CN109142596A - 一种蜂蜜或蜂王浆真实性的识别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蜂蜜或蜂王浆真实性的识别方法,其是对待测蜂蜜或蜂王浆中的蛋白进行提取后,采用胰蛋白酶对所得蛋白进行酶解,再采用高效液相色谱‑四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱联用方法对所得酶解液进行检测,然后将检测结果与已知的蜜蜂蛋白质序列或蜂王浆蛋白质序列进行比较,以判定蜂蜜或蜂王浆的真实性。本发明采用高分辨质谱与蛋白质数据库分析技术,消除了同量异序同分异构化合物的干扰,能提高结果可靠性,为蜂蜜和蜂王浆的真伪鉴定提供了新的技术手段。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域,具体涉及一种基于多肽组成分离鉴定识别蜂蜜或蜂王浆真实性的方法。
背景技术
蜂蜜与蜂王浆营养丰富、功效明确,在我国被列为具有润肠通便及对化学性肝损伤有辅助保护功能的药食同源产品,长期以来深受人们喜爱。蜂产品生产经营中的造假售假问题一直是监管的重点和难点,目前依据食品安全标准尚无法直接判断。由于蜂产品货值高,而造假成本低,利润空间巨大,使得制假售假屡禁不止。
近年来各种真实属性的识别技术发展迅速,如通过采用同位素质谱技术检测C3/C4以确定蜂蜜中是否掺入C4植物源糖浆,液相色谱/质谱技术检测SM-R确定蜂蜜中是否掺入大米糖浆、液相色谱测定蜂王浆中喹烯酸等等,这些技术互为补充,一定程度上推动了蜂产业向良好的方向发展。
蜂蜜中蛋白含量约占0.2%~1.0%,主要来源蜜蜂及蜜源植物的花粉或花蜜;蜂王浆中蛋白更是占到了干物质的50 %以上。蜂产品中的蛋白是其特有的内标物,有较强的特异性。本发明提出了一种基于高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱联用方法分离鉴定蜂蜜与蜂王浆中肽的识别技术,通过与蛋白数据库进行相似性比较,可实现蜂蜜与蜂王浆真实属性的鉴别。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蜂蜜或蜂王浆真实性的识别方法,其能消除同量异序同分异构化合物的干扰,提高结果可靠性,为蜂蜜和蜂王浆的真伪鉴定提供了新的技术手段。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种蜂蜜或蜂王浆真实性的识别方法,具体包括以下步骤:
1)蜂蜜或蜂王浆中的蛋白提取:即按10-20mL/g的量在待测蜂蜜或蜂王浆中加入20wt%的TCA溶液,将其混合均匀后于-20℃放置30min以沉淀蛋白质,再经反复离心、超纯水洗涤后,将最终的沉淀物用超纯水溶解,冻干,得蜂蜜或蜂王浆蛋白冻干粉;
2)酶解:精密称取0.1mg步骤1)所得蜂蜜或蜂王浆的蛋白冻干粉,加入100μL 0.01 mg/mL的胰蛋白酶溶液和2mL 100mmol/L的Tris溶液,37 ℃酶解20~24 h后灭酶处理,再进行离心、洗涤,得酶解液;
3)检测:采用高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱联用方法对所得酶解液进行检测,其具体检测条件为:
色谱条件:Hypersil C18色谱柱,50mm×2.1mm×1.9μm;柱温:30℃;流动相:0.1wt%甲酸-乙腈;梯度洗脱程序为:0~50min,乙腈体积由10%变至90%,50~55 min,乙腈体积为90%,55~56 min,乙腈体积由90 %变为10 %并平衡5 min;流速:0.2mL/min;进样量:10μL;
质谱条件:扫描模式:Full MS/dd-MS2;离子化模式:正离子模式;扫描范围:150~2000m/z;一级质谱全扫描分辨率R=70000,C-trap最大容量(AGC target):l×106,C-trap最大注入时间:100ms;数据依赖二级子离子全扫描分辨率R=17500,C-trap最大容量(AGCtarget):l×105,C-trap最大注入时间:60ms;离子源温度300 ℃;传输金属毛细管温度:320 ℃;喷雾电压:3200 V;碰撞池采用梯度碰撞能量:25%、35%、55%;
4)识别:将检测结果与MaxQuant中记录的蜜蜂蛋白质序列或蜂王浆蛋白质序列进行比较,以判定蜂蜜或蜂王浆的真实性。
蜂蜜造假一般是加入低价植物糖浆,而蜂王浆造假则是掺入淀粉或乳品。由于物种的蛋白质组成具有特异性,且蛋白质的一级结构即使经加工处理仍能保持稳定,因而基于蛋白的分析方法可以用于掺假鉴定。
本发明提出的测定蜂蜜及蜂王浆多肽的分析技术,采用了高分辨质谱与蛋白质数据库分析技术,消除了同量异序同分异构化合物的干扰,在分析复杂基质中的样品时,能提高结果可靠性,为蜂蜜和蜂王浆的真伪鉴定提供了新的技术手段,可作为现有真伪识别方法的一种补充与验证。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解,下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明,但是本发明不仅限于此。
实施例1
1.1仪器与装置
高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪Q-Exactive(美国ThermoFisher公司);Dionex 3000高效液相色谱(美国ThermoFisher公司)。台式冷冻离心机(日立公司);冷冻干燥机(LABCONCO公司)。
1.2 材料与试剂
三氯乙酸、丙酮均为分析纯,购自国药集团;Tris购自生工生物工程股份有限公司;质谱测序级胰蛋白酶、色谱纯乙腈、甲酸、甲醇购自Thermo Fisher公司;C18 SPE柱,500mg/6mL (Supleco公司)。
1.2 样品制备
1.2.1蛋白提取
在文献内容(Rückriemen J, Hohmann C, Hellwig M, et al. Unique fluorescenceand high-molecular weight characteristics of protein isolates from manukahoney (Leptospermum scoparium).[J]. Food Research International, 2017, 99(Pt1):469)的基础上建立蜂蜜与蜂王浆的提取方法:即称取蜂蜜约5g或蜂王浆约1 g,加入20mL 20%三氯乙酸(TCA)溶液,涡流振动1 min使其混合均匀,然后于-20℃放置30min以沉淀蛋白质,而后于4 ℃、10000 r/min离心10 min,弃去上清液,以10 mL超纯水洗涤沉淀,再次离心。重复2次洗涤步骤,将最终的沉淀物溶解在2 mL超纯水中,于-50℃冻干。
1.2.2胰蛋白酶酶解
称取20μg胰蛋白酶,加入20μL 50 mmol/L乙酸溶解,配制成1 mg/mL的溶液,并用100mmol/L Tris稀释至浓度为0.01 mg/mL,得胰蛋白酶溶液。称取0.1mg(精确至0.01 mg)样品蛋白冻干粉于10mL离心管中,加入100μL胰蛋白酶溶液和2mL 100mmol/L的Tris溶液,37 ℃酶解20~24 h后取出,于沸水浴中处理10 min以灭酶活,然后于4℃、10000 r/min离心10min,取上清液。于离心管中再加入1mL 1mmol/L Tris溶液,重复离心一次,合并上清液备用。
1.2.3净化
先后用3 mL甲醇、3 mL水、3 mL Tris溶液活化C18 SPE柱,取上清液过柱,5 mL甲醇洗脱,收集洗脱液,45 ℃下氮吹至近干,加入1 mL0.1%甲酸水溶液溶解,过0.45μm滤膜,待测。
1.3 试验条件
1.3.1.色谱条件
Hypersil C18色谱柱,50mm×2.1mm×1.9μm;柱温:30℃;流动相:0.1%甲酸-乙腈;梯度洗脱程序为:0~50min,乙腈体积由10%变至90%,50~55 min,乙腈体积为90%,55~56 min,乙腈体积由90 %变为10 %并平衡5 min;流速:0.2mL/min;进样量:10μL。
1.3.2质谱条件
扫描模式:Full MS/dd-MS2;离子化模式:正离子模式;扫描范围:150~2000 m/z;一级质谱全扫描分辨率R=70000,C-trap最大容量(AGC target):l×106,C-trap最大注入时间:100ms;数据依赖二级子离子全扫描分辨率R=17500,C-trap最大容量(AGC target):l×105,C-trap最大注入时间:60ms;离子源温度300 ℃;传输金属毛细管温度:320 ℃;喷雾电压:3200 V;碰撞池采用梯度碰撞能量:25%、35%、55%。
1.4 数据分析
采用MaxQuant(版1.6.1.0)进行数据分析。MaxQuant搜索是针对包含来自Uniport的蜜蜂(uniprot-apis.fasta)的67051种蛋白质序列,蜂王浆(uniprot-royal jelly .fasta)的4602种蛋白质序列(2018年4月17日下载,https://www.uniprot.org/)数据库执行的。蛋白FDR设置为0.01;最小氨基酸长度设置为3;可变修饰设为N-Acetyl 和Oxidation(M);固定化修饰设置为Carbamidomethyl(C);酶的设置分别选择非专一性和专一性,其中专一性酶设置为胰蛋白酶,最大裂解丢失设置为2。
结果
经分析,确定了113个来自蜂蜜的胰蛋白酶肽和171个来自蜂王浆的胰蛋白酶肽,基于注释的分子功能,将来自蜂蜜的蛋白分为4类:酶(占比13.1%)、未知功能蛋白(占比14.9%)、组蛋白(占比3.3%);MRJPs(Major royal jelly proteins,主要王浆蛋白)(占比68.7%)。将来自蜂王浆的蛋白分为3类:酶(占比4.4%)、未知功能蛋白(占比4.4%)、MRJPs/黄蛋白(Yellow Protein)(占比91.2%)。
对蜂蜜及蜂王浆样品分别进行6次重复分析,鉴定得到共同具有的肽段分别为36个及41个(分别见表1、2)。在重复鉴定得到的共有肽段中,蜂王浆全部为MRJPs;蜂蜜中的86%为MRJPs,此外还有5.6%为β-葡萄糖苷酶,其余为未知功能蛋白。有研究表明,蜂蜜中的β-葡萄糖苷酶主要来源于蜜蜂,β-葡萄糖苷酶可能由蜜蜂的咽下腺产生并分泌到口器从而传递到蜂蜜中,即蜜蜂在采集加工的过程中添加了这种酶,故可以含有β-葡萄糖苷酶作为识别蜂蜜真实性的指标之一。
表1 蜂蜜胰蛋白酶解肽段序列
表2 蜂王浆胰蛋白酶解肽段序列
实施例2
取两种依据国家标准GB 18932.1-2002“蜂蜜中碳-4植物糖含量测定方法 稳定碳同位素比率法”确定为掺假的蜂蜜(蜂蜜1530中碳-4植物糖含量为36%、蜂蜜6344中碳-4植物糖含量为68%,均大于7%的阈值),根据实施例1所述方法进行检测,并将检测结果在Uniport的蜜蜂(uniprot-apis.fasta)与蜂王浆(uniprot-royal jelly .fasta)蛋白质序列进行搜索,掺假蜂蜜的胰蛋白酶解肽段序列数据分别见表3、表4。
表3 掺假蜂蜜6344中胰蛋白酶解肽段序列
表4 掺假蜂蜜1530中胰蛋白酶解肽段序列
由表3、表4可见,掺假蜂蜜的蛋白序列中未能检出MRJPs(Major royal jellyproteins,主要王浆蛋白)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (4)
1.一种蜂蜜或蜂王浆真实性的识别方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)对待测蜂蜜或蜂王浆中的蛋白进行提取;
2)采用胰蛋白酶溶液对步骤1)所得蛋白进行酶解;
3)采用高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱联用方法对所得酶解液进行检测;
4)将检测结果与已知的蜜蜂蛋白质序列或蜂王浆蛋白质序列进行比较,以判定蜂蜜或蜂王浆的真实性。
2.根据权利要求1所述蜂蜜或蜂王浆真实性的识别方法,其特征在于:步骤1)中待测蜂蜜或蜂王浆中蛋白的提取方法为:按10-20mL/g的量在待测蜂蜜或蜂王浆中加入20wt%的TCA溶液,将其混合均匀后于-20℃放置30min以沉淀蛋白质,再经反复离心、洗涤,得蜂蜜或蜂王浆蛋白。
3. 根据权利要求1所述蜂蜜或蜂王浆真实性的识别方法,其特征在于:步骤2)中所述酶解是在蜂蜜或蜂王浆的蛋白中加入胰蛋白酶溶液和Tris溶液,37 ℃酶解20~24 h后灭酶处理,再进行离心、洗涤。
4.根据权利要求1所述蜂蜜或蜂王浆真实性的识别方法,其特征在于:步骤3)中所述高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱联用方法的具体检测条件为:
色谱条件:Hypersil C18色谱柱,50mm×2.1mm×1.9μm;柱温:30℃;流动相:0.1wt%甲酸-乙腈;梯度洗脱程序为:0~50min,乙腈体积由10%变至90%,50~55 min,乙腈体积为90%,55~56 min,乙腈体积由90 %变为10 %并平衡5 min;流速:0.2mL/min;进样量:10μL;
质谱条件:扫描模式:Full MS/dd-MS2;离子化模式:正离子模式;扫描范围:150~2000m/z;一级质谱全扫描分辨率R=70000,C-trap最大容量:l×106,C-trap最大注入时间:100ms;数据依赖二级子离子全扫描分辨率R=17500,C-trap最大容量:l×105,C-trap最大注入时间:60ms;离子源温度300 ℃;传输金属毛细管温度:320 ℃;喷雾电压:3200 V;碰撞池采用梯度碰撞能量:25%、35%、55%。
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PB01 | Publication | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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