CN109725072A - 一种基于lc-ms/ms技术的筛查癌症生物标志物的靶向定性定量代谢组学分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种基于液相色谱—质谱联用技术的用于筛查癌症生物标志物的靶向定性定量代谢组学技术分析方法。其特征在于该方法充分利用高效液相‑串联质谱的多反应监测定量功能，预测多反应监测‑信息依赖采集‑增强型子离子检测对相关代谢物的结构预测功能以及高分辨质谱的结构鉴定功能，建立了一种适用于筛查各种类型癌症其生物标志物的分析方法。本方法具有高通量、稳定性好、适用性强的优点，提高了代谢组学生物标志物筛查与发现的灵敏度和准确性。

Description

一种基于LC-MS/MS技术的筛查癌症生物标志物的靶向定性定 量代谢组学分析方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种基于液相色谱—质谱分析技术的代谢组学生物标志物筛查与发现的方法。

背景技术

近年来，基于代谢组学的恶性肿瘤研究备受关注，并且发现了许多与肺癌、食管癌、前列腺癌、大肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌等恶性疾病早期诊断、疗效评价密切相关的可能小分子生物标志物。目前，小分子生物标志物的发现主要采用非靶向代谢组学的方法，然而，由于研究目的和技术手段的限制，非靶向代谢组学也存在一些不足，如：仅使用峰面积或响应强度来表征代谢物的变化缺乏准确定量，限制了各实验室之间数据的比较、整合和临床指标的界定；质谱全扫描的采集方式导致一些低含量代谢物信息缺失；标准品和标准数据库的缺乏导致未知代谢物结构难以鉴定等等，这些问题都制约了寻找可能生物标志物的准确性和可靠性。

针对这些问题，本研究基于生物代谢转化的思路，在非靶向代谢组学已发现的大量可能生物标志物的基础上，采用高效液相-串联质谱联用(LC-MS/MS)技术，开展了针对癌症生物标志物筛查的靶向定性定量代谢组学新方法研究，旨在获得全面、完整的代谢通路变化信息，发现并准确定量与癌症诊断密切相关的可能生物标志物，建立适合于血浆中癌症生物标志物筛查的靶向定性定量代谢组学分析方法。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种用于癌症生物标志物筛查的基于液相色谱—质谱技术的靶向定性定量代谢组学分析新方法。

为解决本发明的技术问题，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了血浆中癌症标志物筛查的靶向定性定量分析方法，包括如下步骤：

1)选择核心代谢物进行靶向定量分析，确定核心代谢物的虚拟次级代谢物；

2)通过预测多反应监测-信息依赖采集-增强型子离子检测(pMRM-IDA-EPI) 方法，获取虚拟次级代谢物的质谱二级信息，确定核心代谢物的虚拟次级代谢物中真实存在的次级代谢物；

3)针对核心代谢物和其真实存在的次级代谢物，对其进行定量分析，结合多变量统计分析，进行最终肿瘤标志物的确定。

其中，在1)中所述的核心代谢物选自血浆、组织等复杂生物样本中与恶性肿瘤密切相关的重要代谢物。在1)中所述的核心代谢物包括氨基酸及其衍生物类、核苷酸类、有机酸类、肉碱类、脂类等内源性代谢物。在1)中所述的靶向定量分析采用液相质谱联用正、负离子模式下分时段多反应监测 (Schedule-MRM)质谱扫描以及同位素内标绝对定量；其中，分时段多反应监测(Schedule-MRM)指在待测物保留时间附近对代谢物的母离子和子离子同时进行扫描监测，这样就会大大减少噪音的干扰，提高检测的灵敏度。

在1)中所述的虚拟次级代谢物是指核心代谢物经过一系列的生物转化途径可以生成的已知的或者未知的代谢物，这些代谢转化途径包括下表总结的Ⅰ相和II相代谢方式，

其中，在2)中所述的预测多反应监测-信息依赖采集-增强型子离子检测 (pMRM-IDA-EPI)方法，为预测多反应监测-信息依赖采集-增强型子离子扫描方法，其对虚拟次级代谢物，通过多反应监测模式对其母离子和子离子进行同时检测，并同时获取其二级质谱图；在2)中所述的真实存在的次级代谢物，是通过解析二级质谱图，分析虚拟次级代谢物的高分辨一级和二级质谱数据与其化学结构的匹配程度，最终确认的真实存在的次级代谢物。

其中，在3)中所述的定量分析是指液相质谱联用正、负离子模式下分时段多反应监测(Schedule-MRM)质谱扫描，采用同位素内标法对核心代谢物及相关的次级代谢物进行同时定量分析，得到定量数据；在3)中所述的肿瘤标志物的确定是将上述的定量数据导入多变量统计软件进行数据分析，筛选出对分组贡献较大的变量，以及在两组中有显著性变化的差异代谢物，确定最终的肿瘤标志物。

附图说明

图1为与癌症相关的核心代谢物和次级代谢物在血浆中的总离子流色谱图。

图2为健康组与小细胞肺癌组血浆样本的正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)模型得分图(▲健康组；■小细胞肺癌组)。

图3为191个与食管癌相关的核心代谢物和次级代谢物在血浆中的提取离子流色谱图。(A)正离子检测模式；(B)负离子检测模式。

具体实施方式

下述实施例，便于本领域的技术人员更好地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1

1.建立血浆中106个核心代谢物的液相色谱—质谱联用的定量分析方法，具体的样品前处理条件及测定条件为：

(1)样品前处理：冻存的血浆样本在4℃条件下解冻，并在冰上涡旋混匀。精密吸取血浆100μL，加入标准品混合溶液20μL，混合内标10μL，涡旋混匀。再加冷藏乙腈300μL，3000rpm涡旋240s，4℃ 10000r/min离心10min，分取上清液，并将其离心浓缩2小时，加入100μL乙腈：水(3:7，V/V)溶液复溶，3000rpm涡旋 240s，10000r/min离心10min，分取上清液，经96孔板过滤后进样。

(2)所述的混合内标液按照以下方法制备得到：分别准确称取1.0mg的同位素内标品，得到浓度为1mg/mL的同位素内标溶液，然后取不同的体积，配制成混合内标液。其中，L-酪氨酸-苯基-3,5-d₂的浓度为2μg/mL，L-色氨酸-d₅(吲哚-d₅)的浓度为2μg/mL，L-甲硫氨酸-甲基-¹³C,d₃的浓度为2μg/mL，甘氨胆酸-2,2,4,4-d₄的浓度为2μg/mL，尿嘧啶核苷-¹⁵N₂的浓度为4μg/mL，雄烯二酮-2,3,4-¹³C₃的浓度为2 μg/mL，琥珀酸-2,2,3,3-d₄的浓度为8μg/mL，7-甲基黄嘌呤-2,4,5,6-¹³C₄,1,3,9-¹⁵N₃的浓度为2μg/mL。

(3)液相色谱条件：Waters ACQUITY UPLC系统(美国Waters公司)PhenomenexSynergi Hydro-RP色谱柱(4μm，2mm×250mm)，流动相A：0.1％v/v甲酸水溶液；流动相B：乙腈；洗脱梯度为0-9min，0％-10％B，9-15min，10％-100％B，15-22 min，100％B，流速0.2mL/min。柱温为25℃；进样量：2μL。

(4)质谱条件：QTRAP^TM四级杆-线性离子肼串联质谱仪(美国AB SCIEX公司)。所述的质谱检测条件为：电喷雾电离源，分别采用分时段多反应监测正、负离子扫描模式，正离子模式下：雾化气(GAS1)为55，干燥气(GAS2)为40，喷雾电压5.5kV，离子源温度为500℃。负离子模式下：雾化气(GAS1)为70，干燥气(GAS2)为60，喷雾电压-4.5kV，离子源温度为400℃。各个核心代谢物的定量离子对、解簇电压(DP)、碰撞能量(CE)见表1

表1.核心代谢物MRM检测的质谱条件

2.采用预测多反应监测-信息依赖采集-增强型子离子检测(pMRM-IDA-EPI)的方法筛选次级代谢物，具体测定步骤及条件如下：

(1)次级代谢物预测：以核心代谢物作为初级代谢物，按照以下两种方式来分析推断其可能的次级代谢产物：1)对常见的Ⅰ相和II相代谢方式进行总结(如表2 所示)，推测每个核心代谢物可能存在的Ⅰ相和II相代谢产物；2)通过KEGG数据库中的代谢通路，总结出其可能的初级代谢产物。

表2.Ⅰ相和II相代谢转化方式总结

(2)次级代谢物筛选：根据初级代谢物的离子对信息，根据次级代谢物与初级代谢物的结构同源性、裂解相似性的特点，设定其次级代谢产物可能的离子对，并进行预测多反应监测-信息依赖采集-增强型子离子(pMRM-IDA-EPI)谱分析。根据采集到的MS/MS谱、MRM谱、保留时间等检测数据与代谢物的结构是否匹配来初步筛选次级代谢产物。按照该方法初步获得了284个可能来源于核心代谢物的次级代谢物。

预测多反应监测-信息依赖采集-增强型子离子(pMRM-IDA-EPI)扫描模式采集条件：多反应监测的设置：第一个四极杆、第三个四极杆的分辨率分别为低、中，扫描模式为轮廓(profile)，步长为0.12道尔顿，扫描速率为4000道尔顿/秒。每个离子对采样时间为10ms。信息依赖采集的设置：离子强度超过2000cps的离子进一步进行子离子扫描。增强型子离子扫描的设置：碰撞能量范围(CEs)为25±5 电子伏。扫描模式为轮廓(profile)，步长为0.12道尔顿，第一个四极杆分辨率为低。

(3)次级代谢物的最终确认：为了保证次级代谢产物相对定量分析结果的可靠性，采用建立的定量分析方法对筛选出的次级代谢产物进行精密度和稳定性考察，确定最终的234个次级代谢物(表3)。

表3.234个次级代谢物的液相保留时间和质谱检测条件

3.血浆中核心代谢物及次级代谢物的定量检测及癌症生物标志物的筛查：

采用建立的定量方法对血浆中106个癌症相关的核心代谢物及其234个次级代谢产物进行了定量分析。同位素内标法定量，对于核心代谢物，以标准品与内标的峰面积之比为因变量，标准品的浓度为自变量，建立标准曲线，并由此计算出其在血浆中的绝对含量；对于次级代谢物，以其峰面积与内标峰面积的比值计算相对含量。

将液相串联质谱联用靶向分析获得的原始数据输入Multiquant 3.0.2(AppliedBiosytems)软件进行处理。由此获得的数据形成二维数据阵(列为样本，行为代谢物)，导入多变量统计软件SIMCA-P Software 14(Umetrics AB，Umet，Sweden)进行数据分析。数据分析时首先进行了中心化及单位方差标度化(UV scaling)，再分别采用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)对数据进行离群样本判断、聚类以及模型的判别分析，为了验证模型的可靠性，避免发生过度拟合，采用偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)进行了交叉验证。筛选正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)分析中VIP>1的变量，通过软件SPSS 16.0进行两个独立样本的均值t检验，进一步筛选有显著差异的变量。

(1)肺癌患者的血浆样本收集

血浆样本来自20例经病理诊断为小细胞肺癌的患者(SCLC组)和20例健康志愿者(NC组)，由中国医学科学院肿瘤医院/肿瘤研究所按照预先的实验设计，依据规范、合理的操作流程采集提供。采集后的样品立即4000rpm离心制备血浆，冻存于-80℃冰箱。

(2)靶向定性定量分析方法

2.1血浆样本处理

冻存的血浆样本在4℃条件下解冻，并在冰上涡旋混匀。精密吸取血浆100μL，加入内标10μL，加冷藏乙腈300μL，3000rpm涡旋240s，4℃ 10000r/min离心10 min，分取上清液，并将其离心浓缩2小时，加入100μL乙腈：水(3:7，V/V)溶液复溶，3000rpm涡旋240s，10000r/min离心10min，分取上清液，经96孔板过滤后进样。

2.2数据处理及生物标志物筛选

将液相串联质谱联用靶向分析获得的原始数据输入Multiquant 3.0.2(AppliedBiosytems)软件进行处理。由此获得的数据形成二维数据阵(列为样本，行为代谢物)，导入多变量统计软件SIMCA-P Software 14(Umetrics AB，Umet，Sweden) 进行数据分析，再分别采用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析 (OPLS-DA)对数据进行离群样本判断、聚类以及模型的判别分析，为了验证模型的可靠性，避免发生过度拟合，采用偏最小二乘法判别分析进行了交叉验证。从图2可知SCLC组与NC组血浆样本之间分组明显，据此建立的正交偏最小二乘法判别分析模型可以解释健康组与小细胞癌患者组之间99.0％的差异(R2(Y))。经过交叉有效性验证后的平均预测能力为93.5％(Q2(cum))。然后筛选正交偏最小二乘法判别分析中VIP>1的变量，通过软件SPSS 16.0进行两个独立样本的均值t 检验，进一步筛选有显著差异的变量，最终获得了78个具有显著性差异的代谢物，其中38个为核心代谢物，40个属于次级代谢产物。

2.3生物标志物结构鉴定

由于预测的次级代谢物的结构已知，可通过其高分辨质谱及二级谱图与已知结构的匹配性，并结合以下数据库进行检索：METLIN(http://metlin.scripps.edu/)， HMDB(http://hmdb.ca/)，对次级代谢物进行结构鉴定。

对血浆中发现的其它有显著性差异的次级代谢物进行结构解析，共鉴定出14 个次级代谢物的结构。即从20例小细胞癌血浆样本中发现了78个可能生物标志物，已确认了52个可能生物标志物的结构，具体信息如表4所示。

表4.健康组与小细胞肺癌组之间的差异代谢物

^a代谢物的结构由质谱裂解和精确质量数推测获得；

^b代谢物结构已经数据库确认；

实施例2：

通过本实验室前期对食管癌动物模型的血浆代谢组学研究，寻找到了61个与大鼠食管癌相关的小分子代谢物，在本研究中将其称为核心代谢物。为了将该研究结果拓展应用至临床样本检测，同时克服大鼠与人之间的种属差异导致的代谢物信息缺失，采用了本发明的技术方案，建立适合临床血浆生物标志物筛查的靶向定性定量代谢组学分析方法。

1.建立临床血浆中核心代谢物的液相色谱-质谱联用的半定量分析方法，具体的样品前处理条件及测定条件为：

(1)样品前处理：冻存的血浆样本在4℃条件下解冻。并在冰上涡旋混匀。精密吸取血浆100μL，4℃冷藏乙腈300μL，2500rpm涡旋300s，4℃10000rpm离心5min，分取上清液，并将其离心浓缩至干，加入100μL乙腈：水(2:98，V/V)含内标溶液复溶，2500rpm涡旋300s，4℃10000rpm离心5min，分取上清液，经96孔板过滤后进样分析。

(2)所述的含有内标的复溶液按照以下方法制备得到：分别准确称取1.0mg的同位素内标品，得到浓度为1.0mg/mL的同位素内标溶液，然后去不同的体积，配制含有内标的复溶液。其中DL-缬氨酸-d8的浓度为5μg/mL，L-色氨酸-d5(吲哚-d5)的浓度为2μg/mL，琥珀酸-2,2,3,3-d4的浓度为5μg/mL。

(3)液相色谱条件：Waters ACQUITY UPLC系统(美国Waters公司)，ACQUITY UPLCHss T3色谱柱(2.1×100mm，1.8μm；Waters Corporation，USA)，流动相A： 0.1％v/v甲酸水溶液；流动相B：甲醇；正离子检测模式下洗脱梯度为0-6min， 2％-20％B，6-10min，20％-100％B，10-17min，100％B，；负离子检测模式下洗脱梯度为0-4min，2％-100％B，4-12min，100％B。柱温为35℃；进样量：5μL。

(4)质谱条件：QTRAPTM四级杆-线性离子肼串联质谱仪(美国AB SCIEX公司)。所述的质谱检测条件为：电喷雾电离源，分别采用分时段多反应监测 (Schedule-MRM)正、负离子扫描模式，，正离子模式下：雾化气(GAS1)为 50，干燥气(GAS2)为40，喷雾电压5.0kV，离子源温度为500℃。负离子模式下：雾化气(GAS1)为60，干燥气(GAS2)为50，喷雾电压-4.5kV，离子源温度为450℃。各个代谢物的定量离子对、解簇电压(DP)、碰撞能量(CE)见表5。如表1，由于大鼠与人的种属差异，在临床血浆仅能检测到61个大鼠血浆中发现的核心代谢物中的36个。

表5.与食管癌相关的核心代谢物的液相保留时间和质谱检测方法

2.采用预测多反应监测-信息依赖采集-增强型子离子检测(pMRM-IDA-EPI)的方法筛选次级代谢物，具体测定步骤及条件如下：

(1)次级代谢物预测：以核心代谢物作为初级代谢物，按照以下两种方式来分析推断其可能的次级代谢产物：1)对常见的代谢转化进行总结(如表2所示)，推测每个核心代谢物可能存在的次级代谢产物；2)通过KEGG数据库中的代谢通路，总结出其可能的次级代谢产物。

表6.代谢转化方式总结

(2)次级代谢物筛选：根据次级代谢物与初级代谢物的结构同源性、裂解相似性的特点，一方面采用预测多反应监测(pMRM)预测核心代谢物发生上述15 种生物转化后可能产生的次级代谢物，另一方面，结合通用的质谱裂解规律，推测由KEGG中代谢通路上已知次级代谢产物的可能的特征子离子。设定其次级代谢产物可能的离子对，并进行多反应监测离子对筛查与预测多反应监测-信息依赖采集-增强型子离子检测验证。根据采集到的多反应监测谱、二级谱、保留时间等检测数据与代谢物的结构是否匹配来筛选次级代谢产物。多反应监测-信息依赖采集- 增强型子离子(MRM-IDA-EPI)扫描模式采集条件：多反应监测的设置：第一个四极杆、第三个四极杆的分辨率分别为低、中，扫描模式为轮廓(profile)，步长为0.12道尔顿，扫描速率为4000道尔顿/秒。每个离子对采样时间为20ms。信息依赖采集的设置：离子强度超过1000cps的离子进一步进行子离子扫描。增强型子离子扫描的设置：碰撞能量范围(CEs)为30±15电子伏。扫描模式为轮廓(profile)，步长为0.12道尔顿，第一个四极杆分辨率为低。

(3)次级代谢物的最终确认：通过上述的次级代谢产物的筛查和验证，本研究中最终确认了155个可能来源于核心代谢物的次级代谢物，结合36个初级代谢产物，建立了针对191个代谢物的超高效液相-串联质谱联用的多反应监测模式分析方法。各个代谢物的离子对、解簇电压(DP)、碰撞能量(CE)见表7。提取离子流色谱图如图3。

表7.与食管癌相关的核心代谢物和次级代谢产物的质谱检测方法

3.实际临床血浆中核心代谢物及次级代谢物的靶向检测及癌症生物标志物的筛查：

(1)食管癌患者血浆的收集

146例食管癌患者(62±7.49)和150健康志愿者(63±5.08)的空腹血浆由中国医学科学院肿瘤医院收集。患者组中，男性患者与女性患者的人数比为2.4；男性健康志愿者与女性健康志愿者的人数比2.6。本研究中，将病理诊断为Ⅰ、II期的样本合并，命名为早期组；将Ⅲ、Ⅳ期的样本合并，命名为晚期组(依据国际抗癌联盟2009年第七版食管癌病理分期标准)。血液样本用乙二胺四乙酸二钾 (EDTA-K2)抗凝管收集，直接放置在4℃。2h内将样品放在1,000×g，4℃条件下离心10min，分离出上清，保存在-80℃，临用前取出复溶。

(2)血浆样本处理

所有超低温保存的样本先在4℃的条件下解冻并进行混悬。每份样品精密吸取100μL，加入300μL冷藏乙腈(4℃)，2500rpm涡旋300s，4℃10000rpm离心5min，分取上清液，并将其离心浓缩至干。加入100μL乙腈：水(2:98，V/V) 溶液复溶(内含5μg/mL的DL-缬氨酸-d8、2μg/mL L-色氨酸-d5(吲哚-d5)、5μg/mL 的琥珀酸-2,2,3,3-d4)，2500rpm涡旋300s，10000rpm，4℃离心5min，分取上清液，经96孔板过滤后进样分析。

(3)数据处理及生物标志物的筛选

将靶向分析的原始数据导入MultiQuant 3.0.2(Applied Biosytems)软件，对各代谢物的色谱峰进行积分，由此获得二维数据阵(行为代谢物，列为样本)。以其色谱峰面积/内标峰面积为指标，对不同组之间进行两组独立样本的T检验，置信水平设置在0.05。最终，获得了76个在癌症组和健康组中具有显著性差异的代谢物。其中16个为核心代谢物，60个次级代谢物。

(4)生物标志物的结构鉴定

本研究中，通过高分辨的一级质谱、二级质谱图与已知结构的匹配，并结合以下数据库进行检索：METLIN(http://metlin.scripps.edu/)，HMDB(http://hmdb.ca/)，对次级代谢物进行结构鉴定。

采用上述方法对76个代谢物差异代谢物进行结构鉴定，共鉴定出46个，其中核心代谢物10个，次级代谢物36个。具体信息如表8。

表8.食管癌患者与健康者之间的差异代谢物

*,**,and***分别表明t检验置信区间水平分别为<0.05,<0.01和<0.001。

Claims (8)

1.一种基于高效液相-串联质谱联用(LC-MS/MS)技术的筛查肿瘤生物标志物的靶向定性定量代谢组学分析方法，其特征在于：

1)选择核心代谢物进行靶向定量分析，确定核心代谢物的虚拟次级代谢物；

2)通过预测多反应监测-信息依赖采集-增强型子离子检测(Predicted MultipleReaction Monitoring-information Dependent Acquiring-enhanced Product Ion,pMRM-IDA-EPI)方法，获取虚拟次级代谢物的质谱二级信息，确定核心代谢物的虚拟次级代谢物中真实存在的次级代谢物；

3)针对核心代谢物和其真实存在的次级代谢物，对其进行定量分析，结合多变量统计分析，进行最终肿瘤标志物的确定。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，在1)中所述的核心代谢物选自血浆中与恶性肿瘤密切相关的重要代谢物。

3.根据权利要求1的方法，其特征在于，在1)中所述的核心代谢物包括但不限于氨基酸及其衍生物类、核苷酸类、有机酸类、肉碱类。

4.根据权利要求1的方法，其特征在于，在1)中所述的靶向定量分析采用液相质谱联用正、负离子模式下分时段多反应监测(Schedule-MRM)质谱扫描以及同位素内标绝对定量。

5.根据权利要求4的方法，其特征在于，分时段多反应监测(Schedule-MRM)指在待测物保留时间附近对代谢物的母离子和子离子同时进行扫描监测，这样就会大大减少噪音的干扰，提高检测的灵敏度。

6.根据权利要求1的方法，其特征在于，在1)中所述的虚拟次级代谢物是指核心代谢物经过一系列的生物转化途径可以生成的已知的或者未知的代谢物，这些代谢转化途径包括下表总结的Ⅰ相和II相代谢方式，

7.根据权利要求1的方法，其特征在于，在2)中所述的预测多反应监测-信息依赖采集-增强型子离子检测(pMRM-IDA-EPI)方法，为预测多反应监测-信息依赖采集-增强型子离子扫描方法，其对虚拟次级代谢物，通过多反应监测模式对其母离子和子离子进行同时检测，并同时获取其二级质谱图；在2)中所述的真实存在的次级代谢物，是通过解析二级质谱图，分析虚拟次级代谢物的高分辨一级和二级质谱数据与其化学结构的匹配程度，最终确认的真实存在的次级代谢物。

8.根据权利要求1的方法，其特征在于，在3)中所述的定量分析是指液相质谱联用正、负离子模式下分时段多反应监测(Schedule-MRM)质谱扫描，采用同位素内标法对核心代谢物及相关的次级代谢物进行同时定量分析，得到定量数据；在3)中所述的肿瘤标志物的确定是将上述的定量数据导入多变量统计软件进行数据分析，筛选出对分组贡献较大的变量，以及在两组中有显著性变化的差异代谢物，确定最终的肿瘤标志物。