CN101685080B - 一种生物样品中蛋白质组的分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种生物样品中蛋白质组分析方法，该方法可以在肿瘤早期通过血液或体液检测到癌细胞产生的独特的蛋白质组；采用该方法，可以更敏感、更早期的诊断癌症，使癌症早期诊断与治疗成为可能。

Description

一种生物样品中蛋白质组的分析方法

技术领域

本发明涉及一种生物样品中蛋白质组分析方法，特别是一种鉴定不同生物样品中特异表达蛋白组的分析方法，更确切的说，涉及到鉴定肿瘤细胞产生的特异表达蛋白的方法，属于生物医药领域。

背景技术

目前在大、中城市里，医院门诊部所见到的癌症病人，一般说来，早期(I期)病人约占5％～10％，中期(II期)约占20％，较晚期的病人(III+IV期)约占70％～75％。较晚期病人治疗后的5年生存率只有10％～30％。从60年代至今，我国一些医务人员和科研人员在不同的癌症高发区、高危人群中展开了癌症的初筛、普查普治，发现了许多早期病人，早期癌症病人约占普查发现癌症总数的30％～70％。早期癌症病人正规治疗后的5年生存率高达70％-95％。

对癌症控制的策略是预防为主，防治结合，重在三早，三早是指早期发现，早期诊断和早期治疗。只有这样，才能以较少的投入，获得较好的控制癌症的效果。早期得到诊断的癌症病人住院治疗，在肿瘤体积小、没有发生转移的情况下，患者的自身免疫功能良好，往往在手术切除即可治愈，住院治疗时间短，花费的医疗费用少。但当较晚期才确诊的癌症病人，需要应用综合治疗，治疗时间长，医疗费用高，而且治疗效果差。

所以，肿瘤治疗的关键在于早期发现和早期治疗。目前认为：能在CT、MRI下观察到的占位性病变已算不上最早期，当然也不是治疗的最佳时期。应该从细胞生物学角度看癌变，并做到早期诊断，才能够将肿瘤扼杀在细胞萌芽期或肿瘤形态可见的最早期。

由于不论是细胞的正常功能还是病理特性都在一定程度上取决于细胞所表达的蛋白质功能。因此，鉴定细胞内表达的蛋白质组的区别，可用于诊断疾病，并可用于药物开发和疾病治疗。而要进行蛋白质组表达和功能的差异化分析，要求能够达到分辨细胞内分子的复杂混合物的程度。但细胞内许多物质往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用这些常规手段难以进行定性鉴定和定量分析。

目前，一种常用的蛋白质分离的方法是凝胶电泳。通常是用凝胶内等电点聚焦先分离蛋白质组，再用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行第二次分离。结果得到一张根据等电点范围(净电荷)和大小(质量)来区分蛋白质的图。但是该方法存在以下几方面的局限。首先，该方法只能根据蛋白质分子质量和等电点(pI)对蛋白质分子进行区分；其次，各维度的分辨率受到凝胶分辨能力的限制，通常很难区分质量差异小于5％或等电点相近的生物分子。第三，凝胶的容量和灵敏度都有限，可能无法检测出少量和微量表达的生物分子。第四，无法观察到分子量低于约10～20kDa的小肽。

目前临床诊断疾病的一般方法是要求特异性地检测出疾病的已知标记。但是，制备特异性结合标记并且能在复杂的混合物中鉴别出标记的试剂需要大量时间，因此阻碍了此类诊断方法的发展。

用质谱的方法测定蛋白质组是较新的方法，如申请号为03148375.5、名称为用于生物样品分析的蛋白指纹法的专利，涉及用滞留层析法捕获蛋白质组进行分析的蛋白指纹法。采用质谱法进行鉴别检测蛋白质组，分析所得数据的形式是可用计算机读取的条码格式(蛋白指纹)。该发明的方法可用于细胞和临床疾病的诊断，如肿瘤的诊断。

申请号为200610140288.8、名称为“用磁珠支持基质及质谱判断正常人与肝癌的试剂盒和方法”的专利申请，涉及一种用磁珠支持基质的方法捕获生物样品中肝癌蛋白质组，用磁性分离器分离磁珠及样品，无需离心样品，然后用质谱法进行分析的蛋白指纹分析。

专利号为ZL03148375.5、名称为“用于生物样品分析的蛋白指纹法”的专利，涉及用滞留层析法捕获蛋白质组进行分析的蛋白指纹法。

但是以上专利由于其反应条件的设计使其敏感性即早期检出率仍然有待于提高。

发明内容

本发明的发明目的在于提供一种生物样品中蛋白质组的分析方法，该方法具有更高的敏感性即早期检出率。

本发明的又一发明目的在于提供一种鉴定生物样品中特异表达蛋白的分析方法，特别是在肿瘤形态不可见或可见的情况下，检测血液或体液中癌细胞产生的独特的蛋白质组的方法。

本发明的再一发明目的在于提供一种根据上述方法的原理制备的试剂盒。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

本发明提供的一种生物样品中蛋白质组的分析方法，包括如下步骤：

本发明涉及一种生物样品中蛋白质组的分析方法，包括如下步骤：

(1)生物样品预处理：在生物样品中加入1～2倍体积的U9尿素缓冲液，放置5～10分钟后加入1～2倍体积的结合试剂，得到生物样品预处理溶液；

(2)纳米磁珠处理：在步骤(1)得到的生物样品预处理溶液中加入纳米磁珠，置于磁铁上孵育10～30min后弃去液体，加入1～2倍体积的结合试剂，置于磁铁上孵育1～5min使纳米磁珠结合肿瘤标记物，弃去液体；在纳米磁珠中加入洗脱液，洗脱1～5min，得上清液；

(3)芯片分析：将步骤(2)得到的上清液进行蛋白质谱分析，得到指纹图谱；

其中，所述结合试剂为pH3.55～3.95、30～40mmol/L的醋酸钠溶液，所述洗脱液为质量百分比浓度为5％三氟醋酸溶液。

其中，本发明中的纳米磁珠优选为弱阳离子交换型纳米磁珠；

本发明的又一优选方案为：结合试剂优选为pH3.65～3.85、35～40mmol/L的醋酸钠溶液，进一步优选为pH3.75的醋酸钠溶液。

其中，本发明中的生物样品包括血清、血浆、唾液、精液、淋巴液、尿液以及其他体液；本发明中的U9尿素缓冲液中含有9mol/L的尿素、质量百分比含量为2％的CHAPS、50mmol/L的Tris盐酸，1％二硫苏糖醇，pH为9.0。

本发明的再一优选方案为：在步骤(2)中，加入pH3.55～3.95的醋酸钠溶液，置于磁铁上孵育1～5min使纳米磁珠结合肿瘤标记物，弃去液体；重复1～3次后加入质量百分比浓度为5％三氟醋酸溶液进行洗脱。

本发明还涉及一种鉴定生物样品中特异表达蛋白的分析方法，包括以下步骤：

(1)按照本发明中的方法建立正常生物样品的蛋白质组指纹图谱库；

(2)按照同步骤(1)相同的方法和条件建立待测生物样品的蛋白质组指纹图谱库；

(3)将正常生物样品的指纹图谱库与待测生物样品的指纹图谱库比较，根据特异指纹确定特异指纹峰，特异指纹峰对应的蛋白即为待测生物样品的特异表达蛋白。

本发明还涉及鉴定生物样品中特异表达蛋白的分析方法在检测癌变细胞或组织的蛋白质特异表达中的应用。其中，癌变细胞或组织选自肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、食管癌、鼻咽癌、胰腺癌、乳腺癌，卵巢癌、宫颈癌、恶性淋巴瘤或皮肤癌的细胞或组织。

本发明分析方法的孵育的目的是使纳米磁珠与肿瘤标记物结合，肿瘤标记物为蛋白质组、细胞中发生了突变的基因、蛋白质、多肽或其他小分子物质，其中蛋白质组是指一个基因组、一个细胞或组织或一种生物体所表达的全部蛋白质，所述的其他小分子物质为氨基酸或多糖、质谱能够检测并具有识别意义的物质。

本发明的质谱分析优选飞行质谱。选用飞行质谱时，需要将步骤(2)最终得到的上清液与SPA饱和溶液以1∶1～1∶2的比例混合，然后加样到Au/Steel芯片上，晾干，然后质谱测定。SPA为Sinapinic acid在50％乙腈(ACN)和0.5％三氟乙酸(TFA)的饱和溶液，其作用是作为介质，使蛋白质分子在介质中分开，同时作为能量吸收分子，Au/Steel芯片上保留的蛋白在特异的激光照射后，发生解离作用，带电分子在通过电场时加速，记录仪记录飞行时间的长短，质量越轻，相对所带的电荷越多(质荷比m/z越小)，飞行时间越短。信号由高速的模拟数字转化器传化并记录，被测定的蛋白质以一系列峰的形式呈现，形成指纹图谱。

当两种生物样品分别为正常血清或其它体液和各种癌症的血清或其它体液时，特异指纹峰对应的蛋白即为肿瘤细胞的特异表达蛋白。所述癌症选自肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、食管癌、鼻咽癌、胰腺癌、乳腺癌，卵巢癌、宫颈癌、恶性淋巴瘤或皮肤癌等。

本发明中，结合试剂是本发明的主要改进之处，现有技术所用的结合试剂，通常为pH4.0～6.0的醋酸钠溶液，更常用的是pH为4.0的醋酸钠溶液，这是因为通常认为pH过高或过低都不利于吸附载体与蛋白质组的结合。但本发明人经过反复试验和研究发现，当吸附载体为纳米磁珠时，以pH为3.55～3.95的醋酸钠溶液作为结合试剂，纳米磁珠可捕捉更多的肿瘤早期尤其是小分子标记物，从而大大提高了本发明方法对肿瘤的敏感性即早期检出率。这是由于蛋白质具有两性电离的性质，当蛋白质溶液的pH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。在生物样本中，能起诊断意义的小分子蛋白质的等电点为5.0左右，因而在较低pH条件下带更多的正电荷，从而可以大大提高检测的灵敏度，检测到低丰度的分子量较小的蛋白质分子。由于肿瘤早期会出现一些低风度小分子的标记物，因而本发明的方法具有更高的灵敏度，为癌症的早期诊断提供的一种有效的方法。

实验中发现，使用pH为3.55～3.95的醋酸钠溶液作为结合试剂，较pH4.0～6.0的醋酸钠溶液作为结合试剂，能更敏感的即更早的检测到肿瘤早期低丰度的肿瘤标志物、较早的得到肿瘤特异指纹图谱峰，另外，本发明方法可检测出更多的低丰度尤其是肿瘤特异的碱性小肽标志物，从而增大了正常指纹图谱和癌症指纹图谱间的差异性，提高了早期癌症的检出率。同时，由于本发明方法更加灵敏，因此可以检测出更加早期的癌症。现有技术的指纹图谱一般只有当肿瘤直径达到0.5cm时才能检测到，而本发明方法可检测到直径为0.3以下的肿瘤，可通过PET-CT观察至0.3cm时而证实，因此，本发明方法无疑对癌症的早期检测和治疗有重要的意义。

此外，本发明还涉及一种用于检测早期癌症的试剂盒，包括纳米磁珠，结合试剂、洗脱液和磁架，结合试剂为pH3.55～3.95的醋酸钠溶液，洗脱液为5％三氟醋酸溶液；磁架为设置有小孔的磁铁，小孔与PCR管相匹配；纳米磁珠优选带羧基的纳米磁珠。使用时，按照上述方法，将纳米磁珠放入PCR管中，加入经过步骤(1)处理的生物样品，然后放入磁架上的小孔，由于磁架为磁铁制成，因此带有磁性，可进行孵育，10～30分钟后将PCR管从磁架的小孔中取出，孵育自然结束，除去上清液，然后加入结合试剂，仍放入磁架的小孔孵育1～5分钟，使纳米磁珠与肿瘤标记物结合，除去液体；之后PCR管中加入洗脱液，反应1～5分钟；洗脱肿瘤标记物至上清液；上清液即可直接用于质谱分析。

综上所述，本发明提供了一种生物样品中蛋白质组分析方法，该方法可以在肿瘤形态不可见或可见的情况下，通过血液或体液检测到非常早期癌细胞产生的独特的蛋白质组；采用该方法，可以更敏感、更早期的诊断癌症，使癌症早期诊断与治疗成为可能。本发明的方法还可以监测肿瘤，在肿瘤治疗前、治疗中和治疗后检测肿瘤特异性物质的水平可帮助了解治疗效果，监测肿瘤有无早期复发和转移。进一步，本发明的方法还可以用于肿瘤药物的开发。

附图说明

图1为灵敏度实验的蛋白质指纹图谱。

具体实施方式

以下实施例对本发明进行进一步的说明，并不对本发明作出任何限制。

实施例1  肝癌的  诊断

1.建立正常血清的标准指纹图谱库，其方法如下：

连续体检三年健康的志愿者1000名，男女各半，年龄20～50，均无家族病史，至少两代无癌症患者，抽血数滴，分离出血清。将1μL血清加入2倍体积U9缓冲液稀释(含有9mol/L尿素、2％CHAPS、50mmol/LTris盐酸、1％DTT，pH9.0)后，冰浴振荡30min，使蛋白质组与尿素作用。然后在上述样品中加入3μL pH3.75的40mM醋酸钠结合试剂；将MACS纳米磁珠(德国美天旎生物技术公司产品)加入该血清，置于磁铁上孵育10～30min；除去上清液；然后加入结合试剂，置于磁铁上孵育1～5min，使纳米磁珠结合肿瘤标记物，除去液体；加入5％TFA溶液，反应1～5min；洗脱肿瘤标记物至上清液用于用质谱仪检测。

采用上述方法分别检测其余志愿者，用统计学方法，采用计算机分析质谱数据结果。得到具有统计学意义的质谱图谱标准指纹图谱。

2.建立肝癌的血清指纹图谱库

CT、核磁共振等检查诊断为肝癌的患者300例，男女各半，年龄40～60，所有患者已经手术切除肿瘤，病理结果证明为肝癌。

术前抽检全血采集后吸取血清，置于-80℃保存。

取血样标本分离出血清。按照同建立正常血清的标准指纹图谱库相同的方法进行操作。采用上述方法分别检测其余患者，用统计学方法，采用计算机分析质谱数据结果。得到具有统计学意义的质谱图谱标准指纹图谱。

3.将乙肝患者的血清与上述相对应的指纹图谱比较，根据特异指纹图谱确定该患者是否已患肝癌。

抽取乙肝患者静脉血5ml，分离出血清。照同建立正常血清的标准指纹图谱库相同的方法进行操作。

双盲测试30例，正常与肝癌测试，结果见表1：

表1

敏感性：96.6％，特异性：100％

具体比较方法如下：

在指纹图谱中，2045Da、3460Da、3780Da、3935Da、4280Da、4469Da、4569Da、5627Da、5012Da、8687Da和8933Da等处的10个峰的同时变化对于诊断胃腺癌具有重要意义，该10个种蛋白指纹可以用于区分正常人细胞和肝癌患者细胞。其中在4280Da、3780Da等两处峰所有的病人均比正常人高，5627Da、4569Da峰出现在所有病人中，而正常人中则无此峰。通过这10个峰的鉴别，可以准确地鉴定被诊断者，在受试的126例中，有2例被诊断为肺癌，术后病理学检测证明诊断的正确，其它跟踪5年未见异常。

本发明采用计算机分析质谱数据结果，通过操作者对比或用分析软件自动分析对比质谱图中强弱沿着线性轴的暗度强度值信号，本发明中采用Ciphergenproteinchip 3.0版本的分析软件自动采集数据，然后用Biomarker Wizard软件分析HepG2、HepG 2.2.15细胞的蛋白质谱差异，通过被诊断者与正常及癌症患者谱图三者之间的差异，判断被诊断者罹患癌症的可能，再经过定期的血液检查、CT、核磁共振等检查，进行癌症的监测。

实施例2胃癌的诊断

1、建立正常血清的标准指纹图谱库：

连续体检三年健康的志愿者1000名，男女各半，年龄20～50，均无家族病史，至少两代无癌症患者，抽血数滴，按照实施例2的方法处理。区别为：结合试剂pH为3.95。

2、建立胃癌的血清指纹图谱库；

CT、核磁共振等检查确诊为胃癌的患者52名，男女各半，年龄40～60，所有患者以经手术切除肿瘤，病理结果证明为胃癌。术前抽检全血采集后按照样品收集项下的方法处理吸取血清，置于-80℃保存；按照实施例1的方法处理。不同之处在于结合试剂pH为3.95。

3、将被诊断者的血清或其它体液与上述相对应的指纹图谱库比较，根据特异指纹确定癌症的类别。

4、实验结果

1588Da、1725Da、1817Da、2046Da、3175Da、5084Da、5252Da、5910Da、6027Da、6956Da、75671Da和8691Da处的12个峰的同时变化对于诊断胃腺癌具有重要意义，其中在5910Da、6027Da峰处所有的病人均比正常人高，5084Da、6956Da峰处在病人中均在该峰旁边出现二联峰或三联峰。在这三个峰中只有8691Da峰的值为肿瘤病人低于正常人。通过这五个峰的鉴别，本实验中50例患胃腺癌的样品中有48例被准确的检出为胃腺癌，1000例健康志愿者中有990例确定为非胃腺癌患者。此结果表明，该方法的灵敏度为98％(48/50)，特异性99％(990/1000)。

实施例3 通过体 液进行直肠癌的诊断

1、建立正常尿液的标准指纹图谱库

连续体检三年健康的志愿者1000名，男女各半，年龄20～50，均无家族病史，至少两代无癌症患者。采集尿液按照实施例2的步骤处理并进行质谱分析，不同之处在于所用结合试剂的pH为3.55。

2、建立直肠癌的尿液指纹图谱库；

CT、核磁共振等检查确诊为直肠癌的患者278名，男女各半，年龄40～60，所有患者以经手术切除肿瘤，病理结果证明为直肠癌。采集尿液按照实施例1的步骤处理并进行质谱分析，不同之处在于所用结合试剂的pH为3.55。

3、将被诊断者的血清或其它体液与上述相对应的指纹图谱库比较，根据特异指纹确定癌症的类别。

4、实验结果

通过分析几千种尿液蛋白指纹峰，发现下述12种蛋白指纹可以用于诊断正常与直肠癌(P＜0.01)：

2045Da、2812Da、2872Da、3372Da、3390Da、3935Da、4095Da、4469Da、5908Da、7910Da、8687Da、8933Da。

将来自具有统计意义的患者群的样品与正常样品比较，这12种蛋白指纹，可以用于鉴别诊断。

实施例4灵敏度实验

1.实验过程

1.1分组：取实施例1中建立肝癌指纹图谱的样本300例，随机分为2组；

1.2实验过程：

组1(150例)：将肝癌患者的血清1μL加入2倍体积U9缓冲液稀释(含有9mol/L尿素、2％CHAPS、50mmol/LTris盐酸、1％DTT，pH9.0)后，冰浴振荡30min，使蛋白质组与尿素作用。然后在上述样品中加入3μL pH3.75的40mM醋酸钠结合试剂；将MACS纳米磁珠(德国美天旎生物技术公司产品)加入该血清，置于磁铁上孵育10～30min；除去上清液；然后加入结合试剂，置于磁铁上孵育1～5min，使纳米磁珠结合肿瘤标记物，除去液体；加入5％TFA溶液，反应1～5min；洗脱肿瘤标记物至上清液用于用质谱仪检测；

组2(150例)：将肝癌患者的血清1μL加入2倍体积U9缓冲液稀释(含有9mol/L尿素、2％CHAPS、50mmol/LTris盐酸、1％DTT，pH9.0)后，冰浴振荡30min，使蛋白质组与尿素作用。然后在上述样品中加入3μL pH4.0的50mM醋酸钠结合试剂；将MACS纳米磁珠(德国美天旎生物技术公司产品)加入该血清，置于磁铁上孵育10～30min；除去上清液；然后加入结合试剂，置于磁铁上孵育1～5min，使纳米磁珠结合肿瘤标记物，除去液体；加入5％TFA溶液，反应1～5min；洗脱肿瘤标记物至上清液用于用质谱仪检测。

2.实验结果

如图1所示，下图为组1得到的蛋白质指纹图谱，上图为组2得到的蛋白指纹图谱。从图中可以看出，当pH为3.75时，蛋白图谱的峰值显著提高，特征峰的数量也明显增多，尤其在小于4000Da图谱部分，特征峰数量显著增多，提示在pH为3.75时，可以检测出更多的分子量较小的肽，由于在肿瘤发展的早期特征的碱性小肽标记物较多，因而选用较低的pH值，可以提高对肿瘤的敏感性即早期检出率。

同样，按照上述实验过程对胃癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、食管癌、鼻咽癌、胰腺癌、乳腺癌，卵巢癌、宫颈癌、恶性淋巴瘤、皮肤癌的生物样本分析，发现在pH为3.55～3.95时得到的蛋白图谱峰值和特征峰数量要明显好于pH为4.0～6.0的蛋白图谱，其中，尤其以pH为3.75时的蛋白图谱最好。

Claims (6)

1.一种生物样品中蛋白质组的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）生物样品预处理：在生物样品中加入1～2倍体积的U9尿素缓冲液，放置5～10分钟后加入1～2倍体积的pH 3.55～3.95、30～40mmol/L的醋酸钠溶液，得到生物样品预处理溶液；其中，所述的U9尿素缓冲液中含有9mol/L尿素、2%CHAPS、50mmol/LTris盐酸、1%DTT，pH为9.0；

（2）纳米磁珠处理：在步骤（1）得到的生物样品预处理溶液中加入纳米磁珠，置于磁铁上孵育10～30min后弃去液体，加入1～2倍体积的pH 3.55～3.95、30～40mmol/L的醋酸钠溶液，置于磁铁上孵育1～5min使纳米磁珠结合肿瘤标记物，弃去液体；在纳米磁珠中加入质量百分比浓度为5％三氟醋酸溶液，洗脱1～5min，得上清液；

（3）质谱分析：将步骤（2）得到的上清液进行蛋白质谱分析，得到指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的蛋白质组的分析方法，其特征在于，所述的纳米磁珠为弱阳离子交换型纳米磁珠。

3.根据权利要求1所述的蛋白质组的分析方法，其特征在于，在步骤（1）和（2）中加入的醋酸钠溶液的pH为3.65～3.85。

4.根据权利要求3所述的蛋白质组的分析方法，其特征在于，所述的醋酸钠溶液的pH为3.75。

5.根据权利要求1所述的蛋白质组的分析方法，其特征在于，所述的生物样品包括血清、血浆、唾液、精液、淋巴液和尿液。

6.根据权利要求1所述的蛋白质组的分析方法，其特征在于，在步骤（2）中，加入pH 3.55～3.95的醋酸钠溶液，置于磁铁上孵育1～5min使纳米磁珠结合肿瘤标记物，弃去液体；重复1～3次后加入质量百分比浓度为5％三氟醋酸溶液进行洗脱。

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