CN106932517B - 一种鉴别枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种鉴别枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜的分析方法，具体是应用超高效液相色谱‑四极杆‑轨道阱高分辨质谱技术结合代谢组学方法，包括：将真枣花蜜样品和与待检测的糖浆掺假枣花蜜样品分别采用有机溶剂进行前处理后，应用超高效液相色谱‑四极杆‑轨道阱高分辨质谱方法实现对前处理后的样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到真枣花蜜样品与待测的枣花蜜样品的UHPLC‑MS原始数据进行预处理，最后应用多元统计分析方法主成分分析区分真枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜。本发明的方法是在对枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜的代谢物信息进行一个全面的获取后，结合多元统计分析，对枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜进行全面分析，完成对糖浆掺假枣花蜜的检测。

Description

一种鉴别枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜的分析方法
技术领域
本发明属于食品掺假鉴别技术领域，具体涉及一种应用UHPLC-Q Exactive联用的代谢组学技术鉴别枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜的分析方法。
背景技术
蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质，蜂蜜营养价值高，但是由于蜂蜜较高的价格和较低的产量，使得蜂蜜成为不法商贩掺假的一个主要对象，为了提高蜂农的生产积极性、保障消费者的利益，为了支持正规蜂蜜生产企业的公平竞争、维护蜂蜜市场的秩序，促进我国蜂蜜产业的健康发展，因此对于找到真正蜂蜜样品的标志性代谢物，从而尝试建立一套灵敏、高效、准确的蜂蜜掺假鉴定方法具有非常重要的意义与价值。
在真蜂蜜中掺入果葡糖浆、淀粉糖浆、大米糖浆等：这是目前最常用的蜂蜜掺假手段，由于这些糖浆的果糖和葡萄糖比例与蜂蜜中的成分非常相似，掺入后各项检测指标完全符合国家标准，给检测造成了很大的困难。目前常用于蜂蜜掺假进行鉴定的方法有稳定碳同位素比值分析法(SCIRA)、薄层色谱法(TIC)、脉冲电流检测器的高效阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)、气相色谱质谱联用技术(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相同位素质谱仪联用技术(HPLC-IRMS)、核磁共振技术(NMR)以及近红外光谱(NIRS)等。现有的方法对于测定蜂蜜掺假有许多弊端：稳定碳同位素比值分析法(SCIRA)这种方法只对天然蜂蜜中掺入C4植物糖有效，如果蜂蜜中掺入利用水稻、小麦、大豆等C3植物淀粉制备的糖类成分或利用水稻、小麦、大豆等C3植物淀粉制备的糖类物质与其他物质配制的全假蜂蜜，则难以鉴别。Kushnir等利用薄层色谱法测定玉米糖浆掺假的蜂蜜确定聚合度为12到19的多聚糖为蜂蜜掺假高果糖玉米糖浆和玉米糖浆的标志物。但是这种方法需要复杂的前处理过程来除去蜂蜜中的葡萄糖、果糖和少量寡糖，导致检测方法操作复杂。脉冲电流检测器的高效阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)法的局限性更大，在前期对寡糖和多聚糖的水解很可能造成假阳性结果，因为真蜂蜜中也有聚合度3-6的寡糖的存在。脉冲电流检测器的高效阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)则需要复杂的前处理过程来除去单糖和寡糖，前处理过程复杂。GC-MS法测定蜂蜜掺假也有一定的缺陷，在检测前需要对蜂蜜样本进行衍生化。核磁共振技术(NMR)灵敏度低，对于蜂蜜中我们所关注的代谢物可能会被忽略，并且核磁共振仪器价格昂贵，并不适用于日常监测。近红外光谱(NIRS)也有其致命的缺点：1.需要大量有代表性且化学值已知的样品建立模型。这样，对小批量样品的分析用近红外就显得不实际了。2.模型需要不断更新，由于仪器状态改变或标准样品发生变化，模型也要随之变化了。3.模型不通用，每台仪器的模型都不相同，增加使用的局限性。4.建模本钱高，测试用度大。
现有的对蜂蜜品质进行鉴定的方法如GB14963-2011以及SN/T 0852-2012：对蜂蜜的感官性状；理化指标如：果糖葡萄糖含量，蔗糖含量等方面进行检测；微生物指标，农残兽残，重金属，添加剂等方面也均进行检测。很多企业标准则对蜂蜜中的麦芽糖、果葡萄糖浆、可可粉，柠檬酸、诱惑红、焦糖色、山梨酸钾、卡拉胶、食用香精等进行测定。目前对蜂蜜掺假的各种糖浆，在理化性质，成分组成和含量以及风味方面与蜂蜜非常相似，因此上述对蜂蜜品质进行测定的方法并不能检测出糖浆掺假的蜂蜜。
综上所述，目前现有技术中缺少一种对枣花蜜掺假进行鉴定的快速有效和直观明显的方法，也没有用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱联合代谢组学法测定枣花蜜标志性代谢物的有关研究。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种应用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱技术结合代谢组学方法鉴别枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜的分析方法，该分析方法能够有效鉴别真枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜。
本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个目的是提供一种应用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱技术结合代谢组学方法判别枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜的分析方法，包括以下步骤：
将真枣花蜜样品和与待检测的糖浆掺假枣花蜜样品分别采用有机溶剂进行前处理后，应用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱方法实现对前处理后的样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到真枣花蜜样品与待测的枣花蜜样品的UHPLC-MS原始数据进行预处理，最后应用多元统计分析方法主成分分析(PCA)模型区分真枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜。
本发明的分析方法对于掺假枣花蜜所用的糖浆并没有特别限定，涵盖目前掺假所用的C3、C4糖浆所有种类，包括：大米糖浆、玉米糖浆、甜菜糖浆、复合果葡糖浆、网购蜂蜜专用糖浆或其它糖浆。
作为一种优选方案，本发明中样品前处理中采用的有机溶剂是含有甲酸的甲醇和水的混合溶剂，其中，优选的，甲酸的体积分数为1％，甲醇和水为等体积混合形成混合溶剂。
作为一种优选方案，本发明中的样品前处理过程包括：将样品与有机溶剂混合至样品完全溶解，超声，离心，过有机滤膜，得到可上机检测的样品。其中，超声时间为10～30min，优选25min；离心条件：800～1200rpm离心4～8min，优选1000rpm离心5min；有机滤膜的孔径为0.20～0.25μm，优选0.22μm；为保证样品中代谢物提取效果较好，样品与有机溶剂的添加比例为1g：(15～25)mL。
在整个前处理过程，为了保证尽可能多的获取蜂蜜样品以及糖浆掺假枣花蜜样品的代谢物信息，提取试剂优先选用的是甲醇和水的混合溶剂(含少量甲酸)对测试样品进行溶解，超声后离心过有机滤膜即可上机检测，前处理步骤简单，易于操作。
色谱的分离和质谱数据的采集是同时进行的，为了使每个化合物都得到分离和鉴定，必须选择合适的色谱和质谱分析条件。
本发明针对枣花蜜样品以及糖浆掺假枣花蜜组分的特点，考察了超高效液相色谱中的流动相、梯度洗脱流程、柱温和进样量等条件对分离效率和分析速度的影响，最终优化筛选得到一组使得分析样品得到最佳分离效果的超高效液相色谱条件。
作为一种优选方案，超高效液相色谱条件为：采用十八烷基键合硅胶柱(C18柱)；流动相：A相：乙腈，B相：醋酸铵水溶液(优选浓度为10mM)，梯度洗脱流程：0-2min 1％A,2-3.25min 1％-5％A，3.25-4.25min 5％A,4.25-7.75min 5％-55％A,7.75-9.75min 55％-90％A,9.75-11.75min 90％A,11.75-12min 90％-1％A,12-15min 1％A。流速：0.2～0.5mL/min(优选0.3mL/min)，柱温30～37℃(优选35℃)，进样量3微升。
本发明针对枣花蜜样品以及糖浆掺假枣花蜜组分的特点，为改善化合物的雾化和电离状况，提高灵敏度，通过对分辨率、气体流速、喷雾电压等条件进行考察，最终优化筛选得到一组使得检测效果准确的四极杆-轨道阱高分辨质谱条件。
作为一种优选方案，四极杆-轨道阱高分辨质谱选用Thermo Fisher Q ExactiveMass Spectrometer，正谱条件为：分辨率，70000；鞘气流速，40个单位；辅助气流速，10个单位；反吹气流速，0个单位；喷雾电压，3.5kV；毛细管温度，320℃；辅助气温度，350℃。扫描范围，m/z：70-1050。扫描模式：Full Ms(全扫描)。
应用代谢组学技术都可以测定到许多内源性化合物的定性/定量信息。这些信息在输出的谱图上表现为许多信号峰,在色谱质谱图上表现为不同保留时间出现色谱峰。
对得到的枣花蜜样品和待测蜂蜜样品的UHPLC-MS原始数据进行预处理，得到各个峰的保留时间、峰高、峰面积和质荷比数据。目前可采用现有技术中的多种软件对于原始数据进行预处理，对于软件的种类并没有特别的限定，这些软件对总离子流图具有数据处理的功能。
从处理效果和方便性来讲，作为一种优选方案，对得到的枣花蜜样品和待测枣花蜜样品的UHPLC-MS原始数据采用Compounds Discoverer软件进行预处理，该预处理是指对总离子流图原始数据中的色谱峰的提取、峰对齐、去噪音未知物的检测等处理，得到各个峰的保留时间、峰高、峰面积和质荷比数据；然后通过多元统计分析方法PCA得分图的形式对区分结果进行展示。
其中，Compounds Discoverer软件是赛默飞世尔科技有限公司研制的一种处理LC-MS原始数据的软件。
为了克服现有技术中无法具体鉴别出枣花蜜掺假的糖浆的类型，本发明的第二个目的是提供一种基于上述分析方法筛选区别于糖浆的真枣花蜜标志性代谢物的方法，该方法能够筛选出真枣花蜜与糖浆的差异代谢物，然后只需对这些差异代谢物进行进一步确认，避免了对所有样品中的代谢物进行统计和分析的麻烦，这样提高了分析准确性和分析效率；对差异性代谢物的研究和分析为深入研究样品的内在差异提供重要信息；进一步的，这还为以后建立鉴别真假枣花蜜的通用模型提供了基础，可用于快速鉴别枣花蜜掺假的样品类型(掺假的是何种糖浆类型以及糖浆掺假的含量)，不仅分析时间短，还提高了鉴别结果的准确性和可靠性。
对枣花蜜样品与糖浆分别采用有机溶剂进行前处理后，应用所述的超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱方法实现对前处理后的样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到枣花蜜样品与糖浆的UHPLC-MS原始数据进行预处理，最后应用多元统计分析方法主成分分析进行差异化合物筛选，确定和鉴定标志性代谢物。
对得到的枣花蜜样品与糖浆的UHPLC-MS原始数据采用Compounds Discoverer软件进行预处理，该预处理是指对总离子流图原始数据中的色谱峰的提取、峰对齐、去噪音、未知物的检测等处理，得到各个峰的保留时间、峰高、峰面积和质荷比数据，并通过多元统计分析方法主成分分析模型得到PCA得分图和载荷图，筛选出标志性代谢物，进而鉴定标志性代谢物。
PCA得分图和载荷图可在Compounds Discoverer软件中进行PCA分析得到，此为本领域技术人员公知的技术手段，在此不再赘述。
针对枣花蜜组分的特点，本发明采用载荷图筛选差异性代谢物是一种简单的方法，在获得载荷图时，本发明通过设定Ratio＞20或＜0.5，P值＜0.01，来筛选潜在的标志性代谢物。其中，所述Ratio为该代谢物在两组中的峰面积的比值。
经过超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱方法的检测，发现枣花蜜中的代谢物非常多，为了便于寻找两者差异最大的代谢物，本发明将PCA模型中的Ratio设定为大于20，本发明中的Ratio是指枣花蜜中的某种代谢物的峰面积与糖浆中的该种代谢物的峰面积的比值，经过这样的设定，能够快速筛选两者的差异性较大的代谢物。
对筛选出来的潜在的标志性代谢物首先进行假阳性离子的排除，所述假阳性离子为返回总离子流图中提取不到色谱峰的物质；获得阳离子模式下的标志性代谢物信息，包括分子式，分子离子准确质量数以及保留时间等，准确质量数的最大偏差在5ppm以内，保留时间偏差在0.2分钟内；同样的，根据获得的分子式，在阴离子模式下对潜在的标志性代谢物的分子离子进行提取，并根据阴阳离子模式下分子离子峰单位准确质量数对潜在的标志性代谢物进行推测，最终获得区别于糖浆的枣花蜜标志性代谢物。
在鉴定标志性代谢物时，通过四极杆-轨道阱高分辨质谱的二级质谱设定高能碰撞诱导裂解技术(HCD)的高能碰撞池三个能量级来寻找标志性代谢物的碎片离子，从而实现对枣花蜜样本标志性代谢物的鉴定分析。
为了克服现有技术中无法具体鉴别出枣花蜜掺假的糖浆的类型，本发明的第三个目的是基于以上筛选方法得到的区别于大米糖浆的枣花蜜标志性代谢物，所述标志性代谢物有以下化合物组成：褪黑激素、N-乙酰羟色胺、亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸、对香豆酸、肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸、白杨素。该标志性代谢物可用来鉴别大米糖浆掺假枣花蜜。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)用代谢组学方法结合超高效液相色谱串联质谱技术可以实现对枣花蜜和糖浆中的几乎全部的代谢物信息进行获取。
本发明的分析方法不同于之前的对枣花蜜掺假进行测定的方法，只针对某一种或者某几种常规化合物进行定性定量检测来判断掺假，这就会导致不法分子会根据最新出台的蜂蜜掺假方法来对掺假技术进行调整。而本发明的方法是在对枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜的代谢物信息进行一个全面的获取后，结合多元统计分析，对枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜进行全面分析，建立模型，完成对糖浆掺假枣花蜜的检测。
采用本发明的分析方法能够有效区分枣花蜜和糖浆掺假枣花蜜，结果以PCA得分图的形式展示，本领域技术人员能够直观的判别其真假情况，无需再进行相关验证和分析，可以得到真假结论，检测结果准确可靠。
(2)枣花蜜样品前处理方法简单快捷，方法建立后对检测人员操作技术要求较低。
在整个前处理过程，为了保证尽可能多的获取枣花蜜样品以及糖浆掺假枣花蜜样品的代谢物信息，提取试剂用的是甲醇和水的混合溶剂(含甲酸)对测试样品进行溶解，超声后离心过有机滤膜即可上机检测，前处理步骤简单，易于操作。
(3)检测模型建立后，可用于对糖浆掺假枣花蜜样品进行批量检测。
上机检测后的原始数据经过Compounds Discoverer软件对枣花蜜样品与糖浆掺假枣花蜜样品进行总离子流图色谱峰的提取，峰对齐，未知物的检测等差异性分析，最后通过多元统计分析PCA图的形式对区分结果进行展示。此检测方法建立后，对于未知的糖浆掺假枣花蜜样品与枣花蜜的区分可按相同流程进行操作。经过实验验证，不合适的前处理方法不能最大限度地提取真蜂蜜的内源性代谢产物，将会造成不容易区分的检测结果，使得检测结果不准确。
(4)优于其他检测方法，不需要对某一或某些靶向物质进行定性定量测定，是一种宏观非靶向的种类区分的方法。
(5)通过本发明的筛选方法能够得到的区别于大米糖浆的枣花蜜标志性代谢物，该标志性代谢物有以下化合物组成：褪黑激素、N-乙酰羟色胺、亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸、对香豆酸、肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸、白杨素。区别于其他糖浆的枣花蜜的标志性代谢物可采用与本发明相同的筛选方法进行研究得到。根据得到的这些区别于不同糖浆的枣花蜜标志性代谢物，能够建立一套鉴别不同种类以及不同掺假含量的糖浆掺假枣花蜜的通用模型，通过该通用模型，能够快速知晓掺假的糖浆种类以及掺假的含量；而且通模型的建立为以后快速、高效、灵敏、准确地进行鉴别掺假枣花蜜具有非常重要的意义与价值。
附图说明
图1是枣花蜜与掺假1％、5％、10％大米糖浆，1％玉米糖浆，1％甜菜糖浆，1％蜂蜜专用糖浆掺假枣花蜜的PCA得分图。
图2是阳离子模式下枣花蜜样本与F55大米糖浆样本总离子流图。
图3是枣花蜜样本组与糖浆样本组PCA得分图。
图4是枣花蜜样本组与糖浆样本组载荷图。
图5是筛选后枣花蜜样本组与糖浆样本组载荷图。
图6A和图6B是褪黑激素碎片离子质谱图。
图7A和图7B是N-乙酰羟色胺碎片离子质谱图。
图8是亮氨酸碎片离子质谱图。
图9A、图9B和图9C是酪氨酸碎片离子质谱图。
图10是脯氨酸碎片离子质谱图。
图11A、图11B和图11C是对香豆酸碎片离子质谱图。
图12A和图12B是肉桂酸碎片离子质谱图。
图13是4-甲氧基肉桂酸碎片离子质谱图。
图14A和图14B是白杨素碎片离子质谱图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
术语解释：
多元统计分析方法是建立在多元统计分布基础上的一类处理多元统计数据方法的总称，是统计学中的具有丰富理论成果和众多应用方法的重要分支。常用的多元统计分析方法主要包括：多元回归分析、聚类分析、判别分析、主成分分析、因子分析、对应分析、典型相关分析等。本发明主要采用主成分分析法。
仪器与设备：
ACQUITY UPLC BEH C18分析柱美国Waters公司(2.1×75mm,1.7μm)；
Thermo Scientific Q Exactive Thermo ScientificTM Ultimate3000美国Thermo Fisher公司；
SIGMA3-18K高速冷冻离心机德国SIGMA公司；
Milli-Q-A-11超纯水机密理博公司；
超声波清洗机宁波新芝生物科技有限公司；
IKA MS 3basic涡旋混合器IKA公司；
材料与试剂：
枣花蜜不同蜂农处收集；
糖浆山东省食品药品检验院；
超纯水Milli-Q-A-11；
乙腈赛默飞世尔科技有限公司；
甲醇赛默飞世尔科技有限公司；
无水甲酸天津市科密欧化学试剂有限公司。为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
(1)本发明的方法原理：
对真枣花蜜样品与糖浆掺假枣花蜜样品用相同的前处理方法处理后，应用UHPLC串联Thermo Fisher Q Exactive Mass Spectrometer仪器实现对样品中化学成分的分离与测定，应用Compounds Discoverer软件对仪器获得原始数据进行色谱峰的提取，峰对齐以及未知化合物的搜库分析。应用多元统计分析PCA分析区分真枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜。
(2)样品前处理
称取1g枣花蜜样品(一个样品的重复次数为6次)于50mL离心管中，加入20mL提取剂(提取剂为含1％甲酸的甲醇与超纯水等体积混合)，涡旋混合至枣花蜜样品完全溶解，将离心管置于超声清洗机中超声25分钟，1000rpm离心5分钟，将上清液用0.22μm有机滤膜过滤以备上样。
分别称取0.99g，0.95g，0.90g枣花蜜样品(一个样品的重复次数为6次)于50mL离心管中，分别称取0.1g，0.5g，1g糖浆样品于100mL锥形瓶中，枣花蜜样品中加入19mL提取剂(提取剂为含1％甲酸的甲醇与超纯水等体积混合)，糖浆样品中加入10mL提取剂，混匀溶解后，再分别取1mL加入到枣花蜜样品中做人为掺假枣花蜜，涡旋混合至蜂蜜样品完全溶解，将离心管置于超声清洗机中超声25分钟，1000rpm离心5分钟，将上清液用0.22μm有机滤膜过滤以备上样。
(3)应用UHPLC串联Thermo Fisher Q Exactive Mass Spectrometer仪器实现对样品中化学成分的分离与测定。
色谱条件：
A相：乙腈，B相：10mM醋酸铵水溶液，梯度洗脱流程：0-2min 1％A,2-3.25min 1％-5％A，3.25-4.25min 5％A,4.25-7.75min 5％-55％A,7.75-9.75min 55％-90％A,9.75-11.75min 90％A,11.75-12min 90％-1％A,12-15min 1％A。流速：0.3mL/min，柱温35摄氏度，进样量3微升。
质谱条件：
正谱条件：分辨率，70000；鞘气流速，40个单位；辅助气流速，10个单位；反吹气流速，0个单位；喷雾电压，3.5kV；毛细管温度，320℃；辅助气温度，350℃。扫描范围，m/z：70-1050。扫描模式：Full Ms。
(4)数据处理与多元统计分析：
对得到的枣花枣花蜜样品和糖浆掺假枣花蜜样品的UHPLC-MS原始数据采用Compounds Discoverer软件进行预处理，该预处理是指对总离子流图原始数据中的色谱峰的提取，峰对齐，去噪音，未知物的检测等处理，然后通过多元统计分析方法PCA得分图的形式对区分结果进行展示。
PCA得分图是PCA模型的一种分布图，由于PCA分析是建立在同一个数据集X基础上，经过投影方法计算PCA第一主成分后，可以得到各个样品点在第一个主成分的得分t1，再得到各个样品点的第二个主成分上的得分t2，比如图1～图3。各个样品在各个主成分的得分就是其在计算的数学模型中的空间坐标，自然也就决定了其在模型中的具体位置，并直接反映各个样品在数学模型空间中的分布情况。
(5)成果展示：
样品为枣花蜜(采用的样品个数是5个，从不同蜂农处收集，每个样品重复6次试验)，糖浆为大米糖浆、玉米糖浆、甜菜糖浆、网购蜂蜜专用糖浆，按照(1)～(4)的流程进行操作，得到枣花蜜与掺假1％、5％、10％大米糖浆，1％玉米糖浆，1％甜菜糖浆，1％网购蜂蜜专用糖浆掺假枣花蜜的区分。
结果如图1所示，PCA得分图中，1r、5r、10r、1c、1b、1h分别表示的是掺假1％、5％、10％大米糖浆的掺假枣花蜜，掺假1％玉米糖浆的掺假枣花蜜，掺假1％甜菜糖浆的掺假枣花蜜，掺假1％蜂蜜专用糖浆的掺假枣花蜜。从PCA得分图可以看出各个样品的聚集、离散程度，每一个点代表一个样品，其中，枣花蜜包括5个样品(每个样品六次重复，只选取了该样品的其中一次在图1中进行说明)，该5个样品点全部集中在图1中的左下区域的靠左部分，这说明这5个真枣花蜜样品含有的代谢物组成和浓度很接近，而与其他糖浆掺假的枣花蜜的样品点距离很大，这说明真枣花蜜样品含有的代谢物组成和浓度与糖浆掺假蜂蜜区别较大，采用该方法可以有效区分真枣花蜜与糖浆掺假蜂蜜，这个结果相对显而易见；1r、5r、10r、1c、1h、1b均包括3个样品(每个样品六次重复，只选取了该样品的其中一次在图1中进行说明)，在图1中显示的是三个点(1r、5r、10r、1c、1h)，从图中可以看出，有些糖浆掺假的枣花蜜可以很明显的区分开，比如1c和10r、1h、1b两组的样品点远离程度大，能够有效区分。而有些糖浆掺假的枣花蜜并不能有效区分，如图1所示，10r、1h、1b样品点全部集中在右下部分，并且样品点距离很近，无法直观有效区分，而10r和1h、1b的掺假含量差异较大，但是10r和1h、1b却无法直观有效区分，从这点可以看出，即使两种差异较大的样品采用该代谢组学方法也不一定能够有效区分。
综上，经过图1可得，本方法能将真枣花蜜与掺假1％、5％、10％大米糖浆的掺假枣花蜜，掺假1％玉米糖浆的掺假枣花蜜，掺假1％甜菜糖浆的掺假枣花蜜，掺假1％蜂蜜专用糖浆的掺假枣花蜜进行很好的区分。
实施例2
基于UHPLC串联Thermo Fisher Q Exactive Mass Spectrometer结合代谢组学方法筛选枣花蜜标志性代谢物的方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理
将1g枣花蜜样品于50mL离心管中，加入20mL提取剂(提取剂为含1％甲酸的甲醇与超纯水等体积混合)，涡旋混合至枣花蜜样品完全溶解，将离心管置于超声清洗机中超声25分钟，1000rpm离心5分钟，将上清液用0.22μm有机滤膜过滤以备上样。
将1g糖浆样品于50mL离心管中，加入20mL提取剂(提取剂为含1％甲酸的甲醇与超纯水等体积混合)，涡旋混合至糖浆样品完全溶解，将离心管置于超声清洗机中超声25分钟，1000rpm离心5分钟，将上清液用0.22μm有机滤膜过滤以备上样。
其中，所述糖浆并没有特别限定，涵盖目前掺假所用的C3、C4糖浆所有种类，包括：大米糖浆、玉米糖浆、甜菜糖浆、复合果葡糖浆、网购蜂蜜专用糖浆或其它糖浆。
(2)应用UHPLC串联Thermo Fisher Q Exactive Mass Spectrometer仪器实现对样品中化学成分的分离与测定。其中，色谱条件与实施例1中的相同，质谱条件如下所述：
一级质谱条件：
负谱条件：分辨率，70000(FWHM)；鞘气，40个单位；辅助气，10个单位；反吹气，0个单位；喷雾电压，2.8kV；毛细管温度，320℃；辅助气温度，350℃。扫描范围，m/z：70-1050。扫描模式：Full Ms。
正谱条件：分辨率，70000(FWHM)；鞘气，40个单位；辅助气，10个单位；反吹气，0个单位；喷雾电压，3.5kV；毛细管温度，320℃；辅助气温度，350℃。扫描范围，m/z：70-1050。扫描模式：Full Ms。
二级质谱条件：
正谱条件：分辨率，175000(FWHM)；鞘气，40个单位；辅助气，10个单位；反吹气，0个单位；喷雾电压，3.5kV；毛细管温度，320℃；辅助气温度，350℃。扫描范围，m/z：70-1050。HCD高能碰撞池能量,50、100、150。扫描模式：Full Ms。
(3)数据处理与多元统计分析
对得到的枣花蜜样品与糖浆的UHPLC-MS原始数据采用Compounds Discoverer软件进行预处理，该预处理是指进行总离子流图色谱峰的提取，峰对齐，去噪音，未知物的检测等处理，并通过多元统计分析方法得到PCA得分图和载荷图，进而筛选出标志性代谢物。
PCA得分图和载荷图是PCA模型分析得到的两种分布图。载荷图表示了所检测的变量(如质荷比)的分布情况，载荷图中的变量分布与得分图中样品的分布和位置相对应。
具体应用和操作如下：
样品为枣花蜜(采用的样品个数是5个，从不同蜂农处收集，每个样品重复6次试验)和F55大米糖浆(采用的样品个数是10个，每个样品重复6次试验)：
按照(1)～(3)的流程进行操作，经过质谱检测后，获得枣花蜜样本和F55大米糖浆样本的总离子流图，如图2所示，在阳离子模式下，枣花蜜样本总离子流图与F55糖浆总离子流图在2-7分钟存在很大的差异，具体差异还需要进一步分析。
图3为枣花蜜样本组和糖浆样本组PCA得分图，从图中可以看出枣花蜜样本组(右半部分的点)与糖浆样本组(左半部分的点)在第一主成分上就能实现完全分离，图2以及图3说明枣花蜜样本组与糖浆样本组代谢物存在很大差异，图4为通过Compounds Discoverer软件分析后提取出的枣花蜜样本组与糖浆样本组的代谢物，每个点表示提取出的一种代谢物(所有样品的代谢物)，一共提取到631种物质。设定Ratio值＞20或＜0.5、P值＜0.01进行差异性代谢物的筛选，图5为筛选后的差异性代谢物，对应图3枣花蜜样本组与糖浆样本组的PCA得分图，图5中第一主成分有半部分的点为枣花蜜样本组的差异性代谢物，因此从这些点中寻找枣花蜜样本的标志性代谢物，将筛选出的点现代回原始总离子流图进行假阳性离子的排除，在阴阳离子模式下对找到的标志性代谢物分子离子准确质量数进行匹配，最终找到枣花蜜潜在的标志性代谢物：褪黑激素、N-乙酰羟色胺、亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸、对香豆酸、肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸、白杨素。表1为枣花蜜样本标志性代谢物分子离子信息。
表1枣花蜜样本标志性代谢物分子离子信息表
表中上标1为[M+NH4]+，上标2为[M+H-H2O]+
枣花蜜标志性代谢物的鉴定
对枣花蜜潜在的标志性代谢物进行定性，HCD高能碰撞池设定50、100、150三个能量下进行二级碎裂，寻找枣花蜜标志性代谢物的碎片离子。表2为枣花蜜标志性代谢物的碎片离子信息表。枣花蜜样本的每个标志性代谢物都至少获得一个碎片离子，可以满足对代谢物的定性要求，因此枣花蜜样本的标志性代谢物为：褪黑激素、N-乙酰羟色胺、亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸、对香豆酸、肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸、白杨素。通过四极杆-轨道阱高分辨质谱的二级质谱设定高能碰撞诱导裂解技术(HCD)可获得枣花蜜标志性代谢物碎片离子的质谱图。其中褪黑激素在HCD高能碰撞池能量设定为50时获得两个碎片离子，质核比为86.06047的离子为含有羰基的支链形成的碎片离子，118.06503为掉支链后获得的碎片离子。N-乙酰羟色胺在HCD设定为50时获得质核比144.08087，掉羟基和从支链上的仲氨与亚甲基处断裂后形成的碎片离子；在HCD能量设定为150时获得失去支链与羟基后的环状结构形成的碎片离子，质核比为118.06058。亮氨酸在能量设定为100时获得两个碎片离子，质核比为86.09691的离子为掉羧基后的碎片离子，69.03431为掉羧基和氨基后的碎片离子。酪氨酸在HCD设定为50时获得两个碎片离子质核比为136.07536和109.06509，136.07536为掉羧基后的碎片离子，109.06509为掉氨基羧甲基基团后的碎片离子；在HCD能量设定为100时获得质核比为95.04945苯酚基团碎片离子。脯氨酸只在HCD能量设定为50时获得一个质核比为72.08139，为掉羧基后的碎片离子。对香豆酸在HCD能量设定为50时获得三个碎片离子，质核比分别为109.07584、95.04949、73.02905，其中109.07584为从支链上的双键处断裂后形成的碎片离子，95.04949为苯酚基团碎片离子，73.02901为丙烯酸基团碎片离子。肉桂酸在HCD能量设定为50时获得两个碎片离子，质核比分别为104.05772和91.05469，91.05463为甲苯基团碎片离子，121.03979为苯环上支链上的双键处断裂形成的碎片离子。4-甲氧基肉桂酸在HCD能量设定为50时也获得两个碎片离子，质核比分别为121.03979和91.05463，91.05463为甲苯基团碎片离子，121.03979为苯环上支链上的双键处断裂形成的碎片离子。白杨素在HCD能量设定为50和100时各获得一个碎片离子，质核比分别为147.04381、79.05477，147.04381为掉苯环和两个羟基后的碎片离子，79.05477为苯环基团碎片离子。
其中，本发明中的阴、阳离子模式条件：色谱条件相同，质谱条件包括正谱条件和负谱条件。
表2枣花蜜标志性代谢物碎片离子信息表
本实施例主要是对枣花蜜和大米糖浆的代谢物差异进行分析，区别于其他糖浆的标志性代谢物可采用与本实施例相同的方法进行研究。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种应用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱技术结合代谢组学方法鉴别枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜的分析方法，其特征是，包括以下步骤：
将真枣花蜜样品和与待检测的糖浆掺假枣花蜜样品分别采用有机溶剂进行前处理后，样品前处理中采用的有机溶剂是含有甲酸的甲醇和水的混合溶剂，应用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱方法实现对前处理后的样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到真枣花蜜样品与待测的枣花蜜样品的UHPLC-MS原始数据进行预处理，最后应用多元统计分析方法主成分分析(PCA)模型区分真枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜；
超高效液相色谱条件为：A相：乙腈，B相：醋酸铵水溶液，梯度洗脱流程：0-2min 1％A,2-3.25min 1％-5％A，3.25-4.25min 5％A,4.25-7.75min 5％-55％A,7.75-9.75min55％-90％A,9.75-11.75min 90％A,11.75-12min 90％-1％A,12-15min 1％A；流速：0.2～0.5mL/min，柱温30～37℃；
将得到的枣花蜜样品与糖浆掺假枣花蜜样品的UHPLC-MS原始数据采用CompoundsDiscoverer软件进行预处理，该预处理是指对总离子流图原始数据中的色谱峰的提取、峰对齐、去噪音、未知物的检测处理，得到各个峰的保留时间、峰高、峰面积和质荷比数据；然后通过多元统计分析方法PCA得分图的形式对区分结果进行展示。
2.如权利要求1所述的分析方法，其特征是：所述糖浆包括大米糖浆、玉米糖浆、甜菜糖浆或复合果葡糖浆。
3.如权利要求1所述的分析方法，其特征是：甲酸的体积分数为1％，甲醇和水为等体积混合形成混合溶剂；
样品前处理过程包括：将样品与有机溶剂混合至样品完全溶解，超声，离心，过有机滤膜，得到可上机检测的样品；其中，超声时间为10～30min；离心条件：800～1200rpm离心4～8min；有机滤膜的孔径为0.20～0.25μm；样品与有机溶剂的添加比例为1g：(15～25)mL。
4.如权利要求1所述的分析方法，超声时间为25min；离心条件：1000rpm离心5min；有机滤膜的孔径为0.22μm。
5.如权利要求1所述的分析方法，其特征是：所述醋酸铵水溶液的浓度为10mM，流速为0.3mL/min，柱温35℃，进样量3微升。
6.如权利要求1所述的分析方法，其特征是：正谱条件为：分辨率，70000；鞘气流速，40个单位；辅助气流速，10个单位；反吹气流速，0个单位；喷雾电压，3.5kV；毛细管温度，320℃；辅助气温度，350℃；扫描范围，m/z：70-1050；扫描模式：全扫描。
7.一种筛选区别于糖浆的真枣花蜜标志性代谢物的方法，其特征是，包括以下步骤：
对枣花蜜样品与糖浆分别采用有机溶剂进行前处理后，应用权利要求1～6中任一项所述的超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱方法实现对前处理后的样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到枣花蜜样品与糖浆的UHPLC-MS原始数据进行预处理，最后应用多元统计分析方法主成分分析模型进行差异化合物筛选，确定和鉴定标志性代谢物；
在获得载荷图时，通过设定Ratio＞20或＜0.5，P值＜0.01，来筛选潜在的标志性代谢物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征是：对筛选出来的潜在的标志性代谢物首先进行假阳性离子的排除，所述假阳性离子为返回总离子流图中提取不到色谱峰的物质；获得阳离子模式下的标志性代谢物信息，包括分子式，分子离子准确质量数以及保留时间，准确质量数的最大偏差在5ppm以内，保留时间偏差在0.2分钟内；同样的，根据获得的分子式，在阴离子模式下对潜在的标志性代谢物的分子离子进行提取，并根据阴阳离子模式下分子离子峰单位准确质量数对潜在的标志性代谢物进行推测，最终获得区别于糖浆的真枣花蜜标志性代谢物；
在鉴定标志性代谢物时，通过四极杆-轨道阱高分辨质谱的二级质谱设定高能碰撞诱导裂解技术(HCD)的高能碰撞池三个能量级来寻找标志性代谢物的碎片离子，从而实现对枣花蜜样本标志性代谢物的鉴定分析。
9.采用权利要求7或8所述的方法筛选得到的区别于大米糖浆的枣花蜜标志性代谢物，其特征是，所述标志性代谢物有以下化合物组成：褪黑激素、N-乙酰羟色胺、亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸、对香豆酸、肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸、白杨素。
10.权利要求9所述的区别于大米糖浆的枣花蜜标志性代谢物在鉴别大米糖浆掺假枣花蜜中的应用。
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