样孔307内上层是由玻璃纤维膜组成的细胞过滤器310，下层免疫渗滤膜311是由硝酸纤维薄膜上面固定着羊抗人白蛋白抗体(1.0mg/ml)，通过喷涂常温干燥而成。第二进样孔308内是由玻璃纤维膜组成的细胞过滤器310。IMA显色剂垫301由DTT显色剂(1，4-Dithiothreitol，SIGMA公司，2.0mg/ml)通过喷涂常温干燥而成，白蛋白显色剂垫302是吸水纸片基材，通过喷涂溴甲酚绿(SIGMA公司，2.0mg/ml)显色剂常温干燥而成，两者粘附于吸水纸做成的吸收垫303上，并固定在底板304上。将槽口板305与底板304密合，样品槽306镶嵌在槽口板305中后就可装入密封铝箔袋中备用。
使用免疫渗滤膜IMA测试板试剂盒在冠状动脉腔内成形术(PTCA)手术前和在最后一个球囊放气后6小时各抽取血样2ml检测IMA。
取200μl病人血样加入普通试管中，然后每管中按序加入钴离子溶液200μl和磷酸盐缓冲液200μl，摇匀18-37℃孵育五分钟，pH为8。将混合液样品3-5滴滴加入第一进样孔307中，同时将原倍全血3-5滴滴加入第二进样孔308中，稍等15分钟，移去样品槽306，使用反射光学分析仪进行检测，所得数值与标准曲线比较，就可得到一个相应的IMA单位和白蛋白含量，与一个已知IMA单位(U/ml)/白蛋白(g/L)标准范围相比较就可知道病人是否存在心肌缺血的情况。
对21个病人的样品进行检测，其中16例样品显示：与球囊胀气过程中的IMA测量值相比均有下降，临床医生可将IMA下降作为术后症状有改善证据之一，其中1名假阳性；而采用已有技术Bar-Or D方法作同一批样品检测，其中19例样品显示有下降，其中4名为假阳性。
实施例7 本发明检测IMA试剂盒与cTn、ECG联合使用快速诊断急性胸痛病症
cTn阳性或ECG显示ST段抬高或压低的患者结合临床症状可诊断为ACS，需要及时住院治疗；而对于具有胸痛症状，但cTn及ECG均无诊断性结论的患者，则可联合使用IMA试剂盒检测IMA，如IMA阴性则认为患者发生心肌缺血的危险性小，允许病人出院，若IMA阳性提示个体发生心肌缺血的危险性大，需早期积极治疗。因此，IMA用于危险分层可辅助医生尽早确定病人的处理方案，而不必等到6h后根据cTn或ECG结果才能确定。
使用离心超滤IMA检测试剂盒对50名急性胸痛患者进行临床检测，以评定IMA检测的灵敏度。病人就诊时同时采血测定ECG、IMA(具体测试步骤同实施例1)和cTn。试验结果显示cTn阳性率为10％，ECG阳性率为30％，而IMA阳性率达78％，确诊率为90％。

Claims (10)

1.一类检测缺血性修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于试剂盒是由CoCl2·6H2O10-500mg/100ml钴离子溶液、0.05-0.20M，pH7.0-8.0磷酸盐缓冲液、0.25-3.5mg/mlDTT显色剂和分离去除背景干扰物质的装置或含有DTT显色剂的分离去除背景干扰物质的装置组成。
2.按权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述分离去除背景干扰物质的装置采用离心超滤管和配套离心管，是为离心超滤缺血性修饰白蛋白检测试剂盒。
3.按权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述分离去除背景干扰物质的装置采用与抗白蛋白抗体偶联的亲和层析柱，是为亲和层析缺血性修饰白蛋白检测试剂盒。
4.按权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述分离去除背景干扰物质的装置采用与抗白蛋白抗体偶联的免疫磁珠，是为免疫磁珠缺血性修饰白蛋白检测试剂盒。
5.按权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述含有DTT显色剂的分离去除背景干扰物质的装置采用固定有抗白蛋白抗体的免疫层析膜IMA测试板，是为免疫层析膜缺血性修饰白蛋白测试板试剂盒，免疫层析膜IMA测试板的结构如下：免疫层析膜IMA测试板有盖板(217)和底座(218)，盖板(217)上有二个加样孔(213、214)和二个观察窗(215、216)，免疫层析膜IMA测试条(201)和样品白蛋白含量测试条(209)分别通过硬质塑料衬垫(211、212)镶嵌固定在底座(218)上，免疫层析膜IMA测试条(201)上有与第一加样孔(213)相对应的第一样品区(210)、白蛋白捕获区(202)，显色区(203)和第一吸收垫(204)，样品白蛋白含量测试条(209)上有与第二加样孔(214)相对应的第二样品区(219)、金胶垫(208)、上面固定着抗白蛋白条带(206)的测试区(207)和第二吸收垫(205)。
6.按权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述含有DTT显色剂的分离去除背景干扰物质的装置采用固定有抗白蛋白抗体的免疫渗滤膜IMA测试板，是为免疫渗膜滤缺血性修饰白蛋白测试板试剂盒，免疫渗滤膜IMA测试板的结构如下：有样品槽(306)，槽口板(305)和底板(304)，样品槽(306)镶嵌在槽口板(305)的槽口(309)中，样品槽(306)上有二个进样孔(307)和(308)，第一进样孔(307)内上层是细胞过滤器(310)，下层是固定着抗白蛋白抗体的免疫渗滤膜(311)，第二进样孔(308)内只有细胞过滤器(310)，对应于第一进样孔(307)的用于检测未结合钴离子的IMA显色剂垫(301)和对应于第二进样孔(308)的用于检测样品中白蛋白含量的白蛋白显色剂垫(302)粘附于吸收垫(303)并固定在底板(304)上。
7.权利要求1-6中任一权利要求所述试剂盒的检测方法，其特征在于检测方法步骤是：
(1)过度已知量的钴离子溶液，磷酸盐缓冲液与病人生物样品混合，在18-37℃孵育5分钟，成混合液，pH7-9；
(2)使用离心超滤、免疫磁珠、亲和层析柱、免疫层析膜或免疫渗滤膜分离，从混合液中分离去除背景干扰物质；
(3)将DTT显色剂与分离出的未结合钴离子进行显色反应；
(4)采用分光光度比色或反射光分析测定有色化合物颜色的强度；
(5)所得数据与标准曲线相对照，即可得到IMA值。
8.按权利要求7所述的检测方法，其特征在于所述病人生物样品是全血、血清、血浆、体液或组织液。
9.权利要求1-6中任一权利要求所述试剂盒的应用，其特征在于所述试剂盒在ACS的诊断、ACS危险性分级、急性胸痛诊断、不稳定心绞痛的诊断、病人在运动试验状态下心肌缺血症状的诊断、对冠状动脉内成形术后的监控诊断或中风病的诊断中检测IMA的应用。
10.权利要求1-6中任一权利要求所述试剂盒的应用，其特征在于所述试剂盒联合cTn和ECG测定在ACS的诊断、ACS危险性分级、急性胸痛诊断、或不稳定心绞痛的诊断中检测IMA的应用。
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Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102507916A (zh) * 2011-11-07 2012-06-20 宁波美康生物科技股份有限公司 缺血修饰白蛋白液体稳定试剂盒
CN101685080B (zh) * 2008-06-12 2012-10-31 高尚先 一种生物样品中蛋白质组的分析方法
CN102062735B (zh) * 2009-11-18 2013-09-18 江苏迈迪基因生物科技有限公司 急性冠状动脉综合症的生物标志物诊断试剂盒
CN103344768A (zh) * 2013-07-10 2013-10-09 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 缺血性心脏病检测试剂盒及其应用
CN103558397A (zh) * 2013-11-04 2014-02-05 山东博科生物产业有限公司 一种缺血修饰白蛋白检测试剂及检测方法
CN103558398A (zh) * 2013-11-04 2014-02-05 山东博科生物产业有限公司 一种抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂
CN103983641A (zh) * 2014-05-30 2014-08-13 浙江海拓环境技术有限公司 一种用于检测水体中苯胺类化合物的试剂盒
CN103983777A (zh) * 2014-05-07 2014-08-13 大连理工大学 一种基于纳米二氧化铈仿生氧化酶的微囊藻毒素比色检测方法
CN105973887A (zh) * 2016-07-21 2016-09-28 韩雅君 一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的芯片
CN105973888A (zh) * 2016-07-21 2016-09-28 韩雅君 一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒
CN107155348A (zh) * 2014-09-27 2017-09-12 特雷西-艾比利蒂有限公司 用于表征分析物的基于托板的系统
CN108291909A (zh) * 2015-04-28 2018-07-17 奥菲迪亚有限公司 分析物检测及其方法
CN108344734A (zh) * 2012-12-18 2018-07-31 安盛生科股份有限公司 分析物测量的方法和装置
CN109557322A (zh) * 2018-12-13 2019-04-02 蓝怡科技集团股份有限公司 一种缺血修饰白蛋白校准品及其应用
US10309947B2 (en) 2013-02-27 2019-06-04 Trace-Ability, Inc. System and method for radiosynthesis, quality control and dose dispensing
CN110018301A (zh) * 2018-01-09 2019-07-16 上海八通生物科技股份有限公司 一种组合式免疫层析装置
CN111665209A (zh) * 2020-07-24 2020-09-15 北部湾大学 基于连续采血的中国鲎血液质量监测方法
US10895563B2 (en) 2014-02-26 2021-01-19 Trace-Ability, Inc. Palette-based systems for analyte characterization
US11002717B2 (en) 2014-02-26 2021-05-11 Trace-Ability, Inc. Systems and methods for characterizing radioactive analytes

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019238554A1 (en) 2018-06-11 2019-12-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of predicting the risk of having lower-extremity artery disease in patients suffering from type 2 diabetes
CN112585445A (zh) * 2018-08-24 2021-03-30 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 血样分析仪、血样分析方法及计算机存储介质
CN113082053B (zh) * 2021-04-06 2022-05-24 武汉济源高科技有限公司 一种封闭抗体减少或缺失引起的习惯性流产治疗试剂盒

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6461875B1 (en) * 1998-10-02 2002-10-08 Ischemia Technologies, Inc. Test for rapid evaluation of ischemic states and kit
US7074194B2 (en) * 2003-05-19 2006-07-11 Ischemia Technologies, Inc. Apparatus and method for risk stratification of patients with chest pain of suspected cardiac origin
CN1888907B (zh) * 2006-08-03 2010-07-21 北京航天总医院 一种缺血修饰白蛋白的测定方法

Cited By (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101685080B (zh) * 2008-06-12 2012-10-31 高尚先 一种生物样品中蛋白质组的分析方法
CN102062735B (zh) * 2009-11-18 2013-09-18 江苏迈迪基因生物科技有限公司 急性冠状动脉综合症的生物标志物诊断试剂盒
CN102507916B (zh) * 2011-11-07 2013-11-06 宁波美康生物科技股份有限公司 缺血修饰白蛋白液体稳定试剂盒
CN102507916A (zh) * 2011-11-07 2012-06-20 宁波美康生物科技股份有限公司 缺血修饰白蛋白液体稳定试剂盒
CN108344734A (zh) * 2012-12-18 2018-07-31 安盛生科股份有限公司 分析物测量的方法和装置
CN108344734B (zh) * 2012-12-18 2022-08-02 安盛生科股份有限公司 分析物测量的方法和装置
US10309947B2 (en) 2013-02-27 2019-06-04 Trace-Ability, Inc. System and method for radiosynthesis, quality control and dose dispensing
CN103344768A (zh) * 2013-07-10 2013-10-09 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 缺血性心脏病检测试剂盒及其应用
CN103344768B (zh) * 2013-07-10 2015-05-20 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 缺血性心脏病检测试剂盒及其应用
CN103558397A (zh) * 2013-11-04 2014-02-05 山东博科生物产业有限公司 一种缺血修饰白蛋白检测试剂及检测方法
CN103558398A (zh) * 2013-11-04 2014-02-05 山东博科生物产业有限公司 一种抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂
CN103558397B (zh) * 2013-11-04 2015-06-10 山东博科生物产业有限公司 一种缺血修饰白蛋白检测试剂及检测方法
US11846621B2 (en) 2014-02-26 2023-12-19 Trace-Ability, Inc. Method of determining radiation characteristic of a sample
US11002717B2 (en) 2014-02-26 2021-05-11 Trace-Ability, Inc. Systems and methods for characterizing radioactive analytes
US10895563B2 (en) 2014-02-26 2021-01-19 Trace-Ability, Inc. Palette-based systems for analyte characterization
CN103983777A (zh) * 2014-05-07 2014-08-13 大连理工大学 一种基于纳米二氧化铈仿生氧化酶的微囊藻毒素比色检测方法
CN103983641B (zh) * 2014-05-30 2016-07-13 浙江海拓环境技术有限公司 一种用于检测水体中苯胺类化合物的试剂盒
CN103983641A (zh) * 2014-05-30 2014-08-13 浙江海拓环境技术有限公司 一种用于检测水体中苯胺类化合物的试剂盒
CN107155348A (zh) * 2014-09-27 2017-09-12 特雷西-艾比利蒂有限公司 用于表征分析物的基于托板的系统
CN107155348B (zh) * 2014-09-27 2020-04-28 特雷西-艾比利蒂有限公司 用于表征分析物的基于托板的系统
CN108291909A (zh) * 2015-04-28 2018-07-17 奥菲迪亚有限公司 分析物检测及其方法
CN108291909B (zh) * 2015-04-28 2022-07-12 森佐健康有限公司 分析物检测及其方法
CN105973887B (zh) * 2016-07-21 2018-09-18 西安良升生物科技有限公司 一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的芯片
CN105973888B (zh) * 2016-07-21 2018-09-18 西安良升生物科技有限公司 一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒
CN105973888A (zh) * 2016-07-21 2016-09-28 韩雅君 一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的试剂盒
CN105973887A (zh) * 2016-07-21 2016-09-28 韩雅君 一种快速检测血液中缺血修饰白蛋白的芯片
CN110018301A (zh) * 2018-01-09 2019-07-16 上海八通生物科技股份有限公司 一种组合式免疫层析装置
CN109557322A (zh) * 2018-12-13 2019-04-02 蓝怡科技集团股份有限公司 一种缺血修饰白蛋白校准品及其应用
CN111665209A (zh) * 2020-07-24 2020-09-15 北部湾大学 基于连续采血的中国鲎血液质量监测方法
CN111665209B (zh) * 2020-07-24 2021-12-21 北部湾大学 基于连续采血的中国鲎血液质量监测方法

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