CN116183922B - 口腔鳞状细胞癌诊断模型的构建方法、标志物及其应用 - Google Patents

口腔鳞状细胞癌诊断模型的构建方法、标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

提供一种口腔鳞状细胞癌辅助诊断标志物，其由神经酰胺Cer(d28:0)、神经酰胺Cer(d30:0)、溶血磷脂酰胆碱LPC(16:0)、磷脂酰胆碱PC(40:6)和鞘磷脂SM(d34:1)组成。本发明还提供一种口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法，其包括：步骤一、获取训练病例集；步骤二、采集受试者的血清样本，对血清样本进行超高效液相色谱‑四极杆/静电场轨道阱串联高分辨质谱分析，得到患病受试者和健康受试者的多个差异脂质代谢物；步骤三、利用多元统计和受试者工作特征曲线，确定口腔鳞状细胞癌的辅助诊断模型。本发明在诊断口腔鳞状细胞癌上具有实现早期诊断、微创、准确度高的优点。

Description

口腔鳞状细胞癌诊断模型的构建方法、标志物及其应用
技术领域
本发明涉及医疗技术领域，尤其涉及一种口腔鳞状细胞癌诊断模型的构建方法、标志物及其应用。
背景技术
口腔鳞状细胞癌是头颈部常见的恶性肿瘤，占口腔癌病例的90％以上。口腔鳞状细胞癌发病隐匿、早期诊断困难，确诊主要依靠病理组织活检技术，但由于技术水平要求较高且为有创性检查，难以用于疾病的早期诊断，大多数患者就诊时已属中、晚期。其中，40％的口腔鳞状细胞癌患者确诊时已经伴有淋巴结转移。无转移的口腔鳞状细胞癌患者的5年生存率约为90％，而转移性口腔鳞状细胞癌患者的5生存率仅为40％左右。近年来，生物标志物的出现意味着一种新型的诊断模式。生物标志物是指与疾病诊断或预后过程相关的实验室指标。将生物标志物的检测结果与临床症状相结合，可以尽早做出诊断，改善患者预后。
脂质组学是一个快速发展的领域，旨在量化和全面识别脂质类别和单个脂质种类。其最终目标是揭示病理条件下脂质代谢的变化，从而发现预后或诊断生物标志物。近年来，脂质组学技术广泛应用于心血管疾病、消化系统疾病、泌尿系统疾病等诊断生物标志物的发现与鉴定，但国内关于口腔鳞状细胞癌的脂质代谢诊断生物标志物研究基本没有。
因此，如何提供更加准确高效的方法来诊断口腔鳞状细胞癌，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种口腔鳞状细胞癌辅助诊断标志物，所述辅助诊断标志物包括神经酰胺Cer(d28:0)、神经酰胺Cer(d30:0)、溶血磷脂酰胆碱LPC(16:0)、磷脂酰胆碱PC(40:6)和鞘磷脂SM(d34:1)。
本发明另一方面还提供一种口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法，其包括：
步骤一、获取训练病例集，所述训练病例集中的受试者包括患病受试者和健康受试者；
步骤二、采集所述受试者的血清样本，对所述血清样本进行超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱串联高分辨质谱分析，得到所述患病受试者和所述健康受试者的多个差异脂质代谢物；
步骤三、利用多元统计和受试者工作特征曲线，从多个所述差异脂质代谢物确定神经酰胺Cer(d28:0)、神经酰胺Cer(d30:0)、溶血磷脂酰胆碱LPC(16:0)、磷脂酰胆碱PC(40:6)、鞘磷脂SM(d34:1)作为口腔鳞状细胞癌的辅助诊断模型。
在某些实施方式中，所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中，所述辅助诊断模型的截断值为0.50。
在某些实施方式中，所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中，所述辅助诊断模型中神经酰胺Cer(d28:0)的曲线下面积为0.981，神经酰胺Cer(d30:0)的曲线下面积为0.976，溶血磷脂酰胆碱LPC(16:0)的曲线下面积为0.981，磷脂酰胆碱PC(40:6)的曲线下面积为0.981，鞘磷脂SM(d34:1)曲线下面积为0.965。
在某些实施方式中，所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中，所述多元统计包括变量权重重要性投影值、独立样本t检验和差异倍数表达。
在某些实施方式中，所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中，所述步骤二中还包括血清处理步骤，具体为：
采用甲基叔丁基醚-甲醇-水体系提取所述受试者的脂质；
制备质量控制样本。
在某些实施方式中，所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中，所述超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱串联高分辨质谱分析的条件为：
采用C18色谱柱，柱温为40℃，以异丙醇溶液为流动相B，0.1％甲酸水溶液为流动相B；采用梯度洗脱程序分离：0～2min，30％B；2～25min，30％-100％B；25～30.0min，100％B；洗脱程序的流速为为0.3mL/min。
在某些实施方式中，所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中，还包括将所述超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱串联高分辨质谱系统串联至可加热的电喷雾离子源系统中；
辅助气体温度300℃，辅助气体的流量是10μL/min；离子传输管温度为320℃；扫描范围为80.00～1200.00m/z，在Full Mass/ddms2扫描模式下，以17500的二级质谱分辨率在正离子模式和负离子模式下进行检测，梯度碰撞能量分别为20eV、40eV和60eV，在正离子模式下，喷雾电压为3.50kV，鞘气流速分别40μL/min；在负离子模式下，喷雾电压为2.80kV，鞘气流速38μL/min。
本发明另一方面还提供一种辅助诊断口腔鳞状细胞癌的应用，其利用的标志物包括神经酰胺Cer(d28:0)、神经酰胺Cer(d30:0)、溶血磷脂酰胆碱LPC(16:0)、磷脂酰胆碱PC(40:6)和鞘磷脂SM(d34:1)。
本发明另一方面还提供一种口腔鳞状细胞癌辅助诊断试剂盒，其包括神经酰胺Cer(d28:0)、神经酰胺Cer(d30:0)、溶血磷脂酰胆碱LPC(16:0)、磷脂酰胆碱PC(40:6)和鞘磷脂SM(d34:1)。
有益效果：
1.本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断标志物，该辅助诊断标志物在进行口腔鳞状细胞癌诊断时，实现早期诊断，且能够达到微创、诊断更准确的目的。
2.本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法，该诊断模型可成功发现不同样本间脂质代谢物的差异，根据ROC曲线计算约登指数，选择0.5作为区分口腔鳞状细胞癌和健康对照组的最佳截断值。该截断值被用来区分验证集中的不同组，其诊断准确性可达到100％。
附图说明
图1是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法的流程图。
图2是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中正离子模式下QC和样本的主成分分析。
图3是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中正离子模式下OPLS-DA模型得分图。
图4是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中正离子模式下200次置换实验结果。
图5是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中正离子模式下火山图。
图6是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中神经酰胺Cer(d28:0)在训练病例集中的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。
图7是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中神经酰胺Cer(d28:0)在训练病例集中口腔鳞状细胞癌和健康受试者中含量的柱形图。
图8是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中神经酰胺Cer(d30:0)在训练病例集中的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。
图9是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中神经酰胺Cer(d30:0)在训练病例集中口腔鳞状细胞癌和健康受试者中含量的柱形图。
图10是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中溶血磷脂酰胆碱LPC(16:0)在训练病例集中的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。
图11是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中溶血磷脂酰胆碱LPC(16:0)在训练病例集中口腔鳞状细胞癌和健康受试者中含量的柱形图。
图12是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中磷脂酰胆碱PC(40:6)在训练病例集中的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。
图13是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中磷脂酰胆碱PC(40:6)在训练病例集中口腔鳞状细胞癌和健康受试者中含量的柱形图。
图14是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中鞘磷脂SM(d34:1)在训练病例集中的受试者工作特征曲线、曲线下面积、95％置信区间。
图15是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法中鞘磷脂SM(d34:1)在训练病例集中口腔鳞状细胞癌和健康受试者中含量的柱形图。
图16是本发明所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型在训练病例集和验证病例集中对口腔鳞状细胞癌组和健康对照组的预测准确性。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或验证中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。关于本文中所使用的“和/或”，包括所述事物的任一或全部组合。除非另有说明，否则％指质量体积百分比。
如图1至16所示，本发明提供一种口腔鳞状细胞癌辅助诊断标志物，所述辅助诊断标志物包括神经酰胺Cer(d28:0)、神经酰胺Cer(d30:0)、溶血磷脂酰胆碱LPC(16:0)、磷脂酰胆碱PC(40:6)和鞘磷脂SM(d34:1)。
本发明另一方面还提供一种口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法，其包括：
步骤一、获取训练病例集，所述训练病例集中的受试者包括患病受试者和健康受试者；包括口腔鳞状细胞癌患者55例，健康受试者56例。
步骤二、采集所述受试者的血清样本，对所述血清样本进行超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱串联高分辨质谱分析，得到所述患病受试者和所述健康受试者的多个差异脂质代谢物；
血液样本收集于早上6：00至9：00期间，置于装有冰块的保温箱中迅速转移至实验室离心处理。在4℃条件下以3000×g离心10min，上清液(血清)保存于－80℃冰箱以备后续检测。
采用甲基叔丁基醚(methyl tert-butyl ether,MTBE)-甲醇-水体系提取脂质；将血清样品从-80℃冰箱中取出，放置室温解冻后，取80uL血清样品于4mL EP管中，加入600uL甲醇，涡旋1min，以沉淀血清样本中的蛋白质；后再加入2mL MTBE，涡旋10min，将血清样本中的脂质成分萃取至有机溶剂中；再加入500uL水涡旋5min，4℃条件下以3000×g离心10min，使有机相和水相分层，其中含有脂质的有机相位于上层。分别取上清液800uL于两个2mL离心管，于氮气下吹干，一份用于正离子检测，一份用于负离子检测。吹干后的样品重新用70uL异丙醇/乙腈(9:1体积比)的混合溶剂进行复溶，涡旋10min，使浓缩后的脂质成分充分溶解于有机溶剂中，4℃条件下以13000×g离心10min，每个样本取5uL用于质控样本的制备，其余样本转移至进样小瓶中待质谱检测。
制备质量控制样本：从每个待测样本中抽取5uL集中于1个2mL离心管中，涡旋震荡1min，样本混匀后，在4℃条件下以13000×g离心10min，取上清液于进样小瓶中待后续质谱分析。检测时首先检测6个QC样品，监测每次进样前后的压力变化和总离子流图主峰保留时间的变化。待确认仪器稳定后，开始分析样本。每检测10个样本后插入一针QC样本。在每个QC样本检测完毕后插入一针纯水溶液以避免污染其他样本。
超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱串联高分辨质谱分析(UHPLC/Q-OrbitrapHRMS分析)
从每个样本中吸取5uL，注入40℃柱温的色谱柱。色谱柱为ACQUITYCSHC18色谱柱(1.7mm×100mm，1.8μm)；流动相为(B)乙腈异丙醇溶液(乙腈：异丙醇＝1:9)，梯度洗脱，洗脱程序为0～2min(30％B)、2～25min(30％-100％B)、25～30.0min(100％B)；流速为0.3mL/min。
利用加热电喷雾离子源(Heated electrospray ionization，HESI)将高分辨质谱串联到UHPLC系统。辅助气体温度300℃，流量10μL/min；离子传输管温度为320℃。在正、负离子模式下扫描范围为80.00～1200.00m/z，喷雾电压和鞘气流速分别为3.50kV、40μL/min和2.80kV、38L/min。二级质谱分辨率为17500,质荷比窗口宽度设置为2。梯度碰撞能量分别为20eV、40eV和60eV。样本按随机数表法置于进样盘，按顺序逐个进样。
步骤三、
使用Lipid Search v4.0软件(Thermo Fisher Scientific，United States)处理从所有样品的LC-MS分析获得的原始数据，然后将每个样品的数据归一化为峰面积，并将所有关于变量的数据(包括保留时间RT和荷质比m/z)、样本编号和归一化峰强度导入SIMCA14.1软件(Umetrics，Sweden)。通过OPLS-DA分析得到各个代谢物的变量权重重要性投影值(Variable importance in projection，VIP)，对VIP＞1的脂质代谢物进行独立样本t检验，根据P值、差异倍数(fold change，FC)筛选出差异有统计学意义的差异脂质代谢物。
采用Logistic回归分析构建风险诊断模型，采用受试者工作特征曲线(ROC)来验证差异脂质代谢物及诊断模型的预测效果，并计算曲线下面积(AUC)，从多个所述差异脂质中确定神经酰胺Cer(d28:0)、神经酰胺Cer(d30:0)、溶血磷脂酰胆碱LPC(16:0)、磷脂酰胆碱PC(40:6)、鞘磷脂SM(d34:1)作为口腔鳞状细胞癌的生物标志物，并将5个生物标志物联合构成口腔鳞状细胞早期诊断模型。
采用SPSS 21.0和Excel软件进行数据分析，用Logistic回归分析构建风险诊断模型，采用受试者工作特征曲线(Receiver Operator Characteristic Curve,ROC)来验证差异脂质代谢物及诊断模型的预测效果。
将5种生物标志物联合组成OSCC的诊断模型，使用二元Logistic回归和ROC分析评估该模型的诊断效果。收集验证病例集，共包含23例口腔鳞状细胞患者和24名健康受试者，相同方法进行脂质组学分析，利用训练病例集中得到的诊断模型进行诊断，验证诊断效率。
根据ROC曲线计算Youden`s指数，约登指数最大为1，选择约登指数最大的值对应的预测概率作为最佳截断值，得到的最佳截断值为0.50，用该截断值验证验证集中的OSCC和HC，低于该截断值的样本被诊断为HC，高于该诊断值被诊断为OSCC患者。将验证病例集中47例样本使用该诊断模型进行二元logistics回归分析，使用最佳截断值进行区分，诊断准确率达到100％，23个OSCC患者和24个HC患者分别被正确诊断为OSCC和HC。
上述方案中，所述辅助诊断模型的截断值为0.50。
上述方案中，所述辅助诊断模型中神经酰胺Cer(d28:0)的曲线下面积为0.981，神经酰胺Cer(d30:0)的曲线下面积为0.976，溶血磷脂酰胆碱LPC(16:0)的曲线下面积为0.981，磷脂酰胆碱PC(40:6)的曲线下面积为0.981，鞘磷脂SM(d34:1)曲线下面积为0.965。
本发明另一方面还提供一种辅助诊断口腔鳞状细胞癌上的应用，其主要利用辅助诊断标志物由神经酰胺Cer(d28:0)、神经酰胺Cer(d30:0)、溶血磷脂酰胆碱LPC(16:0)、磷脂酰胆碱PC(40:6)和鞘磷脂SM(d34:1)组成。
本发明另一方面还提供一种口腔鳞状细胞癌辅助诊断试剂盒，其包括权利的诊断标志物由神经酰胺Cer(d28:0)、神经酰胺Cer(d30:0)、溶血磷脂酰胆碱LPC(16:0)、磷脂酰胆碱PC(40:6)和鞘磷脂SM(d34:1)组成。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

Claims (8)

1.一种标志物在制备辅助诊断口腔鳞状细胞癌试剂盒上的应用，其特征在于，所述标志物包括神经酰胺Cer(d28:0)、神经酰胺Cer(d30:0)、溶血磷脂酰胆碱LPC(16:0)、磷脂酰胆碱PC(40:6)和鞘磷脂SM(d34:1)。
2.一种口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法，其特征在于，包括：
步骤一、获取训练病例集，所述训练病例集中的受试者包括患病受试者和健康受试者；
步骤二、采集所述受试者的血清样本，对所述血清样本进行超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱串联高分辨质谱分析，得到所述患病受试者和所述健康受试者的多个差异脂质代谢物；
步骤三、利用多元统计和受试者工作特征曲线，从多个所述差异脂质代谢物确定神经酰胺Cer(d28:0)、神经酰胺Cer(d30:0)、溶血磷脂酰胆碱LPC(16:0)、磷脂酰胆碱PC(40:6)和鞘磷脂SM(d34:1)作为口腔鳞状细胞癌的辅助诊断模型。
3.根据所述权利要求2所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法，其特征在于，所述辅助诊断模型的截断值为0.50。
4.根据所述权利要求2所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法，其特征在于，包括：
所述辅助诊断模型中神经酰胺Cer(d28:0)的曲线下面积为0.981，神经酰胺Cer(d30:0)的曲线下面积为0.976，溶血磷脂酰胆碱LPC(16:0)的曲线下面积为0.981，磷脂酰胆碱PC(40:6)的曲线下面积为0.981，鞘磷脂SM(d34:1)曲线下面积为0.965。
5.根据所述权利要求2所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法，其特征在于，所述多元统计包括变量权重重要性投影值、独立样本t检验和差异倍数表达。
6.根据所述权利要求2所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法，其特征在于，包括：还包括血清处理步骤，具体为：
采用甲基叔丁基醚-甲醇-水体系提取所述受试者的脂质；
制备质量控制样本。
7.根据所述权利要求2所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法，其特征在于，包括：所述超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱串联高分辨质谱分析的条件为：
采用C18色谱柱，柱温为40℃，以异丙醇溶液为流动相B，0.1%甲酸水溶液为流动相B；采用梯度洗脱程序分离：0~2min，30%B；2~25min，30%-100%B；25~30.0min，100%B；洗脱程序的流速为为0.3mL/min。
8.根据所述权利要求6所述的口腔鳞状细胞癌辅助诊断模型构建方法，其特征在于，包括：将所述超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱串联高分辨质谱系统串联至可加热的电喷雾离子源系统中；
辅助气体温度300℃，辅助气体的流量是10μL/min；离子传输管温度为320℃；扫描范围为80.00~1200.00m/z，在Full Mass/ddms2扫描模式下，以17500的二级质谱分辨率在正离子模式和负离子模式下进行检测，梯度碰撞能量分别为20eV、40eV和60eV，在正离子模式下，喷雾电压为3.50kV，鞘气流速分别40μL/min；在负离子模式下，喷雾电压为2.80 kV，鞘气流速38 μL/min。
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