CN111303263B - 地龙特征多肽及其在地龙药材种属鉴别中的应用 - Google Patents

地龙特征多肽及其在地龙药材种属鉴别中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组地龙特征多肽及其在地龙药材种属鉴别中的应用。本发明中的5个特征多肽具有较好的专属性及稳定性，能够在其对应物种地龙样品中稳定检测到，而在其非对应品种地龙，包括威廉环毛蚓、加州腔蚓、直隶腔蚓及多肉远盲蚓等品种中均检测不到。本发明中的5个特征多肽具有极好的代表性，能够区分市场绝大部分地龙药材品种，正品鉴别率可以达到96％，具有较好的应用前景。

Description

地龙特征多肽及其在地龙药材种属鉴别中的应用
技术领域
本发明属于中药材鉴别技术，特别是涉及一组地龙特征多肽及其在地龙药材种属鉴别中的应用。
背景技术
地龙是一种常用的动物药，具有清热止痉、平肝熄风、通经活络、平喘利尿的功效。2015年版《中国药典》规定地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillumE.Perrier、通俗环毛蚓P.vulgaris Chen、威廉环毛蚓P.guillelmi Michaelsen或栉盲环毛蚓P.pectinifera Michaelsen的干燥体[1]。但是地龙种类繁多，截至2010年，中国的陆地蚯蚓就已达到328种[2]。另外，地龙形态较相似，很难仅凭肉眼进行分类鉴别，药农不能区分地龙药原动物与其品种，从而导致目前市场流通的地龙饮片正伪品混杂[3]。最近的调查研究显示，市场上约22％的基原物种为参环毛蚓，22％为通俗环毛蚓，稀见栉盲环毛蚓和威廉环毛蚓(<1％)，而55％的市售地龙均非2015年版《中国药典》规定基原，以保宁腔蚓(Metaphire magna Chen)为主[4]。使用非药典来源的品种，可能带来不确定的临床疗效给患者留下健康隐患，同时也制约着相关中成药工业的发展，这也是近年来中药现代化发展进程中所遇到的瓶颈问题。
2015年版《中国药典》中使用显微和薄层色谱(TCL)的方法对地龙药材进行鉴定分析[1]。郭利霄等[5]提出微性状鉴别的方法对市场上地龙及其混伪品进行鉴定区分，总结出市场上主要地龙药材品种的微性状特征。另外，多种DNA方法也用于地龙的分子鉴别研究，韦健红等[6]对广地龙COI和16S rRNA片段进行测序，建立了快速、准确和标准化的广地龙DNA分子标记鉴别方法；陈维明等[7]通过比对12S rRNA序列，设计并筛选出的高特异性鉴别引物12St/12Sf用于鉴别广地龙及其混伪品。田娜等[8]基于多重特异性PCR技术，建立了一种快速、准确的地龙DNA分子鉴别方法。
显微和薄层色谱(TCL)缺乏专属性和特异性，难以对不同的地龙物种进行鉴定区分。基于地龙形态性状进行鉴定的方法可靠性差，一方面蚯蚓在不同年龄阶段、不同的生殖阶段，其形态学特征都会发生变化[3]；另一方面地龙药材在加工过程中其内脏形态、雄孔、交配腔等主要鉴别特征常遭损坏，体色和表面纹理特征在干燥时也常消失或发生改变[4]。DNA分子鉴别方法虽然准确，但是药材在清洗、干燥、贮藏等过程中，会导致DNA的严重降解，还有微生物引起的外源性DNA污染，这些都会使提取的DNA含量低且质量不高，难以进行后续的分子鉴定[9]。另一方面，中药最终是以中成药或者饮片、配方颗粒的形式给药，在这些使用中，形态和DNA均有破坏，上述常规方法均无法很好应用。本申请考虑到特征多肽用于地龙物种鉴定具有以下独特的优势：一方面蛋白多肽类成分是地龙中的主要成分，占比达到55％-60％，同样也是其活性成分，具有抗凝血、抗脑卒中、抗菌、抗纤维化等多方面的药理作用[10]；第二，特征多肽具有较好的专属性，蛋白多肽由DNA编码生成，包含一定水平的遗传信息，具有良好的种属特异性，同时在同一物种中表达稳定[11]；第三，特征多肽可用于中药制剂(配方颗粒、中成药)来源的鉴别，蛋白多肽类成分在中药制剂制备过程中被富集，虽然空间构型可能被破坏，但是氨基酸序列依然存在，因此特征肽可用于制剂来源的鉴别。由此，本申请创造性的提出了一种基于特征多肽的地龙药材种属鉴别方法。
参考文献：
[1]中国药典委员会.中华人民共和国药典2015版一部[M].北京:中国医药科技出版社,2015.
[2]徐芹,肖能文.中国陆栖蚯蚓[M].北京:中国农业出版社,2010:17.
[3]彭香怡,吴逸昕,宋羽葳,等.地龙药原动物探讨[J].现代生物医学进展,2014,14(26):5184-5188.
[4]格小光,蒋超,田娜,等.基于DNA测序技术的市售地龙类药材基原调查与考证研究[J].中国现代中药,2019,21(9):1206-1214.
[5]郭利霄,王乾,张丹,等.不同产地地龙药材的微性状鉴别及品质研究[J].中药材,2018,407(01):71-74.
[6]韦健红,李薇,吴文如,等.基于COI与16SRNA基因对广地龙的DNA分子鉴定研究[J].中国药房,2012,23(35):3274-3278.
[7]陈维明,马梅,龚玲,等.广地龙特异性PCR分子鉴定[J].广州中医药大学学报,2015,32(3):499-503,507.
[8]田娜,魏艺聪,袁媛,等.地龙的多重位点特异性PCR鉴别[J].中国实验方剂学杂志,2019(17):124-129.
[9]韦健红.地龙类药材DNA条形码分子鉴定的研究[D].广州中医药大学,2012.
[10]刘巧,毕启瑞,谭宁华.地龙蛋白多肽类成分的研究进展[J].中草药,2019,50(01):255-264.
[11]Buckley M.Species identification of bovine,ovine and porcine type1collagen；comparing peptide mass fingerprinting and LC-based proteomicsmethods[J].International Journal of Molecular Sciences,2016,17(4):445-462.
发明内容
发明目的：针对上述现有技术，本发明提供了一组地龙特征多肽及其在地龙药材种属鉴别中的应用。
技术方案：本发明所述的一组地龙特征多肽及其质谱采集离子对包括：
通俗环毛蚓特征多肽1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，质谱采集离子对：513.23-841.40；
通俗环毛蚓特征多肽2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，质谱采集离子对：441.26-367.73；
参环毛蚓特征多肽3，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，质谱采集离子对：440.74-668.32；
参环毛蚓特征多肽4，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，质谱采集离子对：505.83-199.12；
保宁腔蚓特征多肽5，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，质谱采集离子对：464.23-727.34。
其中：
SEQ ID NO：1AIGLDVGQPR通俗环毛蚓P.vulgaris Chen
SEQ ID NO：2FPLYLTK通俗环毛蚓P.vulgaris Chen
SEQ ID NO：3VLSEFSAK参环毛蚓P.aspergillum E.Perrier
SEQ ID NO：4LLLLSGIGPK参环毛蚓P.aspergillum E.Perrier
SEQ ID NO：5LSFEEFR保宁腔蚓(Metaphire magna Chen)
上述地龙特征多肽在地龙药材种属鉴别方面的应用也在本发明的保护范围内。
本发明还公开了一种基于上述特征多肽的地龙药材种属鉴别方法，包括以下步骤：
(1)对待测样本进行液-质前处理，获得待测多肽滤液；
(2)根据权利要求1或2所述特征多肽氨基酸序列合成特征多肽对照品；
(3)根据质谱法检测待测样本的多肽成分，将待测样本的质谱结果与特征多肽对照品的质谱谱图进行对比，具有相同谱图则判断为同一种属。
其中，步骤(1)所述液-质前处理是指：取待测地龙药材洗净剪碎，液氮研磨成细粉；称取地龙粉末加裂解液裂解，提取地龙蛋白；采用胰蛋白酶对提取得到的蛋白进行酶解得到多肽，对多肽进行脱盐处理，浓缩干燥后加复溶，离心取上清得到多肽滤液。
具体的，本发明所述基于上述特征多肽的地龙药材种属鉴别方法，包括以下步骤：
步骤一：用手术剪剪去地龙药材头、尾及生殖带等部位，得到中间段，使用超纯水将其泥土内脏等清洗干净，用滤纸将水吸干，室温自然风干后将其剪碎，加液氮快速研磨成细粉。
步骤二：精密称取地龙粉末100mg，加入含1％蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)的SDS蛋白裂解液，涡旋混匀，冰上裂解30min，高速离心机4℃，12000rpm离心10min，收集蛋白上清液。
步骤三：将蛋白上清液稀释至3mg/ml。吸取50μl该蛋白稀释液加入至10K超滤管(Millipore,Burlington,MA,USA)中，再加入300μl 8M尿素液洗涤两次，每次洗涤在14000g下离心20min，弃下层滤液。接着加入200μl还原缓冲液(10mM二硫苏糖醇(DTT)，8M尿素，100mM三乙铵-碳酸缓冲液(TEAB)，pH 8.0)37℃还原1h，再加入200μl 10mM碘乙酰胺，室温条件下暗处反应1h，之后14000g离心20min，弃下层滤液。再加入400μl 100mM TEAB洗涤两次，同样每次洗涤在14000g下离心20min。之后将超滤管转移至新的收集管中，加入100μl100mM TEAB对上层蛋白进行稀释，再加入50μl 40μg/ml测序级胰蛋白酶，置于37℃环境中，酶解12h。将酶解后样品14000g离心20min，再加入200μl 100mM TEAB洗涤两次，同样每次洗涤14000g离心20min。最后将收集管中的溶液冷冻干燥，得到多肽粉末。
步骤四：将多肽粉末完全溶解在1ml 0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液中，使用Sep-PakC18小柱(Waters,MA,U.S.A.)进行脱盐处理。首先对Sep-Pak C18小柱进行平衡：加入1ml甲醇(含0.1％TFA)冲洗一遍，再加入1ml 90％乙睛水溶液(含0.1％TFA)冲洗一遍，最后加入1ml 0.1％TFA水溶液冲洗一遍。接着上样，靠自然重力吸附三次。然后加入0.1％TFA冲洗三次。最后使用90％乙睛水溶液(含0.1％TFA)靠自然重力洗脱三次。三次洗脱的样品溶液合并，进行离心浓缩干燥。
步骤五：完全干燥后的样品加入150μl 0.1％甲酸溶液进行复溶，之后12000rpm，离心15min，取上清至进样瓶上机分析。
步骤六：另取根据特征多肽氨基酸序列合成的特征多肽对照品适量，精密称定，加0.1％甲酸溶液配制成每l ml含特征多肽60μg的混合溶液，12000rpm离心15min，取上清液待分析。
步骤七：使用配备电喷雾电离(ESI)的Waters Acquity UPLC H-Class-XEVO TQD液质联用仪进行分析。色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×100mm)。流动相A为0.1％(v/v)甲酸溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱：0～8min，5％-36％B；8～9min，36％–100％B；9～11min，100％B；11～12min，100％-5％B；12～15min，5％B。流速为0.3ml/min，进样量4μl。自动进样器和柱温分别保持在4℃和30℃。
质谱条件：干燥气体氮气，流量为650L/h；去溶剂温度450℃；锥形气体流速50L/h；离子源温度150℃；毛细管电压2500V；碰撞气体，氩气。电喷雾正离子模式(ESI+)进行多反应监测(MRM)，具体如表1。
表1地龙特征多肽MRM方法
Figure GDA0003620671150000051
步骤八：对检测结果进行分析，如果检测样品在对应的离子通道内检测到与对照品溶液中特征多肽1、2保留时间一致，子离子一致的峰，则表示该样品为通俗环毛蚓，为正品地龙；同样如果检测样品在对应的离子通道内检测到与对照品溶液中特征多肽3、4保留时间一致，子离子一致的峰，则表示该样品为参环毛蚓，也是正品地龙；如果检测样品在对应的离子通道内并未检测到上述1、2、3、4中任何一个特征肽对应的色谱峰，则表明该样品为地龙伪品药材的可能性在96％以上。同时，如果检测样品在对应的离子通道内检测到与对照品溶液中特征多肽5保留时间一致，子离子一致的峰，则表示该样品为保宁腔蚓，属于地龙伪品。
技术效果：本发明具有以下优势：第一，本发明中5个特征多肽具有较好的专属性及稳定性。能够在其对应物种地龙样品中稳定检测到，而在其非对应品种地龙，包括威廉环毛蚓、加州腔蚓、直隶腔蚓及多肉远盲蚓等品种中均检测不到。第二，本发明中的5个特征多肽具有极好的代表性，能够区分市场绝大部分地龙药材品种，正品鉴别率可以达到96％，具有较好的应用前景。
附图说明
图1是基于DNA条形码的地龙品种市场调查情况；
图2是五个地龙特征肽在三个地龙品种中的分布图，各特征多肽的氨基酸序列如下：1：AIGLDVGQPR；2：FPLYLTK；3：VLSEFSAK；4：LLLLSGIGPK；5：LSFEEFR；其中A：通俗环毛蚓；B：参环毛蚓；C：保宁腔蚓；D：五个特征肽的混标溶液；
图3是通俗环毛蚓特征多肽1、2在不同物种地龙样品中检测的色谱图；
图4是参环毛蚓特征多肽3、4在不同物种地龙样品中检测的色谱图；
图5是保宁腔蚓特征多肽5在不同物种地龙样品中检测的色谱图；
图6是实施例2的地龙药材鉴定结果。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实例进行详细描述。优选实例中没有注明具体的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件进行。
实施例1地龙特征多肽的检测获取
1、地龙品种市场调查
从市场随机收集到57批地龙药材样品，通过对各个样品进行DNA条形码鉴别，统计如图1所示，包含以下几个品种：参环毛蚓(9批，16％)、通俗环毛蚓(18批，32％)、威廉环毛蚓(1批，2％)、保宁腔蚓(16批，28％)、加州腔蚓(3批，5％)、多肉远盲蚓(2批，3％)、其他难以鉴别品种(8批，14％)。由此可见，三个品种(参环毛蚓、通俗环毛蚓、保宁腔蚓)共占市场所有地龙样品的76％；而参环毛蚓、通俗环毛蚓为正品地龙，占市场正品地龙的96％。
2、地龙特征多肽的发现及其轮廓分析
材料：基于地龙市场状况，挑选经DNA条形码鉴定的27批地龙药材进行研究，包括6批参环毛蚓、6批通俗环毛蚓、6批保宁腔蚓及9批其他品种地龙。所有地龙样品均保存于中国药科大学谭宁华教授课题组实验室。
试剂：SDS裂解液、苯甲磺酰氟(PMSF)购至碧云天；二硫苏糖醇(DTT)购至上海源叶生物技术有限公司；碘乙酰胺(IAA)和三乙铵-碳酸缓冲液(TEAB)购至Sigma-Aldrich，尿素由西陇科学提供，胰蛋白酶(测序级)购自Promega。根据5个特征多肽氨基酸序列合成的特征多肽对照品由上海万生昊天生物技术有限公司通过液相合成法制备获得，纯度>95％。
地龙样品制备：
(1)用手术剪剪去地龙药材头、尾及生殖带等部位，得到中间段，使用超纯水将其泥土内脏等清洗干净，用滤纸将水吸干，室温自然风干后将其剪碎，加液氮快速研磨成细粉。
(2)精密称取地龙粉末0.1g，加入含1％PMSF的SDS蛋白裂解液，涡旋混匀，冰上裂解30min，高速离心机4℃，12000rpm离心10min，收集蛋白上清液。
(3)精密吸取蛋白上清液稀释至3mg/ml。吸取50μl该蛋白稀释液加入至10K超滤管(Millipore,Burlington,MA,USA)中，再加入300μl 8M尿素液洗涤两次，每次洗涤在14000g下离心20min，弃下层滤液。接着加入200μl还原缓冲液(10Mm DTT，8M尿素，100mM TEAB，pH8.0)37℃还原1h，再加入200μl 10mM碘乙酰胺，室温条件下暗处反应1h，之后14000g离心20min，弃下层滤液。再加入400μl 100mM TEAB洗涤两次，同样每次洗涤在14000g下离心20min。之后将超滤管转移至新的收集管中，加入100μl 100mM TEAB对上层蛋白进行稀释，再加入50μl 40μg/ml测序级胰蛋白酶，置于37℃环境中，酶解12h。将酶解后样品14000g离心20min，再加入200μl 100mM TEAB洗涤两次，同样每次洗涤14000g离心20min。最后将收集管中的溶液冷冻干燥，得到多肽粉末。
(4)将多肽粉末完全溶解在1ml 0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液中，使用Sep-Pak C18小柱(Waters,MA,U.S.A.)进行脱盐处理。首先对Sep-Pak C18小柱进行平衡：加入1ml甲醇(含0.1％TFA)冲洗一遍，再加入1ml 90％乙睛水溶液(含0.1％TFA)冲洗一遍，最后加入1ml0.1％TFA水溶液冲洗一遍。接着上样，靠自然重力吸附三次。然后加入0.1％TFA水溶液冲洗三次。最后使用90％乙睛水溶液(含0.1％TFA)靠自然重力洗脱三次。三次洗脱的样品溶液合并，进行离心浓缩干燥。
(5)完全干燥后的样品加入150μl 0.1％甲酸水溶液进行复溶，之后12000rpm，离心15min，取上清至进样瓶上机分析。
仪器分析：
(1)消化的样品使用Dionex UltiMate 3000纳流液相色谱仪串联OrbitrapFusion Lumos高分辨质谱仪(Thermo Scientific)进行分析。色谱分析柱为AcclaimPepMap100 C18柱(5μm,75μm×25cm)。以含0.1％甲酸的2％乙腈为流动相A，含0.1％甲酸的80％乙腈为流动相B，梯度洗脱：0-5min，100％A；5-100min，100-55％A；100-110min，55-0％A；110-120min，0-100％A。流速为300nl/min，进样量为2μl。MS/MS参数设置如下：毛细管电压2.1kV；离子转移管温度为275℃；离子喷雾电压2200V；MS和MS2的Orbitrap分辨率分别为120000和17500；扫描范围300至2000m/z；四极隔离窗为2；采用高能诱导裂解(HCD)方式裂解，归一化碰撞能量30％。使用Thermo Scientific Proteome Discoverer 2.2软件进行蛋白质搜索。
(2)使用配备了电喷雾电离(ESI)的Waters Acquity UPLC H-Class-XEVO TQD系统进行UPLC-MRM分析。采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm，2.1×100mm)。流动相由0.1％的甲酸水溶液(A)和乙腈(B)组成。梯度设定如下：0～8min，5％-36％B；8～9min，36％–100％B；9～11min，100％B；11～12min，100％-5％B；12～15，5％B。流速设定为0.3ml/min，进样量为4μl。自动进样器和柱温分别保持在4℃和30℃。质谱条件：干燥气体氮气，流量为650L/h；去溶剂温度450℃；锥形气体流速50L/h；离子源温度150℃；毛细管电压2500V；碰撞气体，氩气。电喷雾正离子模式(ESI+)。MarkerLynx 4.1软件用于数据采集和分析。
数据处理：
(1)从美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/，TaxID：320991，TaxID：437222)下载地龙转录组数据集，通过TansDecoder软件(版本3.0.0)将其转换为理论地龙蛋白质数据库。使用Proteome Discoerer 2.2软件(ThermoScientific Inc.)进行肽和蛋白质鉴定。常规设置如下：质量分析仪为Orbitrap质谱仪(FTMS)，MS顺序为MS2，激活类型为HCD，极性模式为正，数据库为理论地龙蛋白数据库，酶名称为胰蛋白酶，前体离子允许质量误差10ppm，碎片离子允许质量误差0.05Da。动态修饰(肽末端)为oxidation/+15.995Da(M)、pro-hydroxypro/+15.995Da(P)、lyshydroxy-lys/+15.995Da(K)；动态修饰(蛋白末端)为acetyl/+42.011Da(N-末端)；静态修饰为carbamidomethyl/+57.021Da(C)。多肽匹配误差率使用Target-Decoy策略与正确和错误匹配的Percolator建模相结合来确定。使用由Percolator测定的0.01的q卡值在肽段匹配水平上过滤数据以控制错误的发现。
(2)PeakView软件用于分析数据非依赖性采集(DIA)得到的数据。参数设置如下：提取窗口设置为5min；前体离子允许质量误差为50ppm；每个肽至少有六个过渡；最小肽置信度为95％；排除任何共享和修饰的肽。仅选择FDR值小于1％的肽。
特征多肽筛选：根据以下两个标准进行筛选：①种属特异性：该多肽只能在一种地龙中检测到；②种内稳定性，该多肽在同种地龙中均能够检测到。只有满足这两个要求的多肽才能够被筛选为特征多肽。具体操作如下：
(1)通过蛋白质组学分析鉴定得到通俗环毛蚓中5651个多肽，参环毛蚓中5693个多肽及保宁腔蚓中5047个多肽。
(2)通过Microsoft Office excel筛选这三种地龙各自特有的多肽，即在一种地龙中检测到，而另外两种地龙中没有检测到的多肽。结果通俗环毛蚓中筛选得到45个多肽，参环毛蚓中84个，保宁腔蚓中21个。
(3)使用Skyline软件预测候选肽的MRM方法，包括离子对，碰撞能量和锥孔电压，然后建立UPLC-MRM方法，对筛选的多肽进行验证。结果能够在通俗环毛蚓样品中稳定地检测到27个多肽，参环毛蚓中41个多肽，保宁腔蚓中13个多肽。
(4)为进一步确保筛选得到的81个多肽的种属特异性，在9批其他品种的地龙样品中进行验证，结果显示最终在通俗环毛蚓中筛选得到特征多肽2个，参环毛蚓中2个，保宁腔蚓中1个。
(5)根据特征多肽氨基酸序列，合成得到5个特征多肽标准品，通过质谱调谐优化其MRM方法，最终优化得到的质谱方法见表1。三种地龙特征多肽轮廓分析如图2所示，通俗环毛蚓的特征肽为1和2，特征肽3和4为参环毛蚓的特征多肽，多肽5为保宁腔蚓的特征肽。
通俗环毛蚓特征多肽1：AIGLDVGQPR,(离子对:513.23-841.40)；
通俗环毛蚓特征多肽2：FPLYLTK(离子对:441.26-367.73)；
参环毛蚓特征多肽3：VLSEFSAK(离子对:440.74-668.32)；
参环毛蚓特征多肽4：LLLLSGIGPK(离子对:505.83-199.12)；
保宁腔蚓特征多肽5:LSFEEFR(离子对:464.23-727.34)。
3、地龙特征多肽的稳定性及专属性测定
基于合成多肽，对基于特征多肽的MRM分析方法进行优化，用于27批地龙药材的分析，包括6批参环毛蚓、6批通俗环毛蚓、6批保宁腔蚓及9批其他品种地龙，以验证地龙特征多肽的稳定性及专属性。
优化建立的质谱分析方法具体如下：
采用配备电喷雾电离(ESI)的Waters Acquity UPLC H-Class-XEVO TQD液质联用仪进行UPLC-MRM分析。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱内径为2.1mm)；以0.1％甲酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～8min，5％-36％B；8～9min，36％–100％B；9～11min，100％B；11～12min，100％-5％B；12～15min，5％B。流速为每分钟0.3ml。采用质谱检测器，电喷雾正离子模式(ESI+)，进行多反应监测(MRM)，具体设置同表1。吸取供试品溶液4μl，注入高效液相色谱-质谱联用仪同上述方法进行检测。
结果如图3、4和5所示，各特征肽在对应品种的地龙样品中均稳定存在，而在其他品种中均不存在，具有较好的稳定性及专属性，可用于市场地龙品种的鉴别。其中S1-S6为通俗环毛蚓，S7-S12为参环毛蚓，S13-S18为保宁腔蚓，S19-S27为其他品种地龙样品。
实施例2基于特征多肽对市场收集的地龙药材进行真伪鉴别
1、材料和试剂
材料：市场上收集得到的各种地龙药材。
试剂：SDS裂解液、苯甲磺酰氟(PMSF)购至碧云天；二硫苏糖醇(DTT)购至上海源叶生物技术有限公司；碘乙酰胺(IAA)和碳酸三乙铵碳酸氢盐缓冲液(TEAB)购至Sigma-Aldrich，尿素由西陇科学提供，胰蛋白酶(测序级)购自Promega。根据5个特征多肽氨基酸序列合成的特征多肽对照品由上海万生昊天生物技术有限公司通过液相合成法制备获得，纯度>95％。
2、检测方法
(1)用手术剪剪去地龙药材头、尾及生殖带等部位，得到中间段，使用超纯水将其泥土内脏等清洗干净，用滤纸将水吸干，室温自然风干后将其剪碎，加液氮快速研磨成细粉。
(2)精密称取地龙粉末0.1g，加入含1％PMSF的SDS蛋白裂解液，涡旋混匀，冰上裂解30min，高速离心机4℃，12000rpm离心10min，收集蛋白上清液。
(3)将提取得到的地龙蛋白稀释至3mg/ml。吸取50μl该蛋白稀释液加入至10K超滤管(Millipore,Burlington,MA,USA))中，再加入300μl 8M尿素液洗涤两次，每次洗涤在14000g下离心20min，弃下层滤液。接着加入200μl还原缓冲液(10m MDTT，8M尿素，100mMTEAB，pH 8.0)37℃还原1h，再加入200μl 10mM碘乙酰胺，室温条件下暗处反应1h，之后14000g离心20min，弃下层滤液。再加入400μl 100mM TEAB洗涤两次，同样每次洗涤在14000g下离心20min。之后将超滤管转移至新的收集管中，加入100μl 100mM TEAB对上层蛋白进行稀释，再加入50μl 40μg/ml测序级胰蛋白酶，置于37℃环境中，酶解12h。将酶解后样品14000g离心20min，再加入200μl 100mM TEAB洗涤两次，同样每次洗涤14000g离心20min。最后将收集管中的溶液冷冻干燥，得到多肽粉末。
(4)将多肽粉末完全溶解在1ml 0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液中，使用Sep-Pak C18小柱(Waters,MA,U.S.A.)进行脱盐处理。首先对Sep-Pak C18小柱进行平衡：加入1ml甲醇(含0.1％TFA)冲洗一遍，再加入1ml 90％乙睛水溶液(含0.1％TFA)冲洗一遍，最后加入1ml0.1％TFA水溶液冲洗一遍。接着上样，靠自然重力吸附三次。然后加入0.1％TFA冲洗三次。最后使用90％乙睛水溶液(含0.1％TFA)靠自然重力洗脱三次。三次洗脱的样品溶液合并，进行离心浓缩干燥。
(5)完全干燥后的样品加入150μl 0.1％甲酸水溶液进行复溶，之后12000rpm，离心15min，取上清至进样瓶上机分析。
(6)另取合成的特征多肽对照品适量，精密称定，加0.1％甲酸水溶液配制成每lml含特征多肽60μg的混合溶液，12000rpm离心15min，取上清液待分析。
(7)使用配备电喷雾电离(ESI)的Waters Acquity UPLC H-Class-XEVO TQD液质联用仪进行分析。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱内径为2.1mm)；以0.1％甲酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～8min，5％-36％B；8～9min，36％–100％B；9～11min，100％B；11～12min，100％-5％B；12～15min，5％B。流速为每分钟0.3ml。采用质谱检测器，电喷雾正离子模式(ESI+)，进行多反应监测(MRM)，具体设置同表1。
表1地龙特征多肽MRM方法
Figure GDA0003620671150000111
吸取供试品溶液4μl，注入高效液相色谱-质谱联用仪同上述方法进行检测。
(8)供试品溶液应同时呈现与对照品溶液色谱保留时间一致的色谱峰则得出鉴定结果。
3、结果
如图6所示，供试品1中存在保留时间5.52min和6.67min的两个色谱峰与对照品溶液中特征多肽1、2色谱峰保留时间一致，故鉴定供试品1为通俗环毛蚓，为正品地龙。同样供试品2中存在保留时间4.82min和7.81min的两个色谱峰与对照品溶液中特征多肽3、4色谱峰保留时间一致，鉴定供试品2为参环毛蚓，为正品地龙。供试品3中存在保留时间6.47min的色谱峰与对照品溶液中特征多肽5色谱峰保留时间一致，鉴定供试品3为保宁腔蚓，为伪品地龙。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 地龙特征多肽及其在地龙药材种属鉴别中的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 通俗环毛蚓(P. vulgaris Chen)
<400> 1
Ala Ile Gly Leu Asp Val Gly Gln Pro Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 通俗环毛蚓(P. vulgaris Chen)
<400> 2
Phe Pro Leu Tyr Leu Thr Lys
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 参环毛蚓(P. aspergillum E. Perrier)
<400> 3
Val Leu Ser Glu Phe Ser Ala Lys
1 5
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 参环毛蚓(P. aspergillum E. Perrier)
<400> 4
Leu Leu Leu Leu Ser Gly Ile Gly Pro Lys
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 保宁腔蚓(Metaphire magna Chen)
<400> 5
Leu Ser Phe Glu Glu Phe Arg
1 5

Claims (6)

1.一组地龙药材特征多肽，其特征在于，包括：
通俗环毛蚓特征多肽1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
通俗环毛蚓特征多肽2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
参环毛蚓特征多肽3，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
参环毛蚓特征多肽4，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
保宁腔蚓特征多肽5，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
2.根据权利要求1所述的地龙药材特征多肽，其特征在于：
SEQ ID NO：1所示通俗环毛蚓特征多肽1的质谱采集离子对：513.23-841.40；
SEQ ID NO：2所示的通俗环毛蚓特征多肽2的质谱采集离子对：441.26-367.73；
SEQ ID NO：3所示的参环毛蚓特征多肽3的质谱采集离子对：440.74-668.32；
SEQ ID NO：4所示的参环毛蚓特征多肽4的质谱采集离子对：505.83-199.12；
SEQ ID NO：5所示的保宁腔蚓特征多肽5的质谱采集离子对：464.23-727.34。
3.权利要求1或2所述特征多肽在地龙药材种属鉴别中的应用。
4.一种基于权利要求1或2所述特征多肽的地龙药材种属鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对待测样本进行液-质前处理，获得待测多肽滤液；
（2）根据权利要求1或2所述特征多肽氨基酸序列合成特征多肽对照品；
（3）根据质谱法检测待测样本的多肽成分，将待测样本的质谱结果与特征多肽对照品的质谱谱图进行对比，具有相同谱图则判断为同一种属。
5.根据权利要求4所述的鉴别方法，其特征在于，步骤（1）中，所述液-质前处理是指取待测地龙药材洗净剪碎，液氮研磨成细粉；称取地龙粉末加裂解液裂解，提取地龙蛋白；采用胰蛋白酶对提取得到的蛋白进行酶解得到多肽，对多肽进行脱盐处理，浓缩干燥后复溶，离心取上清得到多肽滤液。
6.根据权利要求4所述的鉴别方法，其特征在于，步骤（3）中，所述质谱法检测为：
色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18，尺寸为1.7 μm，2.1×100 mm；流动相A为0.1%v/v甲酸溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱：0~8 min，5%-36% B；8~9 min，36%–100% B；9~11 min，100%B；11~12 min，100%-5% B；12~15 min，5% B；流速为0.3 ml/min，进样量4 μl；自动进样器和柱温分别保持在4℃和30℃；
质谱条件：干燥气体氮气，流量为650 L/h；去溶剂温度450℃；锥形气体流速50 L/h；离子源温度150℃；毛细管电压2500 V；碰撞气体，氩气；电喷雾正离子模式（ESI+）进行多反应监测（MRM），具体如下：所述特征多肽为AIGLDVGQPR，母离子为513.23 m/z，子离子为841.40m/z，锥孔电压为30V，碰撞能量为15V；
所述特征多肽为FPLYLTK，母离子为441.26m/z，子离子为367.73m/z，锥孔电压为35V，碰撞能量为15V；
所述特征多肽为VLSEFSAK，母离子为440.74 m/z，子离子为668.32m/z，锥孔电压为30V，碰撞能量为15V；
所述特征多肽为LLLLSGIGPK，母离子为505.83 m/z，子离子为199.12m/z，锥孔电压为25V，碰撞能量为20V；
所述特征多肽为LSFEEFR，母离子为464.23 m/z，子离子为727.34m/z，锥孔电压为25V，碰撞能量为16V。
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