CN114354772A - 用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合的筛选方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合的筛选方法和应用。所述筛选方法包括以下步骤:对各个供试品溶液进行超高效液相色谱联用质谱测定;将所得数据导入Proteome Discoverer分析软件,采用Uniprot的数据库Testudines进行搜库匹配,采用SEQUEST检索算法,筛选获得用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合。本发明利用液质联用技术,结合蛋白组学,找出能用于区别中华鳖鳖甲与乌龟龟甲、佛罗里达鳖和角鳖的特征多肽,专属性强,操作简便,为中华鳖鳖甲药材、中华鳖醋鳖甲饮片及两者标准汤剂的质量控制和评价提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及生物分析技术领域,特别是涉及用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合的筛选方法和应用。
背景技术
鳖甲为鳖科动物鳖(Trionyx sinensis Wiegmann)的背甲。鳖广布于全国各地,多生活于湖泊、小河及池塘旁的沙泥里。全年均可捕捉,以秋、冬二季为多,捕捉后杀死,置沸水中烫至背甲上的硬皮能剥落时,取出,剥取背甲,除去残肉,晒干。具滋阴潜阳,退热除蒸,软坚散结等功效,用于阴虚发热,骨蒸劳热,阴虚阳亢,头晕目眩,虚风内动,手足瘈疭,经闭,癥瘕,久疟疟母。现代药理学研究表明,鳖甲能提高血浆蛋白的水平,增强机体免疫力,促进肝细胞的修复与再生。醋鳖甲具有收敛、解毒、散瘀止痛的作用,还能增强药物入肝消积,软肝散结的能力。
然而,鳖甲作为一种常用中药,针对其质量标准的研究并不完善。2020年版《中国药典》一部仅对鳖甲的性状、水分和浸出物进行控制,未在鉴别方面作出规定。关于鳖甲及其制品(例如醋鳖甲及其标准汤剂、鳖甲标准汤剂)的研究也大多集中在化学成分和药理方面,定性方面的报道较少。目前,鳖甲的鉴别主要依据药材性状、紫外光谱、薄层和聚合酶链反应(PCR)技术,如卢先明的《鳖甲的品种与鉴别研究》、李莉的《浅析鳖甲及其伪品的鉴别》以及吴平的《用聚合酶链反应产物直接测序技术鉴定中药材鳖甲》,但紫外光谱和薄层鉴别缺乏专属性。虽然PCR技术特异性强、灵敏度高,但是鳖甲标准汤剂的提取过程温度较高,特定的DNA片段可能遭到破坏,加上基质复杂,提取更为困难,导致PCR技术难以应用到的鳖甲标准汤剂之中。
近年来,随着蛋白组学与液质联用技术的结合,有些研究成功地通过寻找动物药的特征肽段进行真伪鉴别和基原区分,如房芳的《基于特征肽段的阿胶中异源性物种鉴别》中,为鉴别阿胶中动物源性掺假物,结合鸟枪蛋白组学技术对不同物种的热稳定特征肽进行检测和鉴定。但其研究的对象为阿胶。在鳖甲胶方面,刘宇文的《液质联用多肽识别技术鉴别鳖甲胶的研究》找出了鳖甲胶与龟甲胶、鹿角胶、阿胶、黄明胶、新阿胶、佛罗里达鳖甲胶、山瑞鳖甲胶的差异性特征肽段,从而建立专属性的鉴别方法。然而,《液质联用多肽识别技术鉴别鳖甲胶的研究》找出的鳖甲胶的特征离子为m/z 784.90(双电荷),鉴定序列为GETGPVGVTGSVGPAGAR,将此序列进行Uniprot BLAST搜索,结果显示共有249个蛋白拥有一致或相似的肽序列。因此,可能存在未在上述文献列举的其他物种可能与鳖甲胶拥有一致序列的情况。而且,随着角鳖等非药用鳖甲类动物养殖、龟甲等龟甲类动物养殖已经获得成功,有可能出现使用这些品种混充正品中华鳖鳖甲的现象,因此上述文献的检测方法有一定局限性。
发明内容
基于此,本发明提供一种用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合的筛选方法,利用液质联用技术,结合蛋白组学,找出能用于区别中华鳖鳖甲与乌龟龟甲、佛罗里达鳖和角鳖的特征多肽,专属性强,操作简便,为中华鳖鳖甲药材、中华鳖醋鳖甲饮片及两者标准汤剂的质量控制和评价提供依据。
本发明所述的用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合的筛选方法,包括以下步骤:
分别制备中华鳖鳖甲药材供试品溶液、乌龟龟甲药材供试品溶液、佛罗里达鳖鳖甲供试品溶液、角鳖鳖甲供试品溶液、中华鳖鳖甲标准汤剂供试品溶液、中华鳖醋鳖甲标准汤剂供试品溶液和乌龟醋龟甲标准汤剂供试品溶液;
对所述中华鳖鳖甲药材供试品溶液、乌龟龟甲药材供试品溶液、佛罗里达鳖鳖甲供试品溶液、角鳖鳖甲供试品溶液、中华鳖鳖甲标准汤剂供试品溶液、中华鳖醋鳖甲标准汤剂供试品溶液和乌龟醋龟甲标准汤剂供试品溶液进行超高效液相色谱联用质谱测定;
将所得数据导入Proteome Discoverer分析软件,采用Uniprot的数据库Testudines进行搜库匹配,采用SEQUEST检索算法,筛选获得用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合。
其中,Proteome Discoverer(简称PD)软件的数据库可自行导入,本发明检索的数据库为Uniprot的Testudines(龟鳖目),采用SEQUEST检索算法,SEQUEST算法基于相似度理论,其基本思想是通过对蛋白酶切和质谱检测过程的数学模拟,将数据库蛋白的理论酶切肽段转化为相应的预测谱,再对预测谱和实验谱的关联程度进行数学评价,从而得到响应的检索结果。本发明应用SEQUEST算法得到区分鳖甲和龟甲的5个肽段,分别为:鳖甲特征多肽:肽段1、肽段2和肽段3,龟甲特征多肽:肽段4和肽段5。
所述肽段1的氨基酸序列为DGEAGAQGPPGAAGPAGER,对应的母离子质荷比为832.88,子离子质荷比为979.49和1036.52;
所述肽段2的氨基酸序列为GETGPVGVTGSVGPAGAR,对应的母离子质荷比为784.90,子离子质荷比为872.46和1028.55;
所述肽段3的氨基酸序列为GEVGPQGAIGPAGSSGPAGPIGAAGPAGSR,对应的母离子质荷比为834.09,子离子质荷比为743.38和953.52;
所述肽段4的氨基酸序列为GELGPQGAIGPAGNSGPAGPVGAAGPAGGR,对应的母离子质荷比为833.09,子离子质荷比为713.37和909.49:
所述肽段5的氨基酸序列为GESGPAGPAGPAGAR,对应的母离子质荷比为626.31,子离子质荷比为696.38和753.40。
在一个优选的实施例中,所述超高效液相色谱联用质谱的色谱条件包括:以乙腈为流动相A,以体积分数为0.05%~0.2%的甲酸水溶液为流动相B,梯度洗脱,所述梯度洗脱包括如下程序:
0min~9min,所述流动相A的体积分数由8%上升到11%,所述流动相B的体积分数由92%下降到89%;
9min~11min,保持所述流动相A的体积分数为11%,所述流动相B的体积分数为89%;
11min~17min,所述流动相A的体积分数由11%上升到21%,所述流动相B的体积分数由89%下降到79%;
17min~21min,所述流动相A的体积分数由21%上升到35%,流动相B的体积分数由79%下降到65%。
本发明洗脱条件共有4个梯度,总用时少,提高效率。
在一个优选的实施例中,所述超高效液相色谱联用质谱的色谱条件还包括:柱温为35℃±10℃,流速为0.35mL/min±0.10mL/min。
在一个优选的实施例中,所述超高效液相色谱联用质谱的质谱条件包括:质量分析器为四极杆-静电场轨道阱;电喷雾正离子模式,进行多反应监测。
本发明使用静电场轨道阱质谱(Orbitrap-MS)进行分析,静电场轨道阱质谱在分辨率、质量准确度、灵敏度和稳定性等方面具有优势,其分辨率可达280000FWHM。
在一个优选的实施例中,所述超高效液相色谱联用质谱的质谱条件还包括:鞘气流速为10Arb±2Arb;辅助气流速为10Arb±2Arb;喷雾电压为3.80kV±0.2kV;毛细管温度为320℃±10℃;辅助气温度为320℃±10℃;碰撞能量为30%±5%。
在一个优选的实施例中,所述中华鳖鳖甲药材供试品溶液、乌龟龟甲药材供试品溶液、佛罗里达鳖鳖甲供试品溶液、角鳖鳖甲供试品溶液、中华鳖鳖甲标准汤剂供试品溶液、中华鳖醋鳖甲标准汤剂供试品溶液和乌龟醋龟甲标准汤剂供试品溶液的制备步骤分别为:
混合溶剂和中华鳖鳖甲药材,加热回流后,加入胰蛋白酶溶液酶解,制备中华鳖鳖甲药材供试品溶液;
混合溶剂和乌龟龟甲药材,加热回流后,加入胰蛋白酶溶液酶解,制备乌龟龟甲药材供试品溶液;
混合溶剂和佛罗里达鳖鳖甲,加热回流后,加入胰蛋白酶溶液酶解,制备佛罗里达鳖鳖甲供试品溶液;
混合溶剂和角鳖鳖甲,加热回流后,加入胰蛋白酶溶液酶解,制备角鳖鳖甲供试品溶液;
混合溶剂和中华鳖鳖甲标准汤剂,超声后,加入胰蛋白酶溶液酶解,制备中华鳖鳖甲标准汤剂供试品溶液;
混合溶剂和中华鳖醋鳖甲标准汤剂,超声后,加入胰蛋白酶溶液酶解,制备中华鳖醋鳖甲标准汤剂供试品溶液;
混合溶剂和乌龟醋龟甲标准汤剂,超声后,加入胰蛋白酶溶液酶解,制备乌龟醋龟甲标准汤剂供试品溶液。
在一个优选的实施例中,制备所述中华鳖鳖甲药材供试品溶液、乌龟龟甲药材供试品溶液、佛罗里达鳖鳖甲供试品溶液、角鳖鳖甲供试品溶液、中华鳖鳖甲标准汤剂供试品溶液、中华鳖醋鳖甲标准汤剂供试品溶液和乌龟醋龟甲标准汤剂供试品溶液的溶剂均为体积分数为1%±0.1%的碳酸氢铵水溶液。
在一个优选的实施例中,所述加热回流的温度为100℃±5℃,时间为30min±10min。
在一个优选的实施例中,所述超声的时间为30min±10min。
本发明所述的鳖甲和龟甲的检测方法,包括以下步骤:
制备待测样品溶液;
对所述待测样品溶液进行超高效液相色谱联用质谱测定,将测定结果与上述的筛选方法获得的用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合进行对比。
在一个优选的实施例中,所述用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合包括中华鳖鳖甲特征多肽和乌龟龟甲特征多肽,所述中华鳖鳖甲特征多肽包括肽段1、肽段2和肽段3,所述乌龟龟甲特征多肽包括肽段4和肽段5;
所述肽段1的氨基酸序列为DGEAGAQGPPGAAGPAGER,对应的母离子质荷比为832.88,子离子质荷比为979.49和1036.52;
所述肽段2的氨基酸序列为GETGPVGVTGSVGPAGAR,对应的母离子质荷比为784.90,子离子质荷比为872.46和1028.55;
所述肽段3的氨基酸序列为GEVGPQGAIGPAGSSGPAGPIGAAGPAGSR,对应的母离子质荷比为834.09,子离子质荷比为743.38和953.52;
所述肽段4的氨基酸序列为GELGPQGAIGPAGNSGPAGPVGAAGPAGGR,对应的母离子质荷比为833.09,子离子质荷比为713.37和909.49:
所述肽段5的氨基酸序列为GESGPAGPAGPAGAR,对应的母离子质荷比为626.31,子离子质荷比为696.38和753.40。
可以理解地,对所述待测样品溶液进行超高效液相色谱联用质谱测定,按照上述质荷比的离子流进行连续检测,记录提取离子流图;
若对应的提取离子流图中,观察到上述肽段1、肽段2和肽段3,则所述待测样品为中华鳖鳖甲;
若对应的提取离子流图只观察到肽段1、肽段2和肽段3中的一种或两种,则所述待测样品不是中华鳖鳖甲正品;
若对应的提取离子流图观察到上述的肽段4和肽段5,则所述待测样品为乌龟龟甲;
若对应的提取离子流图同时观察到上述肽段1、肽段2、肽段3、肽段4和肽段5,则所述待测样品同时含有乌龟龟甲和中华鳖鳖甲,即待测样品有龟甲掺杂。
即,肽段1~3仅存在于中华鳖鳖甲,不存在于乌龟龟甲;肽段4~5仅存在于乌龟龟甲,不存在于中华鳖鳖甲。因此,这5段肽段可用于区分中华鳖鳖甲和乌龟龟甲及解决二者混掺问题。肽段2~3不存在于佛罗里达鳖鳖甲和角鳖鳖甲,可用于与中华鳖鳖甲相区分。
在一个优选的实施例中,所述超高效液相色谱联用质谱的色谱条件包括:以乙腈为流动相A,以体积分数为0.05%~0.2%的甲酸水溶液为流动相B,梯度洗脱,所述梯度洗脱包括如下程序:
0min~9min,所述流动相A的体积分数由8%上升到11%,所述流动相B的体积分数由92%下降到89%;
9min~11min,保持所述流动相A的体积分数为11%,所述流动相B的体积分数为89%;
11min~17min,所述流动相A的体积分数由11%上升到21%,所述流动相B的体积分数由89%下降到79%;
17min~21min,所述流动相A的体积分数由21%上升到35%,流动相B的体积分数由79%下降到65%。
在一个优选的实施例中,所述超高效液相色谱联用质谱的色谱条件还包括:柱温为35℃±10℃,流速为0.35mL/min±0.10mL/min。
在一个优选的实施例中,所述超高效液相色谱联用质谱的质谱条件包括:质量分析器为四极杆-静电场轨道阱;电喷雾正离子模式,进行多反应监测。
在一个优选的实施例中,所述超高效液相色谱联用质谱的质谱条件还包括:鞘气流速为10Arb±2Arb;辅助气流速为10Arb±2Arb;喷雾电压为3.80kV±0.2kV;毛细管温度为320℃±10℃;辅助气温度为320℃±10℃;碰撞能量为30%±5%。
在一个优选的实施例中,所述待测样品溶液的制备步骤包括:混合溶剂和待测样品,加热回流或超声后,加入胰蛋白酶溶液酶解,制备待测样品溶液。
在一个优选的实施例中,所述溶剂为体积分数为1%±0.1%的碳酸氢铵水溶液。
在一个优选的实施例中,所述加热回流的温度为100℃±5℃,时间为30min±10min。
在一个优选的实施例中,所述超声的时间为30min±10min。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明利用液质联用技术,结合蛋白组学,找出能用于区别中华鳖鳖甲、乌龟龟甲、佛罗里达鳖和角鳖的特征多肽,不同于现有文献中仅找到肽段2作为鳖甲的专属性肽段,本发明还找到了肽段1和肽段3,可以有效地缩减Uniprot BLAST中的检索范围,增加了中华鳖鳖甲的专属性,即当待测样品同时拥有上述3个肽段,才可认为是中华鳖鳖甲。同时,本发明还发现了乌龟龟甲的专属性肽段4和肽段5,其发现可以有效避免中华鳖鳖甲和乌龟龟甲互相掺伪的情况,即当中华鳖鳖甲中掺有乌龟龟甲时,肽段1-3的检测仅能证明待测样品中有中华鳖鳖甲,而无法证明待测样品是否混有龟甲。肽段4和肽段5,可证明待测样品是否存在掺杂乌龟龟甲的情况。
本发明建立了从多肽水平对中华鳖鳖甲及其制品(例如中华鳖醋鳖甲及其标准汤剂、中华鳖鳖甲标准汤剂)的鳖甲成分检测的方法,能够快速准确地对中华鳖鳖甲及其制品的鳖甲成分进行检测,弥补中药标准汤剂因外观形状缺失而导致的检测缺陷。此方法专属性强,操作简便,为中华鳖鳖甲药材、中华鳖醋鳖甲饮片及两者标准汤剂的质量控制和评价提供依据。
附图说明
图1为中各试样m/z 832.88提取离子流图(A:中华鳖鳖甲药材;B:中华鳖醋鳖甲饮片;C:中华鳖鳖甲标准汤剂;D:中华鳖醋鳖甲标准汤剂;E:乌龟龟甲药材;F:乌龟醋龟甲标准汤剂;G:佛罗里达鳖鳖甲;H:角鳖鳖甲);
图2为各试样子离子(832.88>979.50)提取离子流图(A:中华鳖鳖甲药材;B:中华鳖醋鳖甲饮片;C:中华鳖鳖甲标准汤剂;D:中华鳖醋鳖甲标准汤剂;E:乌龟龟甲药材;F:乌龟醋龟甲标准汤剂;G:佛罗里达鳖鳖甲;H:角鳖鳖甲);
图3为各试样m/z 784.90提取离子流图(A:中华鳖鳖甲药材;B:中华鳖醋鳖甲饮片;C:中华鳖鳖甲标准汤剂;D:中华鳖醋鳖甲标准汤剂;E:乌龟龟甲药材;F:乌龟醋龟甲标准汤剂;G:佛罗里达鳖鳖甲;H:角鳖鳖甲);
图4为各试样子离子(784.90>1028.55)提取离子流图(A:中华鳖鳖甲药材;B:中华鳖醋鳖甲饮片;C:中华鳖鳖甲标准汤剂;D:中华鳖醋鳖甲标准汤剂;E:乌龟龟甲药材;F:乌龟醋龟甲标准汤剂;G:佛罗里达鳖鳖甲;H:角鳖鳖甲);
图5为各试样m/z 834.09提取离子流图(A:中华鳖鳖甲药材;B:中华鳖醋鳖甲饮片;C:中华鳖鳖甲标准汤剂;D:中华鳖醋鳖甲标准汤剂;E:乌龟龟甲药材;F:乌龟醋龟甲标准汤剂;G:佛罗里达鳖鳖甲;H:角鳖鳖甲);
图6为各试样子离子(834.09>953.52)提取离子流图(A:中华鳖鳖甲药材;B:中华鳖醋鳖甲饮片;C:中华鳖鳖甲标准汤剂;D:中华鳖醋鳖甲标准汤剂;E:乌龟龟甲药材;F:乌龟醋龟甲标准汤剂;G:佛罗里达鳖鳖甲;H:角鳖鳖甲);
图7为各试样m/z 833.09提取离子流图(A:中华鳖鳖甲药材;B:中华鳖醋鳖甲饮片;C:中华鳖鳖甲标准汤剂;D:中华鳖醋鳖甲标准汤剂;E:乌龟龟甲药材;F:乌龟醋龟甲标准汤剂;G:佛罗里达鳖鳖甲;H:角鳖鳖甲);
图8为各试样子离子(833.09>909.49)提取离子流图(A:中华鳖鳖甲药材;B:中华鳖醋鳖甲饮片;C:中华鳖鳖甲标准汤剂;D:中华鳖醋鳖甲标准汤剂;E:乌龟龟甲药材;F:乌龟醋龟甲标准汤剂;G:佛罗里达鳖鳖甲;H:角鳖鳖甲);
图9为各试样m/z 626.31提取离子流图(A:中华鳖鳖甲药材;B:中华鳖醋鳖甲饮片;C:中华鳖鳖甲标准汤剂;D:中华鳖醋鳖甲标准汤剂;E:乌龟龟甲药材;F:乌龟醋龟甲标准汤剂;G:佛罗里达鳖鳖甲;H:角鳖鳖甲);
图10为各试样子离子(626.31>753.40)提取离子流图(A:中华鳖鳖甲药材;B:中华鳖醋鳖甲饮片;C:中华鳖鳖甲标准汤剂;D:中华鳖醋鳖甲标准汤剂;E:乌龟龟甲药材;F:乌龟醋龟甲标准汤剂;G:佛罗里达鳖鳖甲;H:角鳖鳖甲);
图11为肽段1的中华鳖鳖甲与人工合成多肽二级质谱图对比(A:样品;B:人工合成多肽对照品);
图12为肽段2的中华鳖鳖甲与人工合成多肽二级质谱图对比(A:样品;B:人工合成多肽对照品);
图13为肽段3的中华鳖鳖甲与人工合成多肽二级质谱图对比(A:样品;B:人工合成多肽对照品);
图14为肽段4的乌龟龟甲与人工合成多肽二级质谱图对比(A:样品;B:人工合成多肽对照品);
图15为肽段5的乌龟龟甲与人工合成多肽二级质谱图对比,(A:样品;B:人工合成多肽对照品);
图16为待测样品溶液的提取离子流图(A:提取母离子m/z 833.09及子离子m/z713.37;B:提取母离子m/z 626.31及子离子m/z 696.38;C:提取母离子m/z 832.88及子离子m/z 979.49;D:提取母离子m/z 784.90及子离子m/z 872.46;E:提取母离子m/z 834.09及子离子m/z 743.38);
图17为待测样品溶液提取母离子m/z 833.09的二级质谱图;
图18为待测样品溶液提取母离子m/z 626.31的二级质谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施方式。相反地,提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
试药胰蛋白酶(中国药品生物制品检定所,批号:615-200206);乙腈(默克公司,色谱级,批号:JA095530);碳酸氢铵(CNW,色谱级,批号:I4890040);甲酸(CNW,色谱级,批号:A8310050);水为超纯水。
实施例1特征多肽的筛选和对照品验证
1供试品溶液的制备
取中华鳖鳖甲药材、乌龟龟甲药材、佛罗里达鳖鳖甲和角鳖鳖甲各0.5g,分别加1%碳酸氢铵(体积分数为1%的碳酸氢铵水溶液)50mL,加热回流30min,用0.22μm微孔滤膜滤过,精密移取100μL置微量进样瓶中,分别加胰蛋白酶溶液10μL(取序列分析用胰蛋白酶,加1%碳酸氢铵溶液制成每1mL中含1mg的溶液,临用时配制),摇匀,37℃恒温酶解12小时,样品溶液用1%碳酸氢铵稀释20倍,即得中华鳖鳖甲药材供试品溶液、乌龟龟甲药材供试品溶液、佛罗里达鳖鳖甲供试品溶液和角鳖鳖甲供试品溶液。
取中华鳖鳖甲标准汤剂、中华鳖醋鳖甲标准汤剂、乌龟醋龟甲标准汤剂各0.1g,分别加1%碳酸氢铵溶液(体积分数为1%的碳酸氢铵水溶液)50mL,超声处理(功率250W,频率50kHz)30min,用0.22μm微孔滤膜滤过,精密移取100μL置微量进样瓶中,分别加胰蛋白酶溶液10μL(取序列分析用胰蛋白酶,加1%碳酸氢铵溶液制成每1mL中含1mg的溶液,临用时配制),摇匀,37℃恒温酶解12小时,样品溶液用1%碳酸氢铵稀释20倍,即得中华鳖鳖甲标准汤剂供试品溶液、中华鳖醋鳖甲标准汤剂供试品溶液、乌龟醋龟甲标准汤剂供试品溶液。
2对照药材溶液制备
取中华鳖鳖甲对照药材0.5g,加1%碳酸氢铵溶液(体积分数为1%的碳酸氢铵水溶液)50mL,加热回流30min,用0.22μm微孔滤膜滤过,精密移取100μL置微量进样瓶中,分别加胰蛋白酶溶液10μL(取序列分析用胰蛋白酶,加1%碳酸氢铵溶液制成每1mL中含1mg的溶液,临用时配制),摇匀,37℃恒温酶解12小时,样品溶液用1%碳酸氢铵稀释20倍,即得中华鳖鳖甲对照药材溶液。
取乌龟龟甲对照药材0.5g,加1%碳酸氢铵溶液(体积分数为1%的碳酸氢铵水溶液)50mL,加热回流30min,用0.22μm微孔滤膜滤过,精密移取100μL置微量进样瓶中,分别加胰蛋白酶溶液10μL(取序列分析用胰蛋白酶,加1%碳酸氢铵溶液制成每1mL中含1mg的溶液,临用时配制),摇匀,37℃恒温酶解12小时,样品溶液用1%碳酸氢铵稀释20倍,即得乌龟龟甲对照药材溶液。
3色谱条件
赛默飞Vanquish超高效液相色谱仪(美国ThermoFisher公司);Agilent EclipsePlus C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.8μm);流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液(体积分数为0.1%的甲酸水溶液),按下表1梯度进行洗脱,柱温为35℃,流速为0.35mL/min。
表1梯度洗脱表
4质谱条件
赛默飞Q-Exactive超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱组合式高分辨质谱仪(美国ThermoFisher公司);质量分析器:四极杆-静电场轨道阱;电喷雾正离子模式(ESI+);鞘气流速:10Arb;辅助气流速:10Arb;喷雾电压:3.80kV;毛细管温度:320℃;辅助气温度:320℃;碰撞能量:30%;FullMS+ddms2模式进行全扫描,PRM模式进行确认。
5测定
分别精密吸取上述中华鳖鳖甲药材供试品溶液、乌龟龟甲药材供试品溶液、佛罗里达鳖鳖甲供试品溶液、角鳖鳖甲供试品溶液、中华鳖鳖甲标准汤剂供试品溶液、中华鳖醋鳖甲标准汤剂供试品溶液、乌龟醋龟甲标准汤剂供试品溶液和中华鳖鳖甲对照药材供试品溶液各2μL,注入超高效液相色谱仪,按上述条件测定并采集质谱图。
6数据处理
将所采集的质谱数据导入Proteome Discoverer 2.4分析软件,采用Uniprot数据库的Testudines(龟鳖目)进行搜库匹配,采用SEQUEST检索算法,筛选得到鳖甲及龟甲的专属性多肽序列,具体信息如表2所示:
表2
图1和图2分别为中华鳖鳖甲药材、中华鳖醋鳖甲饮片、中华鳖鳖甲标准汤剂、中华鳖醋鳖甲标准汤剂、乌龟龟甲药材、乌龟醋龟甲标准汤剂、佛罗里达鳖鳖甲和角鳖鳖甲m/z(质荷比)832.88和子离子(832.88>979.50)的提取离子流图,其中,A:中华鳖鳖甲药材;B:中华鳖醋鳖甲饮片;C:中华鳖鳖甲标准汤剂;D:中华鳖醋鳖甲标准汤剂;E:乌龟龟甲药材;F:乌龟醋龟甲标准汤剂;G:佛罗里达鳖鳖甲;H:角鳖鳖甲。结果显示,肽段1在中华鳖鳖甲药材、中华鳖醋鳖甲饮片、中华鳖鳖甲标准汤剂、中华鳖醋鳖甲标准汤剂、佛罗里达鳖鳖甲和角鳖鳖甲中存在,在乌龟龟甲药材和乌龟醋龟甲标准汤剂中不存在。
图3和图4分别为中华鳖鳖甲药材、中华鳖醋鳖甲饮片、中华鳖鳖甲标准汤剂、中华鳖醋鳖甲标准汤剂、乌龟龟甲药材、乌龟醋龟甲标准汤剂、佛罗里达鳖鳖甲和角鳖鳖甲m/z(质荷比)784.90和子离子(784.90>1028.55)的提取离子流图,其中,A:中华鳖鳖甲药材;B:中华鳖醋鳖甲饮片;C:中华鳖鳖甲标准汤剂;D:中华鳖醋鳖甲标准汤剂;E:乌龟龟甲药材;F:乌龟醋龟甲标准汤剂;G:佛罗里达鳖鳖甲;H:角鳖鳖甲。结果显示,肽段2只在中华鳖鳖甲药材、中华鳖醋鳖甲饮片、中华鳖鳖甲标准汤剂和中华鳖醋鳖甲标准汤剂中存在,在佛罗里达鳖鳖甲和角鳖鳖甲中不存在,在乌龟龟甲药材和乌龟醋龟甲标准汤剂中也不存在。
图5和图6分别为中华鳖鳖甲药材、中华鳖醋鳖甲饮片、中华鳖鳖甲标准汤剂、中华鳖醋鳖甲标准汤剂、乌龟龟甲药材、乌龟醋龟甲标准汤剂、佛罗里达鳖鳖甲和角鳖鳖甲m/z(质荷比)834.09和子离子(834.09>953.52)的提取离子流图,其中,A:中华鳖鳖甲药材;B:中华鳖醋鳖甲饮片;C:中华鳖鳖甲标准汤剂;D:中华鳖醋鳖甲标准汤剂;E:乌龟龟甲药材;F:乌龟醋龟甲标准汤剂;G:佛罗里达鳖鳖甲;H:角鳖鳖甲。结果显示,肽段3只在中华鳖鳖甲药材、中华鳖醋鳖甲饮片、中华鳖鳖甲标准汤剂和中华鳖醋鳖甲标准汤剂中存在,在佛罗里达鳖鳖甲和角鳖鳖甲中不存在,在乌龟龟甲药材和乌龟醋龟甲标准汤剂中也不存在。
图7和图8分别为中华鳖鳖甲药材、中华鳖醋鳖甲饮片、中华鳖鳖甲标准汤剂、中华鳖醋鳖甲标准汤剂、乌龟龟甲药材、乌龟醋龟甲标准汤剂、佛罗里达鳖鳖甲和角鳖鳖甲m/z(质荷比)833.09子离子(833.09>909.49)的提取离子流图,其中,A:中华鳖鳖甲药材;B:中华鳖醋鳖甲饮片;C:中华鳖鳖甲标准汤剂;D:中华鳖醋鳖甲标准汤剂;E:乌龟龟甲药材;F:乌龟醋龟甲标准汤剂;G:佛罗里达鳖鳖甲;H:角鳖鳖甲。结果显示,肽段4只在乌龟龟甲药材和乌龟醋龟甲标准汤剂中存在,在中华鳖鳖甲药材、中华鳖醋鳖甲饮片、中华鳖鳖甲标准汤剂、中华鳖醋鳖甲标准汤剂、佛罗里达鳖鳖甲和角鳖鳖甲中均不存在。
图9和图10分别为中华鳖鳖甲药材、中华鳖醋鳖甲饮片、中华鳖鳖甲标准汤剂、中华鳖醋鳖甲标准汤剂、乌龟龟甲药材、乌龟醋龟甲标准汤剂、佛罗里达鳖鳖甲和角鳖鳖甲m/z(质荷比)626.31子离子(626.31>753.40)的提取离子流图,其中,A:中华鳖鳖甲药材;B:中华鳖醋鳖甲饮片;C:中华鳖鳖甲标准汤剂;D:中华鳖醋鳖甲标准汤剂;E:乌龟龟甲药材;F:乌龟醋龟甲标准汤剂;G:佛罗里达鳖鳖甲;H:角鳖鳖甲。结果显示,肽段5只在乌龟龟甲药材和乌龟醋龟甲标准汤剂中存在,在中华鳖鳖甲药材、中华鳖醋鳖甲饮片、中华鳖鳖甲标准汤剂、中华鳖醋鳖甲标准汤剂、佛罗里达鳖鳖甲和角鳖鳖甲中均不存在。
综上,肽段1~3仅存在于中华鳖鳖甲,不存在于乌龟龟甲;肽段4~5仅存在于乌龟龟甲,不存在于中华鳖鳖甲。因此,这5段肽段可用于区分中华鳖鳖甲和乌龟龟甲及解决二者混掺问题。肽段2~3不存在于佛罗里达鳖鳖甲和角鳖鳖甲,因此可用于与中华鳖鳖甲相区分。
7所选肽段的序列验证
按照上表的信息,将样品和从对照中华鳖鳖甲对照药材和乌龟龟甲对照药材提取的人工合成肽段用PRM模式进行确认,得到二级质谱图。
通过对比合成肽段与样品筛选肽段的相同质荷比下的保留时间和二级离子碎片,结果显示上述5段特征多肽的保留时间和二级离子碎片均能与人工合成的一一对应,表明了所筛选多肽的序列均为正确序列。见图11至图15。
实施例2待测样品的检测
取待测药材0.5g,加1%碳酸氢铵(体积分数为1%的碳酸氢铵水溶液)50mL,加热回流30min,用0.22μm微孔滤膜滤过,精密移取100μL置微量进样瓶中,分别加胰蛋白酶溶液10μL(取序列分析用胰蛋白酶,加1%碳酸氢铵溶液制成每1mL中含1mg的溶液,临用时配制),摇匀,37℃恒温酶解12小时,样品溶液用1%碳酸氢铵稀释20倍,即得待测样品溶液。
参照实施例1项3所述的色谱条件和项4所述的质谱条件,对所述待测样品溶液进行超高效液相色谱联用质谱测定,对上表2中所述质荷比的离子流进行连续检测,记录提取离子流图,如图16-图18所示。图16中,A对应提取母离子m/z 833.09及子离子m/z 713.37;B对应提取母离子m/z 626.31及子离子m/z 696.38;C对应提取母离子m/z 832.88及子离子m/z 979.49;D对应提取母离子m/z 784.90及子离子m/z 872.46;E对应提取母离子m/z834.09及子离子m/z 743.38。从图16可知,A观察到肽段4;B观察到肽段5,C未观察到肽段1;D未观察到肽段2;E未观察到肽段3。且通过观察所提取母离子的二级质谱图,如图17-图18所示,与乌龟龟甲对照药材的二级质谱图一致。可知,待测样品为乌龟龟甲药材。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (13)
1.一种用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合的筛选方法,其特征在于,包括以下步骤:
分别制备中华鳖鳖甲药材供试品溶液、乌龟龟甲药材供试品溶液、佛罗里达鳖鳖甲供试品溶液、角鳖鳖甲供试品溶液、中华鳖鳖甲标准汤剂供试品溶液、中华鳖醋鳖甲标准汤剂供试品溶液和乌龟醋龟甲标准汤剂供试品溶液;
对所述中华鳖鳖甲药材供试品溶液、乌龟龟甲药材供试品溶液、佛罗里达鳖鳖甲供试品溶液、角鳖鳖甲供试品溶液、中华鳖鳖甲标准汤剂供试品溶液、中华鳖醋鳖甲标准汤剂供试品溶液和乌龟醋龟甲标准汤剂供试品溶液进行超高效液相色谱联用质谱测定;
将所得数据导入Proteome Discoverer分析软件,采用Uniprot的数据库Testudines进行搜库匹配,采用SEQUEST检索算法,筛选获得用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合。
2.根据权利要求1所述的用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合的筛选方法,其特征在于,所述超高效液相色谱联用质谱的色谱条件包括:以乙腈为流动相A,以体积分数为0.05%~0.2%的甲酸水溶液为流动相B,梯度洗脱,所述梯度洗脱包括如下程序:
0min~9min,所述流动相A的体积分数由8%上升到11%,所述流动相B的体积分数由92%下降到89%;
9min~11min,保持所述流动相A的体积分数为11%,所述流动相B的体积分数为89%;
11min~17min,所述流动相A的体积分数由11%上升到21%,所述流动相B的体积分数由89%下降到79%;
17min~21min,所述流动相A的体积分数由21%上升到35%,流动相B的体积分数由79%下降到65%。
3.根据权利要求2所述的用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合的筛选方法,其特征在于,所述超高效液相色谱联用质谱的色谱条件还包括:柱温为35℃±10℃,流速为0.35mL/min±0.10mL/min。
4.根据权利要求2所述的用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合的筛选方法,其特征在于,所述超高效液相色谱联用质谱的质谱条件包括:质量分析器为四极杆-静电场轨道阱;电喷雾正离子模式,进行多反应监测。
5.根据权利要求4所述的用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合的筛选方法,其特征在于,所述超高效液相色谱联用质谱的质谱条件还包括:鞘气流速为10Arb±2Arb;辅助气流速为10Arb±2Arb;喷雾电压为3.80kV±0.2kV;毛细管温度为320℃±10℃;辅助气温度为320℃±10℃;碰撞能量为30%±5%。
6.根据权利要求1-5任一项所述的用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合的筛选方法,其特征在于,所述中华鳖鳖甲药材供试品溶液、乌龟龟甲药材供试品溶液、佛罗里达鳖鳖甲供试品溶液、角鳖鳖甲供试品溶液、中华鳖鳖甲标准汤剂供试品溶液、中华鳖醋鳖甲标准汤剂供试品溶液和乌龟醋龟甲标准汤剂供试品溶液的制备步骤分别为:
混合溶剂和中华鳖鳖甲药材,加热回流后,加入胰蛋白酶溶液酶解,制备中华鳖鳖甲药材供试品溶液;
混合溶剂和乌龟龟甲药材,加热回流后,加入胰蛋白酶溶液酶解,制备乌龟龟甲药材供试品溶液;
混合溶剂和佛罗里达鳖鳖甲,加热回流后,加入胰蛋白酶溶液酶解,制备佛罗里达鳖鳖甲供试品溶液;
混合溶剂和角鳖鳖甲,加热回流后,加入胰蛋白酶溶液酶解,制备角鳖鳖甲供试品溶液;
混合溶剂和中华鳖鳖甲标准汤剂,超声后,加入胰蛋白酶溶液酶解,制备中华鳖鳖甲标准汤剂供试品溶液;
混合溶剂和中华鳖醋鳖甲标准汤剂,超声后,加入胰蛋白酶溶液酶解,制备中华鳖醋鳖甲标准汤剂供试品溶液;
混合溶剂和乌龟醋龟甲标准汤剂,超声后,加入胰蛋白酶溶液酶解,制备乌龟醋龟甲标准汤剂供试品溶液。
7.一种鳖甲和龟甲的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
制备待测样品溶液;
对所述待测样品溶液进行超高效液相色谱联用质谱测定,将测定结果与权利要求1所述的筛选方法获得的用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合进行对比。
8.根据权利要求7所述的鳖甲和龟甲的检测方法,其特征在于,所述用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合包括中华鳖鳖甲特征多肽和乌龟龟甲特征多肽,所述中华鳖鳖甲特征多肽包括肽段1、肽段2和肽段3,所述乌龟龟甲特征多肽包括肽段4和肽段5;
所述肽段1的氨基酸序列为DGEAGAQGPPGAAGPAGER,对应的母离子质荷比为832.88,子离子质荷比为979.49和1036.52;
所述肽段2的氨基酸序列为GETGPVGVTGSVGPAGAR,对应的母离子质荷比为784.90,子离子质荷比为872.46和1028.55;
所述肽段3的氨基酸序列为GEVGPQGAIGPAGSSGPAGPIGAAGPAGSR,对应的母离子质荷比为834.09,子离子质荷比为743.38和953.52;
所述肽段4的氨基酸序列为GELGPQGAIGPAGNSGPAGPVGAAGPAGGR,对应的母离子质荷比为833.09,子离子质荷比为713.37和909.49:
所述肽段5的氨基酸序列为GESGPAGPAGPAGAR,对应的母离子质荷比为626.31,子离子质荷比为696.38和753.40。
9.根据权利要求7或8所述的鳖甲和龟甲的检测方法,其特征在于,所述超高效液相色谱联用质谱的色谱条件包括:以乙腈为流动相A,以体积分数为0.05%~0.2%的甲酸水溶液为流动相B,梯度洗脱,所述梯度洗脱包括如下程序:
0min~9min,所述流动相A的体积分数由8%上升到11%,所述流动相B的体积分数由92%下降到89%;
9min~11min,保持所述流动相A的体积分数为11%,所述流动相B的体积分数为89%;
11min~17min,所述流动相A的体积分数由11%上升到21%,所述流动相B的体积分数由89%下降到79%;
17min~21min,所述流动相A的体积分数由21%上升到35%,流动相B的体积分数由79%下降到65%。
10.根据权利要求7或8所述的鳖甲和龟甲的检测方法,其特征在于,所述超高效液相色谱联用质谱的色谱条件还包括:柱温为35℃±10℃,流速为0.35mL/min±0.10mL/min。
11.根据权利要求7或8所述的鳖甲和龟甲的检测方法,其特征在于,所述超高效液相色谱联用质谱的质谱条件包括:质量分析器为四极杆-静电场轨道阱;电喷雾正离子模式,进行多反应监测。
12.根据权利要求7或8所述的鳖甲和龟甲的检测方法,其特征在于,所述超高效液相色谱联用质谱的质谱条件还包括:鞘气流速为10Arb±2Arb;辅助气流速为10Arb±2Arb;喷雾电压为3.80kV±0.2kV;毛细管温度为320℃±10℃;辅助气温度为320℃±10℃;碰撞能量为30%±5%。
13.根据权利要求7或8所述的鳖甲和龟甲的检测方法,其特征在于,所述待测样品溶液的制备步骤包括:
混合溶剂和待测样品,加热回流或超声后,加入胰蛋白酶溶液酶解,制备待测样品溶液。
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