CN109991303B - 利用毛细管电泳技术快速鉴别单花蜂蜜的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用毛细管电泳技术快速鉴别单花蜂蜜的方法，本发明利用毛细管电泳技术对蜂蜜中的蛋白质进行分析，利用不同蜂蜜中蛋白质含量及种类的区别对蜂蜜进行真实性鉴定，具有方法简便、效率高及鉴定结果准确等特点，在实现蜂蜜真伪鉴别中具有广泛的应用前景。该方法的步骤如下：(1)对蜂蜜样品加入样品缓冲液进行预处理，常温反应1小时后，10000rpm离心5min，上层清液即为样品。(2)将样品进行毛细管区带电泳，建立各单花蜂蜜的毛细管电泳指纹图谱。(3)对指纹图谱进行化学计量学分析，实现单花蜂蜜的鉴别。(4)此法对枣花蜂蜜、荆条蜂蜜、枸杞蜂蜜的最低检测限为5％，对洋槐蜂蜜的最低检测限为10％。

Description

利用毛细管电泳技术快速鉴别单花蜂蜜的方法
技术领域
本发明属于食品质量安全领域，具体涉及一种利用毛细管电泳技术快速鉴别单花蜂蜜的 方法。
背景技术
蜂蜜是指蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成 的天然甜味物质。单花蜜是蜜蜂采集单一植物花蜜酿造成的蜂蜜，其口感、营养价值、生理 功效以及养殖成本均在杂花蜜之上。不法商人为了谋取利益，常以廉价杂花蜜来代替单花蜜。目前，单花蜂蜜真实性鉴别日益成为国内外食品安全领域学者的研究热点。
蜂蜜真伪的传统鉴别方法有感官鉴别、理化指标鉴别等，现代鉴别方法包括近红外光谱 法、拉曼光谱法、气相色谱法、质谱法、高效液相色谱法、同位素色谱法等波谱、色谱方法。 目前这些方法大多利用蜂蜜中含量较高的糖、多酚等物质进行鉴别，这些物质掺假成本低，易于掺假，不能从根源上避免蜂蜜参杂使假，同时，普遍存在预处理步骤复杂、检测速度慢、 灵敏度、精确度不高等问题，因此，亟待建立一种快速、简便、高效的单花蜂蜜检测方法， 有效规范蜂蜜市场。
发明内容
针对上述问题，本发明根据蜂蜜中溯源性的、不易人工掺假的大分子物质--蛋白质的含 量及种类的差异，建立了一种利用毛细管电泳技术快速鉴别单花蜂蜜的方法，能快速、准确 地实现单花蜂蜜的鉴别。
一种利用毛细管电泳快速鉴别单花蜂蜜的方法，包括以下步骤：
1、毛细管预处理：对于首次使用的毛细管，按以下顺序洗脱：H2O 20min-1M H3PO4溶液 30min-H2O 20min-1M NaOH 30min-H2O 10min-运行缓冲液10min。进样前，按以下顺序洗脱：H2O 2min-1M H3PO4溶液2min-H2O 3min-1M NaOH 2min-H2O 2min-运行缓冲 液3min。实验过程中，需按以下顺序洗脱：H2O 5min-运行缓冲液5min。若出现基线不稳 的情况，可加酸或加碱进行冲洗。
1、称取5g蜂蜜，加入5mL样品缓冲液，混匀，常温反应1小时后，10000rpm离心5min，上清液即为样品。
2、将样品进行毛细管区带电泳。
(1)毛细管选用未涂层石英毛细管柱，内径为75μm，检测波长为214nm，进样方式为压力 进样，压力为0.5psi，进样时间为5s，分离电压为5kv，毛细管柱温为25℃。
(2)电泳时，运行缓冲液为含0.5mmol/L十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，pH9，浓度为 50mmol/L磷酸盐缓冲液。
3、利用中药色谱指纹图谱软件2004A建立各蜂蜜的毛细管电泳指纹图谱。
4、对指纹图谱进行化学计量学分析，实现单花蜂蜜的鉴别。
5、确认此方法的检测限。配制杂花蜂蜜，用此法进行检测，确认此法对单花蜂蜜的检测限。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供了一种简单、准确的样品前处理方法，能最大限度地降低样品的损失。
(2)本发明所建立的利用蜂蜜中的蛋白质、借助毛细管电泳技术进行单花蜂蜜鉴别的方法， 未见文献报道，为快速、准确地鉴别单花蜂蜜提供新依据。
(3)本发明的方法基于毛细管电泳技术，具有分离效率高、分析速度快、样品用量少、易 于自动化、检测限低、鉴定结果准确等特点。
附图说明
1、蜂蜜植物源分类
实验用4种植物源单花蜂蜜的见表1。
表1蜂蜜样品植物源归属
2、方法学考察结果
对实验的精密度、稳定性、重复性进行了考察。随机选取一个样品，在最优条件下连续 重复进样6次，通过测定各共有峰的相对保留时间及相对峰面积来考察仪器的精密度。任意 选取一个蜂蜜样品，每隔2h测定按在最优条件下进行检测，通过各共有峰的保留时间和相对 峰面积来考察样品的稳定性。随机选取一个蜂蜜样品，取6个平行样品，在最优条件下进行 检测，通过测定各共有峰的保留时间及相对峰面积来对方法的重复性进行考察。
RSD值均在5％以内，表明方法精密度、稳定性、重复性良好。
表2方法学考察结果
3、附图1说明
图1：毛细管电泳指纹图谱(A)枸杞蜂蜜；(B)荆条蜂蜜；(C)枣花蜂蜜；(D)洋槐蜂蜜
4、附图2说明
图2：四种单花蜂蜜的判别分析
5、附图3说明
图3：毛细管电泳法检测限(A)枸杞蜂蜜；(B)荆条蜂蜜；(C)枣花蜂蜜；(D)洋槐蜂蜜。
具体实施方式
实施例1
1.样品的制备
称取5g蜂蜜加入5mL样品缓冲液，混匀，常温反应1h后，10000rpm离心5min，上清液即为样品。
2、毛细管电泳分析条件优化
(1)毛细管选择及预处理：毛细管选用未涂层石英毛细管柱，内径为75μm，对于首次使用 的毛细管，按H2O 20min-1M H3PO4溶液30min-H2O 20min-1M NaOH 30min-H2O10min-运行缓冲液10min的顺序冲洗。进样前按H2O 2min-1M H3PO4溶液 2min-H2O3min-1MNaOH 2min-H2O 2min-运行缓冲液3min的顺序进行冲洗。实验过程 中，需按H2O 5min-运行缓冲液5min的顺序冲洗。若出现基线不稳的情况，可加酸碱进行 冲洗。
(2)毛细管电泳的分析条件：检测波长为214nm，进样方式为压力进样，压力为0.5psi，进 样时间为5s，分离电压为5KV，毛细管柱温为25℃。电泳运行缓冲液为含0.5mmol/L的十六 烷基三甲基溴化铵(CTAB)，pH9，浓度为50mmol/L磷酸盐缓冲液。
3、方法学考察：随机选取一个蜂蜜样品，按(1)进行预处理，在(2)条件下连续重复进样6次，通过测定各共有峰的相对保留时间及相对峰面积来考察仪器的精密度。任意选取一个 蜂蜜样品，每隔2h测定按在(2)条件下进行检测，通过各共有峰的保留时间和相对峰面积 来考察样品的稳定性。随机选取一个蜂蜜样品，取6个平行样品，按(1)方法分别制备供试 品溶液，在(2)条件下进行检测，通过测定各共有峰的保留时间及相对峰面积来对方法的重 复性进行考察，结果如表2所示。
4、将样品进行毛细管区带电泳，利用中药色谱指纹图谱软件建立各单花蜂蜜的毛细管电泳指 纹图谱。结果如图1所示。
5、利用数据处理软件SPASS19.0对指纹图谱进行判别分析，以期实现各单花蜂蜜的有效鉴别。 结果如图2所示。
6、确认此方法的检测限。在洋槐蜂蜜中加入不同比例的枣花蜂蜜，在枣花蜂蜜、枸杞蜂蜜、 荆条蜂蜜中加入不同比的洋槐蜂蜜，混合成杂花蜜，按上述方法进行检测、分析，确认毛细 管电泳法对单花蜂蜜的检测限。结果如图3所示。
以上所述仅为本发明专利的具体实施案例，但本发明专利的技术特征并不局限于此，任 何相关领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明专利范围之中。

Claims (5)

1.一种利用毛细管电泳技术快速鉴别单花蜂蜜的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)利用样品缓冲液对蜂蜜进行预处理，常温反应1h后，10000rpm离心5min，上清液即为样品；
(2)将样品进行毛细管区带电泳，建立各单花蜂蜜的毛细管电泳指纹图谱；
(3)对指纹图谱进行化学计量学分析，实现单花蜂蜜的鉴别；
这些蜂蜜的植物源分类如下表所示：
步骤(1)中的样品缓冲液配方为：称取0.895g十二水合磷酸氢二钠，76mg二硫苏糖醇，5mL 10％十二烷基硫酸钠，用超纯水定容至50mL，调节pH为8；
步骤(2)中运行缓冲液配方为：称取0.39g十二水合磷酸二氢钠，0.9g十二水合磷酸氢二钠，调节pH9，0.009g十六烷基三甲基溴化铵，用超纯水定容至50mL，调节pH为9；步骤(2)中电泳条件为：毛细管选用非涂层石英毛细管柱，内径为75μm，检测波长为214nm，进样方式为压力进样，压力为0.5psi，进样时间为5s，分离电压为5kv，毛细管柱温为25℃。
2.根据权利要求1所述的利用毛细管电泳技术快速鉴别单花蜂蜜的方法，其蜂蜜是指双子叶植物中的豆科源单花蜜。
3.根据权利要求1所述的利用毛细管电泳技术快速鉴别单花蜂蜜的方法，其蜂蜜是指双子叶植物中的茄科源单花蜜。
4.根据权利要求1所述的利用毛细管电泳技术快速鉴别单花蜂蜜的方法，其蜂蜜是指双子叶植物中的马鞭草科源单花蜜。
5.根据权利要求1所述的利用毛细管电泳技术快速鉴别单花蜂蜜的方法，其蜂蜜是指双子叶植物中的鼠李科源单花蜜。
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