CN111272888A - 一种新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法,预处理方法为将血液样品自然晾干制成干血斑,将干血斑放入96孔板过滤机中加入萃取液进行离心过滤,96孔板的内部放置聚四氟乙烯薄膜。聚四氟乙烯薄膜的孔径为0.22‑0.45μm。96孔板过滤机的转速为小于等于3000r/min。本发明的预处理方法不仅具有对干血斑的萃取液极好的通透性,而且过滤干净,基本没有杂质,峰型稳定,检测结果准确性好。
Description
技术领域
本发明属于氨基酸肉碱检测领域,具体涉及一种新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
遗传性代谢病(inborn error of metabolism,IEM)是一类涉及氨基酸、有机酸、脂肪酸、尿素循环、碳水化合物、类固醇等多种物质代谢的疾病。其种类繁多,是儿科临床的疑难杂症。虽然其单一病种患病率较低,但总体发病率较高,对人口素质、家庭乃至社会的发展构成了极大的威胁。
新生儿筛查是指在新生儿期通过对某些危害严重的遗传代谢缺陷、先天性疾病进行群体筛查,早期诊治,从而避免或减轻疾病的危害。LC-MS/MS技术的发展使得类似苯丙酮尿症这类遗传代谢疾病在发病前进行干预成为可能。即在新生儿出生后体内某些代谢产物出现异常,而尚未出现临床症状或者症状不明显时就早期明确诊断,并进行及时而有效的对症治疗,以避免患儿的重要脏器出现不可逆性损害,进而保障儿童正常的体格发育和智能发育。
串联质谱用于遗传代谢病的筛查诊断,主要通过数十种小分子的分析,筛查出包括氨基酸病、有机酸代谢紊乱和脂肪酸氧化缺陷在内的多种遗传代谢病,大大提高了筛查效率,实现了“一种实验检测一种疾病”到“一种实验检测多种疾病”的转变。基于串联质谱平台研发的新生儿遗传代谢病筛查试剂盒主要是将新生儿干血滤纸片中的氨基酸、有机酸、酰基肉碱萃取出来进行质谱分析。
新生儿遗传代谢病筛查试剂盒(即非衍生化法多种氨基酸、肉碱测定试剂盒)的样品前处理简单易操作,通过打孔器在干血滤纸片,然后加入萃取液,萃取后进行分析,萃取过程发生的装置即为过滤装置,过滤装置一般以针头式过滤器为主。针头式过滤装置不能批量处理样本,处理时间长,且所需样本量大,处理过程样本损失量大,所以不适合新生儿筛查项目。在样本正常提取的前提下,随着进样数目增多,仪器的清洗频率增大,若不及时清洗,造成仪器故障的频率越大,影响使用及检测。大批量样本进样时,液相色谱仪的高压阀转子、进样针及管路容易堵塞,造成压力过高,无法进样,同时杂质也在质谱的喷针及锥孔处积累,造成采集信号越来越低,影响样本检测准确性。在实验中发现,连续进样1000针后液相色谱仪压力超过承受上限,个别物质质谱采集信号低于定量限。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题,本发明的目的是提供一种新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法。
为了解决以上技术问题,本发明的技术方案为:
一种新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法,预处理方法为将血液样品自然晾干制成干血斑,将干血斑利用试剂盒进行提取,然后取上清液放入96孔板过滤板内利用96孔板离心机进行过滤,96孔板的内部放置聚四氟乙烯薄膜。
本发明的预处理方法对干血斑的检测稳定性强,可重复性好,相比于现有的干血斑whatman 903号纸预处理方法具有更好的检测效果,进样10000针不会发生堵塞现象。相比于其它预处理方法,具有更好的通透性和检测稳定性。
在一些实施例中,96孔板过滤机的转速为小于等于3000r/min。聚四氟乙烯薄膜配合96孔板离心机的转速能够保证液体通过聚四氟乙烯薄膜,满足液体较好的通透性。
在一些实施例中,96孔板离心机的离心力是1100-1200g。离心力保证聚四氟乙烯薄膜的通透性,同时与聚四氟乙烯薄膜配合,避免聚四氟乙烯薄膜出现破裂的情况,使液体中混入杂质。
在一些实施例中,聚四氟乙烯薄膜的孔径为0.22-0.45μm。膜的孔径影响膜的过滤效果,在承受压力一定的条件下,与一定孔径的膜进行配合能够过滤的更干净。
在一些实施例中,96孔过滤板中的每个容积为400-450μL。
上述利用试剂盒进行提取的具体步骤为:
利用打孔器将干血斑移入U-型底96孔微孔板内,每孔加入内标工作溶液,覆上封膜,振荡孵育,揭下封膜,将每孔内的溶液转移至对应的V-型底96孔耐热微孔板内,覆上封膜。
在一些实施例中,内标工作溶液为含有氨基酸内标和肉碱内标的萃取液,稀释比例为氨基酸内标浓缩液:肉碱内标浓缩液:萃取液=1:1:196-200。
在一些实施例中,振荡孵育的温度为28-32℃,振荡的频率为600-800rpm,振荡孵育的时间为40-45min。
在一些实施例中,离心的过程为:96孔板过滤板与V-型底96孔耐热微孔板叠放设置,96孔板过滤板过滤后的过滤液进入V-型底96孔耐热微孔板。然后将V-型底 96孔耐热微孔板放入自动进样器,进行检测。
本发明的有益效果:
通过本申请的预处理步骤后验证20000例均正常进样,液相体系压力正常,质谱采集信号不降低。相比之前进样1000针仪器频出故障的情况来讲,加过滤板后的效果具有明显优势。1.96孔过滤板可实现批量操作,节省时间,离心1min后整板样品即可上机检测;2.96孔过滤板成本低,适合配套到新筛试剂盒中;3.大大降低仪器堵塞故障率,同时可节约更换仪器配件的花费;4.不影响实验回收率;5.适用范围广,应用前景广,相同类产品可平移使用。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为10000针样本信号统计图;
图2为10000针样本异常峰型统计图;
图3为10000针总离子流信号统计图。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下面结合实施例对本发明进一步说明
实施例1
临床正常人样本1mL,制成若干个干血斑,自然晾干呈深褐色。
具体过程为:
1)用3mm打孔器在质控干血斑和待测样本干血斑上打孔并分别移入U-型底96 孔微孔板内。
2)每孔内加入配制好的内标工作溶液90μL,覆上粘性封膜。
3)30℃下700rpm振频振荡孵育45min。
4)揭去粘性封膜,每孔转移75μL溶液至对应序号位置的V-型底96孔耐热微孔板内,覆上铝箔封膜。
5)将V-型底96孔耐热微孔板内的上清液放入96孔板过滤板内利用96孔板离心机进行过滤,96孔板过滤板的内部放置聚四氟乙烯薄膜,96孔板过滤板与V-型底96 孔耐热微孔板叠放设置;
6)将离心后的V-型底96孔耐热微孔板放入自动进样器中,上机检测。
内标工作溶液为含有氨基酸内标和肉碱内标的萃取液,稀释比例为氨基酸内标浓缩液:肉碱内标浓缩液:萃取液=1:1:198。
96孔板的聚四氟乙烯的孔径为0.22μm,96孔板离心机转速是2000r/min,离心的时间为1min,离心力是1170g,96孔板承载的体积为300μL。
过滤后,上清液澄清,过滤膜上肉眼可见些许红色颗粒,过滤膜由白色变为淡红色或淡黄色。
对比例1
与实施例1不同的是偏氟乙烯膜(PVDF)。
对比例2
与实施例1不同的是尼龙膜(Nylon)。
对比例3
与实施例1不同的是混合纤维素酯膜(MCE)。
对比例4
与实施例1不同的是聚丙烯膜(PP)。
实施例1与对比例2-4的预处理后的液体经过LC-MS/MS检测,检测结果信号均值如表1所示:
表1不同过滤膜检测结果信号均值
分析物 | 对照组 | Nylon | MCE | PP | PTFE |
Ala | 15297 | 11268 | 16488 | 14122 | 16405 |
Val | 22383 | 14725 | 22275 | 19250 | 25287 |
Arg | 3087 | 3072 | 2632 | 2897 | 2975 |
Cit | 1433 | 1017 | 617 | 458 | 1448 |
Gly | 1294 | 328 | 1198 | 1249 | 1295 |
Leu | 66325 | 71260 | 55723 | 62630 | 69677 |
Met | 2392 | 1267 | 2865 | 2183 | 2385 |
Orn | 8630 | 10853 | 3813 | 11412 | 10422 |
Phe | 11702 | 11388 | 11255 | 10288 | 11698 |
Tyr | 7163 | 7405 | 7763 | 6988 | 7135 |
Pro | 50782 | 54030 | 54847 | 47920 | 50948 |
C0 | 17247 | 10010 | 19527 | 12933 | 18337 |
C2 | 29297 | 37110 | 46462 | 23057 | 42812 |
C3 | 5360 | 6060 | 3693 | 6402 | 6763 |
C4 | 1072 | 1050 | 423 | 732 | 998 |
C5 | 1330 | 1247 | 1362 | 1235 | 1287 |
C5DC | 242 | 246 | 158 | 140 | 237 |
C6 | 1432 | 1272 | 745 | 1367 | 1683 |
C8 | 233 | 200 | 218 | 198 | 270 |
C10 | 313 | 335 | 302 | 335 | 302 |
C12 | 205 | 192 | 140 | 133 | 243 |
C14 | 693 | 1272 | 1080 | 490 | 920 |
C16 | 2205 | 2110 | 2858 | 2385 | 2883 |
C18 | 1177 | 830 | 768 | 603 | 1205 |
对比例5
与实施例1不同的是96孔板离心机转速为1000r/min、3000r/min。离心时间分别为1min,2min,3min,5min。96孔板每孔样品全部流下为判定标准。
96孔板离心机转速2000r/min,时间1min就可以将液体离心下来。不再加大离心转速及时间,防止离心力过大将杂质离下来而干扰实验。
试验例1
1.样本制备:将同一临床正常人样本分为体积相同的3份,每份1ml。在其中2 份样本中加入不同浓度相同体积的待测物标准液(氨基酸、肉碱)制备待回收分析样本,制成2个不同加入浓度的待回收分析样本。在另一份样本中加入同样体积无待测物的溶剂,制成基础样本。将基础样本和两个浓度的回收样本制成干血斑,自然晾干呈深褐色。
2.样本处理:用实施例1的预处理方法对待回收分析样本和基础样本进行提取,然后经96孔过滤板过滤,每个样本重复测定3次。上机检测。
3.判断标准:分析物的回收率定在85-115%之间合格。
4.数据分析及讨论:对样本3次重复测定的结果计算均值,取其均值进行下述计算:
回收率计算结果如表2所示:
表2低水平、高水平回收样本回收率计算结果
通过表2可以得到各分析物的回收率均在85-115%之间,符合预期要求,说明本发明的预处理方法对待回收分析样本和基础样本均具有较好的回收率,对待回收分析样本具有更好的回收率,说明96孔过滤板可以降低基质效应,同时提高回收率。
试验例2
孔过滤板孔间及板间重复性验证
样本处理:利用实施例1的预处理方法对同一批试剂对样本重复测定288次,即三块96孔板的量。提取过程按试剂盒要求,提取后经过96孔过滤板过滤,再上机(LC-MS/MS)检测。
判断标准:各分析物测试结果的最大变异系数Cv在10%以内。
数据分析及讨论
计算板内96孔及板间288孔数据的均值和标准差。具体计算方法如下:
Cv%=100*(标准差/均值),结果如表3所示:
表3各分析物板内及板间的变异系数Cv%
由表3数据可知,各分析物的变异系数Cv均小于10%,符合预期要求。说明本发明的预处理方法测定结果具有稳定性和准确性。
试验例3
连续进样10000针峰型、信号稳定性验证
再加入过滤板提取后,进样10000针,验证管路是否堵塞,峰型是否有影响,质谱采集信号是否降低。正常峰型是稳定的“面包峰”,一旦管路、锥孔或喷针出现堵塞,就会导致峰型异常或无采集信号,典型峰型见下图。统计10000针样本总离子流信号,由于数据太多,每100个样本的总离子流信号求均值记为1个样本,做10000 针样本信号统计图,如图1所示,由图1可以得到实施例1预处理后的液体经过连续进样10000针的过程中,峰型基本稳定,没有发生管路、锥孔或喷针堵塞的问题。总离子信号图如图3所示,从图3中可以得到进样10000针样本信号稳定且没有降低。
图2所示为whatman 903号纸替代实施例1的聚四氟乙烯作为过滤膜的检测结果,发现whatman 903号纸得到峰型不稳定,经常发生管路、锥孔或喷针堵塞的问题。
发明人发现杂质的来源,主要由血片样本引入,杂质的成分主要是滤纸及血液。新生儿血片样本是用whatman 903号纸收集足跟血制备而成,903纸已作为新生儿检测项目标准采血产品。903纸由100%纯棉绒制成,棉绒纤维直径小于0.02mm。在血片打孔及样本振荡孵育过程中,部分细棉绒会掉入液体中,随之进入仪器造成堵塞。此外在振荡孵育过程中人血中的物质也会溶出,比如红细胞(平均直径为7μm)、蛋白、磷脂及其他杂质。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法,其特征在于:预处理方法为将血液样品自然晾干制成干血斑,将干血斑利用试剂盒进行提取,然后取上清液放入96孔板过滤板内利用96孔板离心机进行过滤,96孔板的内部放置聚四氟乙烯薄膜。
2.根据权利要求1所述的新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法,其特征在于:96孔板过滤机的转速为小于等于3000r/min。
3.根据权利要求1所述的新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法,其特征在于:96孔板过滤机的离心力是1100-1200g。
4.根据权利要求1所述的新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法,其特征在于:聚四氟乙烯薄膜的孔径为0.22-0.45μm。
5.根据权利要求1所述的新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法,其特征在于:96孔板中的每个容积为400-450μL。
6.根据权利要求1所述的新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法,其特征在于:利用试剂盒进行提取的具体步骤为:
利用打孔器将干血斑移入U-型底96孔微孔板内,每孔加入内标工作溶液,覆上封膜,振荡孵育,揭下封膜,将每孔内的溶液转移至对应的V-型底96孔耐热微孔板内,覆上封膜。
7.根据权利要求6所述的新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法,其特征在于:内标工作溶液为含有氨基酸内标和肉碱内标的萃取液,稀释比例为氨基酸内标浓缩液:肉碱内标浓缩液:萃取液=1:1:196-200。
8.根据权利要求6所述的新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法,其特征在于:振荡孵育的温度为28-32℃,振荡的频率为600-800rpm,振荡孵育的时间为40-45min。
9.根据权利要求1所述的新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法,其特征在于:离心的过程为:96孔板过滤板与V-型底96孔耐热微孔板叠放设置,96孔板过滤板过滤后的过滤液进入V-型底96孔耐热微孔板。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200612 |
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