CN111398500A - 一种鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品检测领域，具体涉及一种鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法。所述方法通过样品提取、液相色谱串联高分辨质谱检测和分析过程，提供了一种简单、快速、对环境友好的中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的鉴别方法，相对于其他方法，本发明方法的特征区域完全可视化，对内源性物质信息采集完全，便于操作和推广，对于准确识别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜有着重要意义，有利于促进蜂产品产业化发展，有利于养蜂行业健康和可持续发展。
Description
技术领域
本发明涉及食品检测领域，具体涉及一种鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法。
背景技术
蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜物质。来源于不同的蜜蜂种类、蜜源植物、产地、甚至采收和加工方法的差异均可导致蜂蜜中内源性活性组分的不同。意大利蜜蜂和中华蜜蜂是我国饲养的两个主要蜜蜂品种，目前我国有900万左右的蜂群，其中意大利蜜蜂为800万群，中华蜜蜂的蜂群数量在100万群左右。意蜂蜂蜜是从国外引进的意大利蜜蜂采集并酿造而成的，意蜂易饲养，繁殖快，蜂蜜产量高，能采集大面积蜜源。但是通常意蜂蜂蜜生产周期短,含水量大,夏季易发酸起沫变质,通常需要经过后期的加工程序才可食用。中华蜜蜂作为中国特有蜜蜂品种，其生产的蜂蜜深受国人喜爱，与意大利蜜蜂相比，春季采蜜时间早，秋季停止采蜜时间晚，行动敏捷，适应性强，而且能采集面积小的蜜源，适合山区饲养。所以中华蜜蜂多采集森林或山区的杂花花蜜充分酿制而成蜂蜜。由于其蜜色泽深、口味独特、香甜味浓，含有多种能被人体直接吸收的微量元素，由于酿蜜周期长、蜜源稀少被誉为“蜜之珍品”。由于中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜在生产方式和品质上的差异，导致二者在价格上存在明显差异，所以一些不法分子为了追求高额利润用意蜂蜂蜜冒充或掺入中蜂蜂蜜中以次充好，给广大的中蜂蜂农和相关的企业造成了严重的经济损失，同时也制约了中蜂产业的健康发展。
近年来中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜鉴别技术的开发受到科研人员和相关蜂产品企业的广泛关注，中国专利申请201610545277.1，专利201510999246.9和201910550683.0均报道了中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的识别技术，以上所述技术均依赖于蛋白质作为特征生物标志物进行鉴别，但是需要复杂的蛋白质提取、浓度测定、蛋白质电泳分离和条带识别等复杂的样品前处理过程和复杂的MALDI-TOF-TOF技术，不符合高效快速鉴别的发展趋势。中国专利申请20180008004.2报道了基于蜂蜡烷烃进行中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜鉴别的方法，但作为挥发性成分会随储存时间的延长，其含量明显下降。因此，建立简单、快速的中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的鉴别方式是十分必要的。近年来，小分子内源性物质凭借在蜂蜜基质中稳定存在，且提取测定简便，被广泛应用于食品真实性和溯源鉴别，但在中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜鉴别中尚无相关报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明基于简单的样品提取技术，获取尽可能多的蜂蜜中内源组分信息，基于获得的广泛的内源组分质谱信息开展数据分析，利用监督和非监督判别分析构建模型，对中蜂蜜和意蜂蜜开展鉴别。
为了实现上述目的，本发明提出了一种鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法，包括：
(一)模型构建：
(1)样品提取：将蜂蜜样品在体积浓度为8～12％的甲醇水溶液中超声处理8～12min，而后在10000～14000rpm，0～4℃下离心8～12min，收集上清液；在本发明中，甲醇水溶液是最好的溶解蜂蜜的溶液体系，其他有机体系的水溶液不能完全溶解蜂蜜，且容易使蜂蜜溶液分层，从而无法获取尽可能多的蜂蜜中内源物质信息。
(2)液相色谱串联高分辨质谱检测：将所述上清液经液相色谱分离并采用高分辨质谱检测，得到所述蜂蜜样品的液相色谱高分辨质谱全扫描谱图；
(3)分析：对所述液相色谱高分辨质谱全扫描谱图进行数据分析，构建中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的模型；
(二)待测样品的鉴定：
S1、采用与步骤(1)～(2)相同的方法处理待测样品；
S2、采用与步骤(3)相同的数据分析方法对所得到的液相色谱高分辨质谱全扫描谱图进行数据分析，构建多维统计模型；
S3、利用构建的多维统计模型，可视化地显示中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的代谢谱差异，进而鉴定中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜。
本发明发现，通过上述方法可以快速鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜，其中的样品前处理方法可以避免内源性物质损失，且溶剂对后续检测的干扰小。同时，经过上述预处理后的样品溶液最终不通过过滤膜即可用于质谱分析(过滤膜可吸附部分内源物质从而导致内源物质信息丢失)，进一步保证了内源性物质的完整性。
作为优选，步骤(1)中，所述蜂蜜样品的质量为2～5g。当样品质量如上时，不仅可以保证内源物质信息全面，样品均一；而且不会造成液相色谱质谱堵塞。
为了进一步提升内源性物质信息采集效果，本发明对液相色谱串联高分辨质谱的影响因素进行了探究与优化，发现了如下优选方案。
作为优选，步骤(2)中，所述液相色谱条件为：色谱柱为C18，100×2.1mm，1.9μm色谱柱，柱温30～40℃；优选所述的色谱柱为Thermo Scientific Hypersil GOLD C18(100×2.1mm,1.9μm)色谱柱。
作为优选，步骤(2)中，所述高分辨质谱条件为：喷雾电压3.5kV(+),3.2kV(-)；雾化温度350℃，鞘气压力35arb，辅助气压力10arb，离子传输管温度320℃，S-lens RF为50V；采集模式为正负模式分开扫描的Fullscan-ddms2模式，扫描范围80-2000，Full MS分辨率为70000，dd-MS2分辨率为17500。
作为优选，在步骤(2)的所述液相色谱中，以体积浓度为0.1％的甲酸水为流动相A,乙腈为流动相B，采用梯度洗脱：0-2min，5％的流动相B；7min，30％的流动相B；13-18min，95％的流动相B；18.1-20min，5％的流动相B。
作为优选，在步骤(2)的所述液相色谱中，进样量为4～6μL。
作为优选，在步骤(2)的所述液相色谱中，流速为0.20～0.40mL/min。
为了进一步提升结果的直观性和鉴别的准确性，本发明对步骤(3)的分析过程进行了优化，得到如下优选方案。
作为优选，步骤(3)具体包括：
S1、数据分析：对数据进行log转换，并采用UV进行数据预处理；优选此处进行数据预处理的软件为SIMCA软件；
S2、模型建立：采用经过预处理的数据建立PCA模型和/或OPLS-DA模型。
更优选地，在进行所述数据分析前，采用SIEVE软件进行背景扣除，并依此进行色谱峰提取和峰对齐。
本领域人员可对优选方案进行组合，得到本发明较佳实施例。
本发明进一步提供所述的方法在蜂蜜的特征性标志物确认中的应用。也就是说，本发明中的方法也可以为称作一种确认中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的特征性标志物的方法，通过对所述液相色谱高分辨质谱全扫描谱图进行分析，确认中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的特征性标志物。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种简单、快速、对环境友好的中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的鉴别方法，相对于其他方法，本发明方法的特征区域完全可视化，对内源性物质信息采集完全，便于操作和推广，对于准确识别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜有着重要意义，有利于促进蜂产品产业化发展，有利于养蜂行业健康和可持续发展。
附图说明
图1为实施例1中的中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的液相色谱串联高分辨质谱正模式全扫描对比色谱图；其中，上图为中蜂蜂蜜典型谱图；下图为意蜂蜂蜜典型谱图；
图2为实施例1中的中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的主成分分析(PCA)图，其中，Y代表中蜂蜂蜜，Z代表意蜂蜂蜜；
图3为实施例1中的中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)图，其中，Y代表意蜂蜂蜜，Z代表中蜂蜂蜜；
图4实施例1中的待测样品在PCA模型中的检测结果，图中，带×的为待测样品；
图5为实施例1中的待测样品在OPLS-DA模型中的检测结果，图中，带×的为待测样品；
图6实施例2中的待测样品在PCA模型中的检测结果，图中，带×的为待测样品；
图7为实施例2中的待测样品在OPLS-DA模型中的检测结果，图中，带×的为待测样品；
图8实施例3中的待测样品在PCA模型中的检测结果，图中，带×的为待测样品；
图9为实施例3中的待测样品在OPLS-DA模型中的检测结果，图中，带×的为待测样品；
图10为对比例1所构建的PCA模型，其中，Y代表意蜂蜂蜜，Z代表中蜂蜂蜜；
图11为对比例1所构建的OPLS-DA模型，其中，Y代表意蜂蜂蜜，Z代表中蜂蜂蜜；
图12为对比例2所构建的PCA模型，其中，Y代表意蜂蜂蜜，Z代表中蜂蜂蜜；
图13为对比例2所构建的OPLS-DA模型，其中，Y代表意蜂蜂蜜，Z代表中蜂蜂蜜。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1
(一)判别模型构建：
称取3g蜂蜜样品(分别为中蜂蜂蜜样品(具体信息见表1)和意蜂蜂蜜样品(具体信息见表1))加入5ml的10％甲醇水溶液稀释，超声溶解和提取蜂蜜10分钟，12000rpm，4℃离心10min，于液相色谱串联高分辨质谱进行分离。液相色谱仪器条件为：Thermo ScientificHypersil GOLD C18(100×2.1mm,1.9μm)色谱柱，柱温40℃，进样量为5μL，以0.1％甲酸水为流动相A,乙腈为流动相B，流速0.3mL/min，采用梯度洗脱程序：0-2min，5％的流动相B；7min，30％的流动相B；13-18min，95％的流动相B；18.1-20min，5％的流动相B。高分辨质谱仪器条件为：喷雾电压3.5kV(+),3.2kV(-)；雾化温度350℃，鞘气压力35arb，辅助气压力10arb，离子传输管温度320℃，S-lens RF为50V；采集模式为正负模式分开扫描的Fullscan-ddms2模式，扫描范围80-2000，Full MS分辨率为70000，dd-MS2分辨率为17500。构建中蜂蜜和意蜂蜜的液相色谱高分辨质谱全扫描谱图(图1，其中，上图为中蜂蜂蜜典型谱图；下图为意蜂蜂蜜典型谱图)，并采用SIEVE软件进行背景扣除，色谱峰提取，峰对齐后，利用SIMCA软件进行数据预处理，对数据进行log转换，而后采用UV进行数据预处理，建立PCA模型(图2，其中，Y代表中蜂蜂蜜，Z代表意蜂蜂蜜)和OPLS-DA模型(图3，其中，Y代表中蜂蜂蜜，Z代表意蜂蜂蜜)。
(二)待测样品的鉴定：
取待测样品2个(分别为1个中蜂蜂蜜，蜜源植物为百花，产地为重庆；1个意蜂蜂蜜，蜜源植物为洋槐，产地为河南)，采用与模型构建中相同的方法对样品进行提取、液相色谱串联高分辨质谱检测和数据分析，然后将处理得到的数据分别代入PCA模型和OPLS-DA模型，结果见图4～5，其中图4为待测样品在PCA模型中的检测结果，图5为待测样品在OPLS-DA模型中的检测结果；图中，带×的为待测样品。结果显示中蜂蜂蜜样品落入模型中的中蜂蜂蜜区域，意蜂蜂蜜样品落入模型中的意蜂蜂蜜区域中，这说明构建的模型适合于中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的鉴别。
实施例2
(一)判别模型的构建：
称取2g蜂蜜样品(分别为中蜂蜂蜜样品(具体信息见表1)和意蜂蜂蜜样品(具体信息见表1))加入8ml的8％甲醇水溶液稀释，超声溶解和提取蜂蜜10分钟，10000rpm，4℃离心10min，于液相色谱串联高分辨质谱进行分离。液相色谱仪器条件为：Thermo ScientificHypersil GOLD C18(100×2.1mm,1.9μm)色谱柱，柱温40℃，进样量为5μL，以0.1％甲酸水为流动相A,乙腈为流动相B，流速0.3mL/min，采用梯度洗脱程序：0-2min，5％的流动相B；7min，30％的流动相B；13-18min，95％的流动相B；18.1-20min，5％的流动相B。高分辨质谱仪器条件为：喷雾电压3.5kV(+),3.2kV(-)；雾化温度350℃，鞘气压力35arb，辅助气压力10arb，离子传输管温度320℃，S-lens RF为50V；采集模式为正负模式分开扫描的Fullscan-ddms2模式，扫描范围80-2000，Full MS分辨率为70000，dd-MS2分辨率为17500。构建中蜂蜜和意蜂蜜的液相色谱高分辨质谱全扫描谱图(图1)，并采用SIEVE软件进行背景扣除，色谱峰提取，峰对齐后，利用SIMCA软件进行数据预处理，对数据进行log转换，而后采用UV进行数据预处理，建立PCA模型(图2，其中，Y代表中蜂蜂蜜，Z代表意蜂蜂蜜)和OPLS-DA模型(图3，其中，Y代表中蜂蜂蜜，Z代表意蜂蜂蜜)。
(二)待测样品的鉴定：
取待测样品2个(已知分别为1个中蜂蜂蜜，蜜源植物为百花，产地为湖北；1个意蜂蜂蜜，蜜源植物为枣花，产地为陕西)，，采用与模型构建中相同的方法对样品进行提取、液相色谱串联高分辨质谱检测和数据分析，然后将处理得到的数据分别代入PCA模型和OPLS-DA模型，结果见图6～7，其中图6为待测样品在PCA模型中的检测结果，图7为待测样品在OPLS-DA模型中的检测结果；图中，带×的为待测样品。结果显示中蜂蜂蜜样品落入模型中的中蜂蜂蜜区域，意蜂蜂蜜样品落入模型中的意蜂蜂蜜区域中，这说明构建的模型适合于中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的鉴别。
实施例3
(一)模型构建：
称取5g蜂蜜样品(分别为中蜂蜂蜜样品(具体信息见表1)和意蜂蜂蜜样品(具体信息见表1))加入30ml的12％甲醇水溶液稀释，超声溶解和提取蜂蜜10分钟，14000rpm，4℃离心10min，于液相色谱串联高分辨质谱进行分离。液相色谱仪器条件为：Thermo ScientificHypersil GOLD C18(100×2.1mm,1.9μm)色谱柱，柱温40℃，进样量为5μL，以0.1％甲酸水为流动相A,乙腈为流动相B，流速0.3mL/min，采用梯度洗脱程序：0-2min，5％的流动相B；7min，30％的流动相B；13-18min，95％的流动相B；18.1-20min，5％的流动相B。高分辨质谱仪器条件为：喷雾电压3.5kV(+),3.2kV(-)；雾化温度350℃，鞘气压力35arb，辅助气压力10arb，离子传输管温度320℃，S-lens RF为50V；采集模式为正负模式分开扫描的Fullscan-ddms2模式，扫描范围80-2000，Full MS分辨率为70000，dd-MS2分辨率为17500。构建中蜂蜜和意蜂蜜的液相色谱高分辨质谱全扫描谱图(图1)，并采用SIEVE软件进行背景扣除，色谱峰提取，峰对齐后，利用SIMCA软件进行数据预处理，对数据进行log转换，而后采用UV进行数据预处理，建立PCA模型(图2，其中，Y代表中蜂蜂蜜，Z代表意蜂蜂蜜)和OPLS-DA模型(图3，其中，Y代表中蜂蜂蜜，Z代表意蜂蜂蜜)。
(二)待测样品的鉴定：
取待测样品2个(分别为1个中蜂蜂蜜，蜜源植物为百花，产地为广东；1个意蜂蜂蜜，蜜源植物为荆条，产地为河北)，，采用与模型构建中相同的方法对样品进行提取、液相色谱串联高分辨质谱检测和数据分析，然后将处理得到的数据分别代入PCA模型和OPLS-DA模型，结果见图8～9，其中图8为待测样品在PCA模型中的检测结果，图9为待测样品在OPLS-DA模型中的检测结果；图中，带×的为待测样品。结果显示中蜂蜂蜜样品落入模型中的中蜂蜂蜜区域，意蜂蜂蜜样品落入模型中的意蜂蜂蜜区域中，这说明构建的模型适合于中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的鉴别。
表1样品来源信息
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于，在蜂蜜样品前处理中，不使用超声波，且将离心转速修改为9000rpm。
模型构建结果见图10～11，其中，图10为PCA模型，其中，Y代表中蜂蜂蜜，Z代表意蜂蜂蜜，图11为OPLS-DA模型，其中，Y代表中蜂蜂蜜，Z代表意蜂蜂蜜。
由该结果可知，在不进行超声处理且更改离心条件后，不仅会使两种蜂蜜中差异组分信息不全；而且差异组分信息还被其他的杂质信息所覆盖了。所以在非监督模型中PCA分析模型和监督模型中OPLS-DA判别分析模型中两种样品不能完全分离，该模型不能有效地区分两种样品。
对比例2
在蜂蜜样品前处理中，将提取液中甲醇浓度修改为5％。
模型构建结果见图12～13，其中，图12为PCA模型，其中，Y代表中蜂蜂蜜，Z代表意蜂蜂蜜，图13为OPLS-DA模型，其中，Y代表中蜂蜂蜜，Z代表意蜂蜂蜜。
由该结果可知，甲醇比例低于8％时，两种蜂蜜中差异组分信息不全，在非监督模型中PCA分析模型和监督模型中OPLS-DA判别分析模型中两种样品不能完全分离，该模型不能有效地区分两种样品。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法，其特征在于，包括：
(一)模型构建：
(1)样品提取：将蜂蜜样品在体积浓度为8～12％的甲醇水溶液中超声处理8～12min，而后在10000～14000rpm，0～4℃下离心8～12min，收集上清液；
(2)液相色谱串联高分辨质谱检测：将所述上清液经液相色谱分离并采用高分辨质谱检测，得到所述蜂蜜样品的液相色谱高分辨质谱全扫描谱图；
(3)分析：对所述液相色谱高分辨质谱全扫描谱图进行数据分析，构建中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的模型；
(二)待测样品的鉴定：
S1、采用与步骤(1)～(2)相同的方法处理待测样品；
S2、采用与步骤(3)相同的数据分析方法对所得到的液相色谱高分辨质谱全扫描谱图进行数据分析，构建多维统计模型；
S3、利用所构建的多维统计模型，可视化地显示中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的代谢谱差异，进而鉴定中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述蜂蜜样品的质量为2～5g。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述液相色谱的条件为：色谱柱为C18，100×2.1mm，1.9μm色谱柱，柱温30～40℃。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述高分辨质谱的条件为：喷雾电压3.5kV(+),3.2kV(-)；雾化温度350℃，鞘气压力35arb，辅助气压力10arb，离子传输管温度320℃，S-lens RF为50V；采集模式为正负模式分开扫描的Fullscan-ddms2模式，扫描范围80-2000，Full MS分辨率为70000，dd-MS2分辨率为17500。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(2)的所述液相色谱中，以体积浓度为0.1％的甲酸水为流动相A,乙腈为流动相B，采用梯度洗脱：0-2min，5％的流动相B；7min，30％的流动相B；13-18min，95％的流动相B；18.1-20min，5％的流动相B。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(2)的所述液相色谱中，进样量为4～6μL。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(2)的所述液相色谱中，流速为0.20～0.40mL/min。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)具体包括：
S1、数据分析：对数据进行log转换，并采用UV进行数据预处理；
S2、模型建立：采用经过预处理的数据建立PCA模型和/或OPLS-DA模型。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在进行所述数据分析前，采用SIEVE软件进行背景扣除，并依此进行色谱峰提取和峰对齐。
10.权利要求1～9中任一项所述的方法在蜂蜜的特征性标志物确认中的应用。
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