CN110286223A - 代谢标志物在肾透明细胞癌中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了代谢标志物在肾透明细胞癌中的应用，本发明通过收集肾透明细胞癌以及正常人的尿液样本，进行进行代谢组学分析，发现在不同组中呈现显著性差异的代谢物，从而利用该代谢物预测早期肾透明细胞癌，进而实现患者的个性化治疗。

Description

代谢标志物在肾透明细胞癌中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及代谢标志物在肾透明细胞癌中的应用。
背景技术
肾癌是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，包括起源于泌尿小管不同部位的各种肾细胞癌亚型。肾癌占肾脏恶性肿瘤的80％～90％。在我国泌尿系肿瘤中，肾癌发病率仅次于膀胱癌居于第二位。在世界范围内，发达国家的肾癌发病率要比发展中国家高(A.Znaor,J.Lortet-Tieulent,M.Laversanne,A.Jemal,F.Bray,Internationalvariations and trends in renal cell carcinoma incidence and mortality,European urology,67(2015)519-530)。肾癌依据形态学和分子特征主要可分为肾透明细胞癌(ccRCC，70％-85％)、乳头状肾细胞癌(pRCC，7％-15％)、嫌色细胞癌(chRCC，5％-10％)及其它少见肾癌(<10％)等。透明细胞癌是肾癌最常见的病理学类型，也是目前研究的热点。目前，临床常用的肾癌诊断方法有超声、核磁共振、动态增强CT等影像学技术，虽然极大的提高了肾癌诊断水平，但对于早期诊断的准确性仍有不足。肾癌起病隐匿，往往缺乏早期临床表现，大约30％的肾癌患者在诊断时已经发生转移，未转移的肾癌患者在进行手术切除后，还有大约40％的患者会复发(B.Ljungberg,K.Bensalah,S.Canfield,S.Dabestani,F.Hofmann,M.Hora,M.A.Kuczyk,T.Lam,L.Marconi,A.S.Merseburger,P.Mulders,T.Powles,M.Staehler,A.Volpe,A.Bex,EAU guidelines on renal cellcarcinoma:2014 update,European urology,67(2015)913-924)。早期筛查是控制癌症发展的根本。世界卫生组织提出，40％的癌症可以通过早发现，早诊断，早治疗治愈。如果能更早期发现肾癌的迹象，通过早干预、早预防等干预手段完全可以避免或延缓肾癌的发生和发展，对于提高肾癌患者的治疗效果及预后存活率具有重要的意义(J.T.Loud,J.Murphy,Cancer Screening and Early Detection in the 21(st)Century,Seminars inoncology nursing,33(2017)121-128)。因此，急需发展新的无损性肾癌早期筛查标志物。
代谢组学(metabonomics)是研究生物体系受刺激或扰动后其代谢产物一内源性代谢物质种类、数量及其变化规律的科学。生命机体在病证状态和各类药物作用下，亦同样会引起全身水平的内源性代谢物及代谢网络变化。运用代谢组学技术考察和分析这些代谢物的变化，对于探究病证本质，阐明药物作用机理有极大的助益。尿液代谢组学是通过分析尿液中的小分子代谢物，发现敏感性和特异性较强的标志物。
在本发明中，我们收集了肾透明细胞癌尿液和年龄性别相匹配的正常人的尿液，采用非靶向联合靶向代谢组方法对尿液代谢组进行定性定量分析。通过对OPLS-DA监督聚类分析，差异倍数分析和T检验分析，筛选出潜在的生物标记物，进一步数据分析发现其代谢物对肾癌组具有很好的区分，具有良好的临床应用前景。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供与肾透明细胞癌相关的代谢生物标志物，通过检测代谢生物标志物的水平，可以判断患者是否患有肾透明细胞癌，从而为肾透明细胞癌的早期诊断提供一种新的手段。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案:
本发明提供了代谢物在制备早期诊断肾透明细胞癌的产品中的应用，所述代谢物包括3-甲基壬烯二酸、石胆酰牛磺酸、皮固醇四醇-3-葡糖苷酸、单酰基酪氨酸、11-十二碳烯酸、7a-羟基-3-氧-胆酸和四氢醛固酮-3-葡糖苷酸的一种或几种。
进一步，所述代谢物还包括雄烯二酮或多巴胺-4-硫酸盐。
进一步，所述代谢物为3-甲基壬烯二酸、石胆酰牛磺酸、皮固醇四醇-3-葡糖苷酸、单酰基酪氨酸、11-十二碳烯酸、7a-羟基-3-氧-胆酸、四氢醛固酮-3-葡糖苷酸、雄烯二酮和多巴胺-4-硫酸盐的组合。
当3-甲基壬烯二酸、石胆酰牛磺酸、单酰基酪氨酸、11-十二碳烯酸、7a-羟基-3-氧-胆酸或多巴胺-4-硫酸盐在受试者的尿液中下调，或皮固醇四醇-3-葡糖苷酸、雄烯二酮或四氢醛固酮-3-葡糖苷酸在受试者的尿液中上调时，受试者患有肾透明细胞癌或者存在患肾透明细胞癌的风险。
进一步，所述产品包括检测代谢物含量的试剂。
进一步，所述试剂包括通过色谱、光谱或质谱仪/光谱法进行检测代谢物含量的试剂。
进一步，所述色谱包括GC，CE，LC，HPLC和UHPLC；光谱包括UV/Vis，IR，NIR和NMR；质谱仪/光谱法包括ESI、四极质谱仪、离子阱质谱仪、TOF(飞行时间)质谱仪、Orbitrap质谱仪、扇形磁场质谱仪、扇形静电场质谱仪、离子回旋共振(ICR)以及它们的组合，包括单级四极杆(Q)和三级四极杆((QqQ)，QqTOF，TOF-TOF，Q-Orbitrap，APCI-QqQ，APCI-QqTOF，MALDI-QqQ，MALDI-QqTOF和MALDI-TOF-TOF。优选是使用FLA-和HPLC-串联质谱法。
其中，GC＝气相色谱，CE＝毛细管电泳，LC＝液相色谱，HPLC＝高度液相色谱，UHPLC＝超高效液相色谱，UV-Vis＝紫外可见，IR＝红外，NIR＝近红外，NMR＝核磁共振，ESI＝电子喷雾电离，MALDI＝基质辅助激光解吸/电离，TOF＝飞行时间，APCI＝大气压化学电离，QqQ＝三重四极杆配置(也称为Qlq2Q3(Q1和Q3四极杆是质量过滤器，q2是无质量分辨四极杆(no mass-resolving quadrupole)))。以其最基本的水平，质谱法涉及使分子电离和随后测量所得离子的质量。由于分子以公知的方式电离，可以精确地由离子的质量确定分子的分子量。
液相色谱质谱法结合了液相色谱法(LC)或高效液相色谱法(HPLC)的物理分离能力与质谱法(MS)的质量分析能力。HPLC提供超过LC的优点，其具有分析物的较短分析时间和较好分辨率。这因此增加MS的选择性、精度和准确性。
串联质谱法涉及首先获得所关注的离子的质谱，随后破碎该离子并获得片段的质谱。串联质谱法因此提供分子量信息和破碎谱，其可一起结合分子量信息使用以识别肽或蛋白质或小分子(低于1500道尔顿)的确切序列。
优选地，如果使用质谱法，则通过参考内部代谢物标准物(standard)确定代谢物的量。任何分子离子种类(molecular ion species)的丰度通常携带关于浓度的信息，但离子丰度被许多特征混淆，包括仪器响应因子、分子的电离效率、分子离子种类的稳定性和其他可引起所关注分析物的离子抑制分子的存在。因此，已开发可以用于产生适当的校正曲线以将离子丰度转换为代谢物的量的定量测量的内部标准物。内部标准物的非限制性实例包括：标记有待定量代谢物的稳定同位素标记版本的代谢物标准物，其具有类似的提取回收率、电离响应和类似的色谱保留时间；待定量的代谢物的化合物类似物，其类似于待定量化合物、但母体质量略有不同；或待定量的代谢物的氯化版本，其通常具有类似的色谱保留时间。
在样品制备的开始时，通常在样本制备或固相萃取之前，通常以已知浓度将内部标准物添加到每个样品中，包括标准物。本领域技术人员应当理解，内部标准物的量需要高于定量的极限但足够低以避免抑制分析物的电离。基于存在于样品中的内部标准物的已知浓度，可以通过将代谢物和内部标准物之间的响应比(response ratio)内插到标准曲线来定量所关注代谢物的测量值。
优选地，内部代谢物标准物是稳定同位素标记的标准物。如已知的，同位素的背景下的稳定是指，该同位素是非放射性的，即它们不自发衰减。用(a)稳定同位素标记的代谢物标准物是待定量的代谢物的稳定同位素标记的版本，并且是本领域中公知的。通常，所采用的同位素是碳、氮或氢的稳定同位素，如12C和13C、14N和15N以及2H(氘)。
本发明提供了一种诊断肾透明细胞癌的产品，所述产品包括检测代谢物水平的试剂，所述代谢物包括3-甲基壬烯二酸、石胆酰牛磺酸、皮固醇四醇-3-葡糖苷酸、单酰基酪氨酸、11-十二碳烯酸、7a-羟基-3-氧-胆酸和四氢醛固酮-3-葡糖苷酸的一种或几种。
进一步，所述代谢物还包括雄烯二酮或多巴胺-4-硫酸盐。
进一步，所述代谢物为3-甲基壬烯二酸、石胆酰牛磺酸、皮固醇四醇-3-葡糖苷酸、单酰基酪氨酸、11-十二碳烯酸、7a-羟基-3-氧-胆酸和四氢醛固酮-3-葡糖苷酸和雄烯二酮或多巴胺-4-硫酸盐的组合。
进一步，所述试剂包括采用色谱、光谱或质谱仪/光谱法检测代谢物的含量的试剂。
进一步，所述色谱包括GC，CE,LC,HPLC和UHPLC；光谱包括UV/Vis，IR，NIR和NMR；质谱仪/光谱法包括ESI、四极质谱仪、离子阱质谱仪、TOF(飞行时间)质谱仪、Orbitrap质谱仪、扇形磁场质谱仪、扇形静电场质谱仪、离子回旋共振(ICR)以及它们的组合，包括单级四极杆(Q)和三级四极杆((QqQ)，QqTOF，TOF-TOF，Q-Orbitrap，APCI-QqQ，APCI-QqTOF，MALDI-QqQ，MALDI-QqTOF和MALDI-TOF-TOF。
本发明提供了代谢物在构建预测肾透明细胞癌的计算模型中的应用，所述代谢物包括3-甲基壬烯二酸、石胆酰牛磺酸、皮固醇四醇-3-葡糖苷酸、单酰基酪氨酸、11-十二碳烯酸、7a-羟基-3-氧-胆酸和四氢醛固酮-3-葡糖苷酸的一种或几种。
进一步，所述代谢物还包括雄烯二酮或多巴胺-4-硫酸盐。
进一步，所述代谢物为3-甲基壬烯二酸、石胆酰牛磺酸、皮固醇四醇-3-葡糖苷酸、单酰基酪氨酸、11-十二碳烯酸、7a-羟基-3-氧-胆酸和四氢醛固酮-3-葡糖苷酸和雄烯二酮或多巴胺-4-硫酸盐的组合。
本发明使用的术语“代谢物标志物”或短的“代谢标志物”被定义为适合作为肾透明细胞癌存在和状态的指标化合物，这种化合物是哺乳动物体内的代谢过程中出现的代谢物或代谢化合物。“代谢物标志物”或“代谢标志物”通常在本发明的上下文中同义使用，并且通常是指一种代谢物的量或两种或更多种代谢物的含量或比率。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了与肾透明细胞癌相关的代谢物标志物，通过检测代谢物标志物的含量，可以在判断受试者是否患有肾透明细胞癌以及患肾透明细胞癌的风险，以期实现癌症早期的诊断，从而在癌症早期进行干预治疗，提高患者的生存质量。
附图说明
图1是肾透明细胞癌和对照组尿液代谢谱PCA分类图，其中Δ代表肾透明细胞癌，○代表对照；
图2是肾透明细胞癌和对照组尿液代谢谱OPLS-DA分类图，其中Δ代表肾透明细胞癌，○代表对照；
图3是九种代谢物组合预测实验组样本的ROC曲线图；
图4是九种代谢物联合区分验证肾透明细胞癌样本的概率图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例1与肾透明细胞癌相关的代谢物的筛选
1、材料与试剂
1)仪器：Waters H-class液相色谱仪(waters公司)；LTQ-Orbitrap velos pro质谱仪(Thermofisher Scientific公司)。
2)主要试剂：乙腈(Thermofisher Scientific公司)；C18反相色谱柱(3.0mm×100mm,C18,1.7μm,Waters公司)。
3)样本：67例肾透明细胞癌患者的尿液和96例年龄、性别匹配的正常对照组的尿液，来自北京协和医院。
2、实验方法
2.1样品收集
收集空腹晨尿，5000g的转速离心30min，去除沉淀。
2.2代谢物的提取
取200μl尿液上清，加200μl乙腈，涡旋，4℃静置30min,14000g离心10min，取上清,离心浓缩，用200μl 2％乙腈水复溶，14000g离心10min，过10kD滤膜后取10μl进样。
2.3液相分析
色谱柱：waters BEH C18(3.0X100mm,1.7μm),柱温50℃；流动相A为0.1％甲酸水，流动相为乙腈；分析梯度为：0-1min，2％B；1-8min,2％B-98％B；8-8.1min，98％B-100％B；8.1-12min，100％B；12-12.1min，100％-2％B；12.1-17min，2％B；流速为0.5ml/min；进样体积为10μl。
2.4质谱分析
UPLC质谱串联LTQ-Orbitrap velos(Thermo Fisher Scientific,SanJose,CA,USA)质谱，采用电喷雾离子源正离子模式；鞘气为氮气和辅助气，流速分别为45 arbitraryunits and 10 arbitrary units；质谱扫描范围为100–1000m/z；spray voltages设为4.2KV；离子传输管温度350℃。数据采用高分辨傅里叶转换模式(FT)获取，一级分辨率为60000；二级分辨率为15000。
2.5质谱数据分析
由UPLC-LTQ orbitrap获得的原始数据，采用Waters公司的商业组学分析软件progenesis QI(Version 2.0,Nonlinear Dynamics,UK)进行处理。该软件可自动完成峰对齐，峰识别和峰校正等前处理程序，最终输出三维矩阵，即由保留时间和精确质荷比组成的谱峰索引变量、样本名称和峰强度/面积组成。获得的数据矩阵导入多变量统计软件SIMCA-P software 14.0(Umetrics AB,Umea,Sweden)进行PCA分析，可视化组间变化趋势。组间差异变量通过OPLS-DA模型获取的VIP值进行筛选，VIP值大于1，非参检验p值小于0.05的变量认为是组间显著性差异变量，筛选为透明肾细胞癌早期潜在标志物。对筛选的差异变量进行二级碎裂，采用HCD(High collision dissociation)碎裂方式，根据具体代谢物选择20,40,60eV能量。将二级碎片采用progenesis QI软件进行解卷积，搜索HMDB(HUMANMETABOLOME DATABASE)数据库，确定差异代谢物结构，以HMDB数据库编号表示。
通过逻辑回归算法优化筛选出的存在差异变量的代谢物，采用ROC曲线法以及计算曲线下面积(AUC)以评价有意义的影响因素对肾透明细胞癌的诊断价值。
3、结果
非监督PCA得分图显示(图1)透明肾细胞癌组和对照组呈现出一定的区分度。进一步采用监督OPLS-DA构建模型(图2)，两组区分度更加明显。通过生物信息学分析，发现以下9个代谢具有较好的预测价值，AUC值大于0.7，9个代谢物联合应用达到较高的预测价值(AUC＝0.905)(图3)，差异代谢物含量信息如表1所示。
表1差异代谢物含量信息
实施例2肾透明细胞癌患者的诊断
1、样品收集
收集33例透明肾细胞癌和33例正常人尿液。
2、代谢物的提取具体步骤同时实例1
3、液相色谱-高分辨质谱检测代谢物及分析
检测步骤同实施例1，采用ROC曲线评估表1中的九种代谢物对透明肾细胞癌的预测效果，结果显示联合预测的AUC值为0.885，可从33例透明肾细胞癌样本中准确预测26例(图4)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.代谢物在制备早期诊断肾透明细胞癌的产品中的应用，其特征在于，所述代谢物包括3-甲基壬烯二酸、石胆酰牛磺酸、皮固醇四醇-3-葡糖苷酸、单酰基酪氨酸、11-十二碳烯酸、7a-羟基-3-氧-胆酸和四氢醛固酮-3-葡糖苷酸的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述代谢物还包括雄烯二酮或多巴胺-4-硫酸盐。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述代谢物为3-甲基壬烯二酸、石胆酰牛磺酸、皮固醇四醇-3-葡糖苷酸、单酰基酪氨酸、11-十二碳烯酸、7a-羟基-3-氧-胆酸、四氢醛固酮-3-葡糖苷酸、雄烯二酮和多巴胺-4-硫酸盐的组合。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括检测代谢物含量的试剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过色谱、光谱或质谱仪/光谱法进行检测代谢物含量的试剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述色谱包括GC，CE,LC,HPLC和UHPLC；光谱包括UV/Vis，IR，NIR和NMR；质谱仪/光谱法包括ESI、四极质谱仪、离子阱质谱仪、TOF(飞行时间)质谱仪、Orbitrap质谱仪、扇形磁场质谱仪、扇形静电场质谱仪、离子回旋共振(ICR)以及它们的组合，包括单级四极杆(Q)和三级四极杆((QqQ)，QqTOF，TOF-TOF，Q-Orbitrap，APCI-QqQ，APCI-QqTOF，MALDI-QqQ，MALDI-QqTOF和MALDI-TOF-TOF。
7.一种诊断肾透明细胞癌的产品，其特征在于，所述产品包括检测权利要求1或2中所述的代谢物的试剂。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述试剂包括采用色谱、光谱或质谱仪/光谱法检测代谢物的含量的试剂。
9.代谢物标在构建预测肾透明细胞癌的计算模型中的应用，其特征在于，所述代谢物包括3-甲基壬烯二酸、石胆酰牛磺酸、皮固醇四醇-3-葡糖苷酸、单酰基酪氨酸、11-十二碳烯酸、7a-羟基-3-氧-胆酸和四氢醛固酮-3-葡糖苷酸的一种或几种。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述代谢物还包括雄烯二酮或多巴胺-4-硫酸盐。
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