CN111721870A - 一种高通量筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高通量筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，通过将样品用蒸馏水超声提取的提取液用大孔吸附树脂柱层析进行分离，用蒸馏水和不同浓度梯度的乙醇溶液进行梯度洗脱，按极性不同收集洗脱液，浓缩得各干膏状样品；采用体外乙酰胆碱酯酶抑制活性的检测方法考察各干膏状样品对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，并选择强活性的洗脱部位作为供试品溶液；将供试品溶液与乙酰胆碱酯酶孵育后通过超滤薄膜，以磷酸盐缓冲液配合离心清洗超滤薄膜并弃滤液；以有机溶剂配合离心清洗超滤薄膜并收集滤液，从该滤液中最终分离并鉴定出乙酰胆碱酯酶抑制剂。本发明方法具有快速、高效、灵敏度高、样品/酶消耗量低、高通量以及目标受体可以多次反复使用等特点。

Description

一种高通量筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法
技术领域
本发明属于药物分析化学领域，尤其涉及一种从天然药物中高通量筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是老年人最常见的痴呆形式，以丧失记忆和认知功能为特征，严重影响着人类的身体健康和生活质量。根据《2018年世界阿尔茨海默病报告》指出，估计全球有4400万人患有痴呆症，预计到2050年，全球阿尔茨海默病发病率将增加两倍，AD已成为继肿瘤、心脏病、脑血管病之后引起老年人死亡的第4大病因。研究表明，AD患者中除1％～5％的病例发生基因突变外，人们普遍认为AD患者的认知障碍是由于大脑皮层和某些皮质下区域胆碱能神经元的丧失，由此导致的胆碱能神经传递的损伤。目前，大多数可用的药物是乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEIs)，FDA批准上市的抑制剂有多奈哌齐、加兰他敏、利斯的明和塔克林。虽然，它们是临床上最常用的缓解AD症状的药物，但是，这些药物疗效有限、价格昂贵、并易引起患者胃、肝和肠道等不适的副作用，严重地制约了其应用。
乙酰胆碱酯酶(AChE)是羧酸酯酶家族中的一种水解酶，其功能是水解突触间隙中的神经信号信使乙酰胆碱(ACh)，进而导致胆碱能神经传递的终止。20世纪70年代中期出现的“胆碱缺乏假说”认为，基底前脑投射到皮层和海马的胆碱能神经元的丧失，也以胆碱乙酰转移酶(ChAT)和乙酰胆碱能神经元(ACh)的减少为标志，是AD记忆丧失和认知障碍的原因。因此，抑制乙酰胆碱酯酶可增加海马中乙酰胆碱的含量，使海马M1型乙酰胆碱受体激动化，从而导致与淀粉样前体蛋白加工、神经保护、学习记忆相关的下游调控。因此，乙酰胆碱酯酶被认为是干预阿尔茨海默病重要的药物靶点之一。
近年来，从天然药物(如中药)中筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂，已经成为了医药领域的研究热点，如研究表明花椒叶提取物、人参根茎提取物和黄连提取物等对乙酰胆碱酯酶(AChE)具有显著的抑制作用，以及石杉碱甲(天然植物碱)是一种有效的乙酰胆碱酯酶抑制剂，在中国已被证明用于治疗阿尔茨海默病。目前，国内外在乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究方面，主要是体外乙酰胆碱酯酶抑制活性和体内动物模型的研究方法，考察样品粗提物对乙酰胆碱酯酶的抑制情况。然而，该方法只能得出样品粗提物是否有抑制活性，以及抑制性的强弱，无法明确到具体是哪一类或哪一种药效成分具有抑制作用；并且，如果已知了活性成分的信息，仍需要进行多次的分离纯化，工艺繁琐复杂，样品和溶剂消耗量大，劳动强度大，且不适用于多种成分的同时筛选。
因此，建立快速、高效、高灵敏度、低样品消耗、高通量的方法，从天然药物提取物中同时筛选和鉴定多种乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，具有重要的科学价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从天然药物中高通量筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，旨在解决现有乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选方法存在的工艺繁琐复杂、样品和溶剂消耗量大、劳动强度高、不适用于多种成分的同时筛选等问题。
本发明是这样实现的，一种高通量筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将100g样品用600mL蒸馏水超声提取1～2次，合并提取液并浓缩得浸膏；将浸膏用100mL～150mL蒸馏水溶解后转移到大孔吸附树脂柱层析进行分离，用蒸馏水和不同浓度梯度的乙醇溶液进行梯度洗脱，按极性不同收集洗脱液，浓缩得各干膏状样品；
(2)采用体外乙酰胆碱酯酶抑制活性的检测方法考察各干膏状样品对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，并选择强活性的洗脱部位作为供试品溶液；
(3)将100～400μL浓度为5.0～20mg/mL的供试品溶液与100～400μL浓度为5～20U/mL的乙酰胆碱酯酶在35～37℃下孵育15～30min，将孵育液通过超滤薄膜；以200～600μL磷酸盐缓冲液配合离心方式清洗超滤薄膜2～3次并弃滤液；以200～600μL有机溶剂配合离心方式清洗超滤薄膜2～3次并收集滤液，从该滤液中分离并鉴定出乙酰胆碱酯酶抑制剂。
优选地，在步骤(1)中，所述原料包含至少一种以下活性化合物：1,6-二-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖，1,4-二-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖，3,6-二-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖，1,2,6,-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖，1,3,6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖，3,4,6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖，1,3,4,6-四-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖，诃子宁，柯里拉京，鞣花酸，诃子勒酸，诃子林勒酸，以及老鹤草素。
优选地，所述原料为诃子。
优选地，在步骤(2)中，在所述检测方法中，以碘代硫代乙酰胆碱为底物，二硫二硝基苯甲酸为显色剂；其中，乙酰胆碱酯酶活性抑制率的计算公式为：
抑制率(％)＝1-(As-Abs)/(Ac-Abc)
式中，Ac表示不加测试样品的吸光度；Abc表示不加酶和测试样品的吸光度；As表示加入测试样品和酶的吸光度；Abs表示不加酶的吸光度。
优选地，在步骤(3)中，所述超滤薄膜的截留分子量为10～100kDa；在以磷酸盐缓冲液以及有机溶剂清洗超滤薄膜的过程中，所述离心的转速为10000～12000rpm、时间为10～15min。
优选地，在步骤(3)中，所述从该滤液中分离并鉴定出乙酰胆碱酯酶抑制剂的过程中，通过高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术从该滤液中分离并鉴定出乙酰胆碱酯酶抑制剂。
优选地，在所述高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术中各参数的设置条件为：色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(3mm×150mm，1.8μm)，柱温：35℃；流动相：0.1％甲酸-乙腈(A)和01％甲酸-水(B)，流速：0.250mL/min；梯度程序设置如下：0min，5％A；5min，15％A；30min，35％A；32min，5％；进样量：3μL；质谱条件：Agilent Q-TOF 6545飞行时间质谱，扫描范围：m/z 100～1500，干燥气温度：350℃，干气(N2)流速：12.0L/min，碎片电压：130V，毛细管电压：3500V，碰撞能(CE)：10～60eV。
优选地，在步骤(3)中，所述有机溶剂为体积分数为30％～100％的甲醇溶液。
本发明克服现有技术的不足，提供一种从天然药物中高通量筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，本发明首先采用体外乙酰胆碱酯酶抑制活性检测方法考察样品提取液的抑制活性，从中选取抑制活性较强的组分作为供试品；其次，根据配体(活性小分子化合物)与受体(乙酰胆碱酯酶)的亲和结合反应原理，利用超滤膜的截留作用，从样品中筛选得到能够与乙酰胆碱酯酶亲和结合的活性小分子化合物，再通过高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术分离和结构鉴定，得到乙酰胆碱酯酶的天然抑制剂；最后，通过体外乙酰胆碱酯酶抑制活性方法，验证被筛选配体化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，以及通过autodock软件进行分子对接，进一步模拟及预测小分子化合物与乙酰胆碱酯酶的结合位点及亲和结合力。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明方法具有快速、高效、灵敏度高、样品/酶消耗量低、高通量以及目标受体可以多次反复使用等特点，适用于从天然药物提取物中同时筛选和鉴定多种乙酰胆碱酯酶抑制剂；
(2)与合成药物相比，本发明方法筛选得到的乙酰胆碱酯酶抑制剂具有价格低廉、绿色安全、毒副作用小等优点。
附图说明
图1本发明实施例中诃子提取液对乙酰胆碱酯酶的抑制活性；
图2本发明实施例中总离子色谱对比图；其中，图2A为未经超滤的诃子提取液的总离子流色谱图，图2B为诃子提取液与活性乙酰胆碱酯酶孵育并经超滤后的总离子色谱图，图2C为诃子提取液与非活性乙酰胆碱酯酶孵育并经超滤后的总离子色谱图；
图3本发明实施例中筛选得到的活性成分柯里拉京的质谱图；
图4本发明实施例中分子对接预测柯里拉京与乙酰胆碱酯酶的结合位点。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
1、样品的制备
将100g诃子用600mL蒸馏水超声提取1～2次，合并提取液并浓缩得浸膏；将浸膏用100mL～150mL蒸馏水溶解后转移到大孔吸附树脂柱层析进行分离，用蒸馏水和不同浓度梯度的乙醇溶液(5％～100％)进行梯度洗脱，按极性不同收集洗脱液，浓缩得各干膏状样品。
诃子提取液(中药提取液)含有大量的化学成分，将提取液通过大孔吸附树脂进行梯度洗脱的目的是按照化合物的不同极性，进行分离纯化，不同梯度洗脱得到不同极性的洗脱部位(洗脱部位就是洗脱下来收集得到的溶液，也就是得到不同极性的几大类化合物的洗脱液)，洗脱部位与洗脱梯度的关系就是用不同梯度的溶液(5％～100％乙醇)洗脱就会得到不同的洗脱部位。
2、不同洗脱部位对酶抑制活性的检测
采用体外乙酰胆碱酯酶抑制活性的检测方法(详见文献：“Zhao HQ,Zhou SD,Zhang MM,et al.An in vitro AChE inhibition assay combined with UF-HPLC-ESI-QTOF/MS approach for screening and characterizing of AChE inhibitors fromroots of Coptis chinensis Franch[J].Journal of Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis,2016,120:235-240”以及文献：“Ning ZW,Zhai LX,Huang T,etal.Identification ofα-glucosidase inhibitors from Cyclocarya paliurus tealeaves using UF-UPLC-Q/TOF-MS/MS and molecular docking[J].Food Function,2019,10(4):1893-1902”)，以碘代硫代乙酰胆碱(ATCI)为底物，二硫二硝基苯甲酸(DTNB)为显色剂，考察诃子提取液不同洗脱部位对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，得到活性较强的洗脱部位作为供试品溶液。其中，乙酰胆碱酯酶活性抑制率的计算公式为：
抑制率(％)＝1-(As-Abs)/(Ac-Abc)
式中，Ac表示不加测试样品的吸光度；Abc表示不加酶和测试样品的吸光度；As表示加入测试样品和酶的吸光度；Abs表示不加酶的吸光度。
通过不同洗脱部位对酶抑制活性的检测，优选出其中一个洗脱部位(或一类化合物)对乙酰胆碱酯酶具有较强的抑制活性，如图1所示，诃子提取液(其中抑制效果最强的洗脱部位)对乙酰胆碱酯的半数最大抑制浓度(IC50)值为0.34±0.02mg/mL，这表明这一洗脱部位可能富含潜在的乙酰胆碱酯酶抑制剂。因此，非常有必要进一步筛选和鉴定这一部位的活性化合物。
3、超滤质谱筛选及鉴定活性成份
将100～400μL浓度为5.0～20mg/mL的供试品溶液与200～400μL浓度为5～20U/mL的乙酰胆碱酯酶在35～37℃下孵育15～30min，将孵育液通过截留分子量为10～100kDa的超滤薄膜；以200～600μL磷酸盐缓冲液配合在10000～12000rpm转速下离心10～15min的方式清洗超滤薄膜2～3次并弃滤液；以200～600μL体积分数为30％～100％的甲醇溶液配合在10000～12000rpm转速下离心10～15min的方式清洗超滤薄膜2～3次并收集滤液，通过高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术对该滤液进行分离并鉴定得到乙酰胆碱酯酶抑制剂。其中，高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术具体为：A、色谱条件：色谱柱：ZORBAX EclipsePlus C18色谱柱(3mm×150mm，1.8μm)，柱温：35℃，流动相：0.1％甲酸-乙腈(A)和01％甲酸-水(B)，流速：0.250mL/min。梯度程序设置如下：0min，5％A；5min，15％A；30min，35％A；32min，5％。进样量：3μL。
B、质谱条件：Agilent Q-TOF 6545飞行时间质谱，扫描范围：m/z 100～1500，干燥气温度：350℃，干气(N2)流速：12.0L/min，碎片电压：130V，毛细管电压：3500V，碰撞能(CE)：10～60eV。
结果如图2所示，诃子提取液与活性/非活性乙酰胆碱酯酶孵育并经超滤后，共筛选出13个色谱峰，说明这13个化合物很有可能是潜在的天然乙酰胆碱酯酶抑制剂。
筛选出的化合物通过飞行时间质谱进行结构鉴定，结果如图3所示，经鉴定5号色谱峰为柯里拉京。
4、验证被筛选化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性
按照上述步骤2所描述的方法，通过体外酶抑制活性方法检测被筛选化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制率，进而验证被筛选化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，验证结果显示被筛选的化合物诃子林勒酸，1,3,6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖，柯里拉京，诃子勒酸和诃子宁均具有较好地抑制乙酰胆碱酯酶的活性，其半数抑制浓度(IC50)分别为0.42±0.03mM,0.46±0.03mM,0.49±0.04mM,0.50±0.02mM和0.52±0.02mM。这说明超滤-高效液相-飞行时间质谱联用技术从诃子提取液中筛选并鉴定乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法是有效的和可靠的。
5、验证被筛选化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性
运用autodock软件进行分子对接，模拟并预测活性小分子化合物与乙酰胆碱酯酶的结合位点及亲和结合力，结果如图4所示，柯里拉京能够很好的进入乙酰胆碱酯酶模型的结合口袋，从而抑制酶的活性。柯里拉京与乙酰胆碱酯酶的亲和结合力为-9.3kcal/mol，这说明被筛选的化合物(柯里拉京)具有抑制乙酰胆碱酯酶的活性，它可以作为一种潜在的天然乙酰胆碱酯酶抑制剂。
通过体外酶抑制活性检测和分子对接验证结果显示，本发明适用于从天然药物提取物中同时筛选和鉴定多种乙酰胆碱酯酶抑制剂。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种高通量筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将100g样品用600mL蒸馏水超声提取1～2次，合并提取液并浓缩得浸膏；将浸膏用100mL～150mL蒸馏水溶解后转移到大孔吸附树脂柱层析进行分离，用蒸馏水和不同浓度梯度的乙醇溶液进行梯度洗脱，按极性不同收集洗脱液，浓缩得各干膏状样品；
(2)采用体外乙酰胆碱酯酶抑制活性的检测方法考察各干膏状样品对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，并选择强活性的洗脱部位作为供试品溶液；
(3)将100～400μL浓度为5.0～20mg/mL的供试品溶液与100～400μL浓度为5～20U/mL的乙酰胆碱酯酶在35～37℃下孵育15～30min，将孵育液通过超滤薄膜；以200～600μL磷酸盐缓冲液配合离心方式清洗超滤薄膜2～3次并弃滤液；以200～600μL有机溶剂配合离心方式清洗超滤薄膜2～3次并收集滤液，从该滤液中分离并鉴定出乙酰胆碱酯酶抑制剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述原料包含至少一种以下活性化合物：1,6-二-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖，1,4-二-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖，3,6-二-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖，1,2,6,-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖，1,3,6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖，3,4,6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖，1,3,4,6-四-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖，诃子宁，柯里拉京，鞣花酸，诃子勒酸，诃子林勒酸，以及老鹤草素。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述原料为诃子。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，在所述检测方法中，以碘代硫代乙酰胆碱为底物，二硫二硝基苯甲酸为显色剂；其中，乙酰胆碱酯酶活性抑制率的计算公式为：
抑制率(％)＝1-(As-Abs)/(Ac-Abc)
式中，Ac表示不加测试样品的吸光度；Abc表示不加酶和测试样品的吸光度；As表示加入测试样品和酶的吸光度；Abs表示不加酶的吸光度。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述超滤薄膜的截留分子量为10～100kDa；在以磷酸盐缓冲液以及有机溶剂清洗超滤薄膜的过程中，所述离心的转速为10000～12000rpm、时间为10～15min。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述从该滤液中分离并鉴定出乙酰胆碱酯酶抑制剂的过程中，通过高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术从该滤液中分离并鉴定出乙酰胆碱酯酶抑制剂。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术中各参数的设置条件为：色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(3mm×15 0mm，1.8μm)，柱温：35℃；流动相：0.1％甲酸-乙腈(A)和0 1％甲酸-水(B)，流速：0.250mL/min；梯度程序设置如下：0min，5％A；5min，15％A；30min，35％A；32min，5％；进样量：3μL；质谱条件：Agilent Q-TOF 6545飞行时间质谱，扫描范围：m/z 100～1500，干燥气温度：350℃，干气(N2)流速：12.0L/min，碎片电压：130V，毛细管电压：3500V，碰撞能(CE)：10～60eV。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述有机溶剂为体积分数为30％～100％的甲醇溶液。
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