CN101936948A - 血清多肽的质谱检测方法 - Google Patents

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余传定
郑智国
许沈华
徐琦
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Abstract

本发明公开了一种血清多肽的质谱检测方法，用磁珠支持基质的方法捕获血清中胃癌多肽组，用磁性分离器分离磁珠及样品，无需离心样品。然后用质谱法分析多肽谱图。本发明的方法可用于正常人与胃癌患者的血清样品检测，其检测结果在早期胃癌的诊断中可以作为重要的检测依据。本发明检测方法准确、方便且快捷。

Description

血清多肽的质谱检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及血清多肽的质谱检测方法。
背景技术
胃癌是消化道常见恶性肿瘤之一，2006年，全球新增胃癌病例近93万，死亡70万。而我国胃癌死亡率男性(40.8/10万)和女性(18.6/10万)分别为欧美发达国家的4.2-7.9倍和3.8-8.0倍。可见我国胃癌死亡率比较高，形势严峻。外科手术是唯一可以治愈胃癌的方法，由于其诊断时常常处于进展期，从而失去手术彻底切除的机会。因而，早期诊断和早期治疗对于提高胃癌患者的长期存活率有重要意义。
目前胃镜检查是发现早期胃癌的有效手段，但胃镜检查不易被人接受，难于用在人群普查，因而，寻找一种简单，微创或无创且灵敏度和特异性高的早期胃癌诊断方法是研究热点，至今仍未找到一种理想的肿瘤标志物。近年来，表面增强激光解吸附离子化/时间-飞行质谱(surface enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，SELDI/TOF-MS)被广泛用于胃癌标志物研究。但是用于研究的病例数都比较有限，因而会有一定的局限性。
发明内容
本发明提供了一种血清多肽的质谱检测方法，对胃癌患者血清多肽进行定量测定，有利于胃癌的早期诊断，治疗方案的确定以及预后的判断。
一种血清多肽的质谱检测方法，依次包括以下步骤：
(1)对血清样品进行预处理；
(2)将弱阳离子交换型(WCX)磁珠分装到聚合酶链式反应管(PCR管)中，然后将聚合酶链式反应管置于磁性处理器上，移除聚合酶链式反应管内的液体；
(3)将聚合酶链式反应管从磁性处理器中取出，向聚合酶链式反应管里加入缓冲液并混合均匀；再将聚合酶链式反应管置于磁性处理器上，移除聚合酶链式反应管内的缓冲液；所述的缓冲液为40～50mmol/L乙酸钠缓冲液，其pH为3.5～4.5；
(4)将聚合酶链式反应管从磁性处理器中取出，向聚合酶链式反应管中加入步骤(1)预处理后的血清样品，混合均匀后静置；
(5)将聚合酶链式反应管置于磁性处理器上，移除聚合酶链式反应管内的液体；
(6)将聚合酶链式反应管从磁性处理器中取出，向聚合酶链式反应管中加入所述的缓冲液并混合均匀；再将聚合酶链式反应管置于磁性处理器上，移除聚合酶链式反应管内的缓冲液；
(7)将聚合酶链式反应管从磁性处理器中取出，向聚合酶链式反应管中加入洗脱液，混合均匀后静置；所述的洗脱液为体积百分比为0.5～1％的三氟乙酸(TFA)，配制所述的洗脱液所用的溶剂是色谱级水(HPLC级水)；
(8)将聚合酶链式反应管置于磁性处理器上，吸取聚合酶链式反应管内的液体；
(9)将步骤(8)中所吸取的液体与饱和芥子酸溶液混合均匀形成混合液，吸取所述的混合液到基质辅助激光解析电离质谱的靶上，待靶上的溶液结晶后放入质谱仪中进行检测，得到血清多肽谱图。
本发明中，所述的磁珠可以通过商业途径购买得到，比如荷兰MagSi公司的WCX磁珠，Dynal的WCX磁珠，优选采用直径为1um～1.2um的磁珠。
本发明中，所述的磁性处理器为内部设有磁铁的装置，可设有各种形状的支架，其具有磁力并可分离磁珠。当含有磁珠的反应体系放置在磁性处理器上时，在磁力的作用下，溶液中本来相对均匀分布的磁珠集中在磁极方向，从而达到分离磁珠的目的。
本发明中，所述的步骤(1)中所述的预处理的方法如下：
将血清样本预先保存于-70℃以下，使用时，先在冰上融解后，再以体积比为1∶2的比例稀释在U9缓冲液中(U9缓冲液是指：9mol/LUrea，2％CHAPS，50mmol/L Tris-HCL，pH 9.0)。通常所述的稀释在小管中进行，如1.5毫升离心管。
本发明中，所述的芥子酸饱和溶液按以下方法配制：
将每10毫克芥子酸溶于300微升的乙腈和三氟乙酸的水溶液中而成，所述乙腈和三氟乙酸的水溶液中，乙腈的体积百分比为50％，三氟乙酸的体积百分比为0.5％，水为色谱级水(HPLC级水)。
本发明中，所述的质谱仪中离子化方式可以为基质辅助激光解吸电离(MALDI)，例如德国Bruker公司的flex系列，如MicroFlex、AutoFlex、UltraFlex等，Ciphergen biosystems公司的SELDI-TOF等。
本发明中，所述的缓冲液优选为50mmol/L乙酸钠缓冲液，其pH为4.5。
本发明中，所述的洗脱液优选为体积百分比为1％的三氟乙酸，配制所述的洗脱液所用的溶剂是色谱级水。
本发明中，优选在每次检测前标准化质控血清监测整个方法体系稳定性，包括所用试剂和质谱能量。
本发明中，优选定期使用分子量校正品校正质谱分子量，通常为每周校正一次。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
通过血清学微创、简便的方法结合质谱分析，检测出特征差异峰，作为早期胃癌的诊断中的重要检测依据，从而在人群中筛选出高疑患者，然后结合内镜和病理技术做进一步的确诊，大大提高早期胃癌的发现率。
具体实施方式
下面结合实施例来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。
实施例1
本发明的血清多肽的质谱检测方法，其具体步骤如下：
先将选好的磁珠(Dynal公司的WCX磁珠)按32ul/管分装到聚合酶链式反应管(即PCR管)中(分装前磁珠要混合均匀)，将PCR管放到冰箱里，在4℃的环境下保存待用；
取一分装好磁珠的PCR管置于磁性处理器上，1-2分钟后移除PCR管内液体；
将PCR管从磁性处理器中取出，向PCR管内加入100μL 50m mol/L乙酸钠缓冲液(pH值为4.5)，混合均匀后室温放置3-5分钟，然后把PCR管置于磁性处理器上，1-2分钟后移除PCR管内的液体，重复上述操作一次；
将PCR管从磁性处理器中取出，向PCR管内加入100μL预处理后制得的血清样品(预处理过程为：将预先保存于-80℃冰箱的胃癌患者血清样本取出10μl在冰上融化，然后向标记好的1.5ml离心管中依次加入20μLU9缓冲液(9mol/L Urea，2％CHAPS，50mmol/LTris-HCl，1％DTT，pH9.0)和10μl融化的血清样本，混匀，室温静置10min。然后再加入360μl50mmol/L乙酸钠缓冲液混匀)，混合均匀后室温放置10-15分钟；
将PCR管置于磁性处理器上，1-2分钟后移除PCR管内的液体；
将PCR管从磁性处理器中取出，向PCR管内加入100μL 50mmol/L乙酸钠缓冲液，混匀后放置3-5min，将PCR管置于磁性处理器上，1-2分钟后移除PCR管内的缓冲液，重复上述操作一次；
然后再将PCR管从磁性处理器中取出，向PCR管内加入10μL体积百分比为1％的TFA，混合均匀后室温放置5min；
接着，将PCR管置于磁性处理器上，1-2分钟后吸取5μL PCR管内的液体到另一个新的PCR管中，同时加入5μL饱和芥子酸溶液(即饱和SPA溶液)充分混匀，再吸取1μL该混合液点样到用于SELDI-TOF质谱的专用芯片上，待芯片上的溶液结晶后将该芯片放入质谱仪中进行检测，并分析分子量和相对含量。
质谱仪采用美国Ciphergen biosystems公司的PBSⅡc型号，测试前先用加有All-in-one标准蛋白质的NP20芯片校正仪器，使分子量的误差范围在0.1％内。
芯片阅读仪参数设置如下：激光强度185，检测灵敏度8，优化范围1000～15000，最高分子量50000，芯片上的每个点采集90次。用Ciphergen ProteinChip 3.2.1软件收集数据。
实施例2
以42例胃癌患者(其中Ⅰ期12例，Ⅱ期6例，Ⅲ期18例，Ⅳ期6例，男女各半)和42人性别年龄匹配的健康人群的血清作为血清样本。采用实施例1相同的方法逐一进行检测。并对测得的血清多肽谱图进行原始蛋白指纹图谱标准化处理，再采用Biomarker Wizard软件分析，在分子量2000～30000范围内共检测到75个蛋白峰，其中13个峰在胃癌组与对照健康人群组比较中有极显著差异(P＜0.001)，不同峰的丰度见表1，表1为42例胃癌患者与42例健康人群的血清蛋白差异峰。
表1
Figure BSA00000219449600051
统计学上，所有的P＜0.001.
为了进一步评价上述的13个差异峰的诊断价值，分别通过SPSS 12.0分析了上述的13个差异峰在测试组(204例胃癌患者和70人健康人群)和验证组(229例胃癌患者和50人健康人群)中ROC曲线面积，见表2。表2为13个差异峰在测试组和验证组中ROC曲线面积，表2的结果表明，在测试组和验证组中ROC曲线面积都在0.8以上的有2745、2768、6629、3402、6436m/z等5个差异峰。
ROC分析是国际公认的评价诊断方法效能的客观标准，根据Swet的评价标准，ROC曲线下面积为0.7～0.9时，表示有较好的诊断准确性，可应用在临床诊断中作为参考依据。
表2
  多肽峰(m/z)  测试组中ROC曲线面积  验证组中ROC曲线面积
  2745  0.892  0.922
  2768  0.884  0.904
  3269  0.757  0.785
  4798  0.753  0.816
  8692  0.795  0.811
  6629  0.820  0.830
  3402  0.852  0.832
  3321  0.789  0.801
  3821  0.680  0.715
  16707  0.598  0.591
  6436  0.814  0.823
  6885  0.632  0.641
  7769  0.671  0.679
进一步分析这5个差异峰在测试组和验证组中的诊断灵敏度和特异性，见表3，表3为5个差异峰在测试组和验证组中诊断灵敏度和特异性，表3的结果表明单一峰的诊断灵敏度均在62％以上，特异性均达到88％。
表3
Figure BSA00000219449600061
接着对ROC曲线面积都在0.8以上的5个差异峰对早期胃癌的诊断能力进行评价。测试组中ⅠA和ⅠB胃癌患者分别为33和22例，验证组中ⅠA和ⅠB胃癌患者分别为32和22例。2745、2768、6629、3402、6436m/z等5个差异峰在两组ⅠA和ⅠB胃癌患者中灵敏度见表4。表4为5个差异峰在Ⅰ期胃癌中诊断灵敏度，从表4中可见测试组和验证组ⅠA期诊断灵敏度均在60％以上的差异峰有2745、2768和3402m/z，其中2745m/z差异峰均在70％以上。可见2745、2768和3402m/z等3个差异峰在早期胃癌的诊断中可以作为重要的检测依据。
表4

Claims (6)

1.一种血清多肽的质谱检测方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
(1)对血清样品进行预处理；
(2)将弱阳离子交换型磁珠分装到聚合酶链式反应管中，然后将聚合酶链式反应管置于磁性处理器上，移除聚合酶链式反应管内的液体；
(3)将聚合酶链式反应管从磁性处理器中取出，向聚合酶链式反应管里加入缓冲液并混合均匀；再将聚合酶链式反应管置于磁性处理器上，移除聚合酶链式反应管内的缓冲液；所述的缓冲液为40～50mmol/L乙酸钠缓冲液，其pH为3.5～4.5；
(4)将聚合酶链式反应管从磁性处理器中取出，向聚合酶链式反应管中加入步骤(1)预处理后的血清样品，混合均匀后静置；
(5)将聚合酶链式反应管置于磁性处理器上，移除聚合酶链式反应管内的液体；
(6)将聚合酶链式反应管从磁性处理器中取出，向聚合酶链式反应管中加入所述的缓冲液并混合均匀；再将聚合酶链式反应管置于磁性处理器上，移除聚合酶链式反应管内的缓冲液；
(7)将聚合酶链式反应管从磁性处理器中取出，向聚合酶链式反应管中加入洗脱液，混合均匀后静置；所述的洗脱液为体积百分比为0.5～1％的三氟乙酸，配制所述的洗脱液所用的溶剂是色谱级水；
(8)将聚合酶链式反应管置于磁性处理器上，吸取聚合酶链式反应管内的液体；
(9)将步骤(8)中所吸取的液体与饱和芥子酸溶液混合均匀形成混合液，吸取混合液到基质辅助激光解析电离质谱的靶上，待靶上的溶液结晶后放入质谱仪中进行检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磁珠的直径为1um～1.2um。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中所述的预处理的方法如下：
将血清样本预先保存于-70℃以下，使用时，先在冰上融解后，再以体积比为1∶2的比例稀释在U9缓冲液中。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的芥子酸饱和溶液按以下方法配制：
将每10毫克芥子酸溶于300微升的乙腈和三氟乙酸的水溶液中而成，所述乙腈和三氟乙酸的水溶液中，乙腈的体积百分比为50％，三氟乙酸的体积百分比为0.5％，水为色谱级水。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的缓冲液为50mmol/L乙酸钠缓冲液，其pH为4.5。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的洗脱液为体积百分比为1％的三氟乙酸，配制所述的洗脱液所用的溶剂是色谱级水。
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