CN111157659B

CN111157659B - 一种啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法

Info

Publication number: CN111157659B
Application number: CN202010117888.2A
Authority: CN
Inventors: 孙珍; 于欣禾; 李宪臻
Original assignee: Dalian Polytechnic University
Current assignee: Dalian Polytechnic University
Priority date: 2020-02-25
Filing date: 2020-02-25
Publication date: 2022-11-11
Anticipated expiration: 2040-02-25
Also published as: CN111157659A

Abstract

本发明公开了一种啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，属于麸质蛋白的检测技术领域。本发明啤酒中麸质蛋白绝对定量的方法，包括如下步骤：(1)分别提取啤酒中的不溶性麸质蛋白组分F1和可溶性麸质蛋白组分F2；啤酒中的多肽F3(2)将步骤(1)得到的F1和F2进行酶解；F3进行除盐(3)将酶解后的麸质蛋白组分F1，F2和F3分别进行液相‑质谱分析；(4)进行麸质蛋白的鉴定；(5)麸质蛋白的绝对定量。本发明所述方法灵敏度高，可同时检测多种类型的麸质蛋白，精确度高，假阳性结果概率低。

Description

一种啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法

技术领域

本发明属于麸质蛋白的检测技术领域，具体涉及一种啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法。

背景技术

麸质蛋白是小麦，大麦，燕麦等禾本科家族中重要的储存蛋白复合物总称，存在于种子的胚乳中约占蛋白质总量的70-80％。前人按照此类蛋白的溶解度特点，将其分为可溶性醇组分和不溶于醇组分。谷类种子醇溶蛋白富含脯氨酸和谷氨酰胺，称为醇溶蛋白。醇溶蛋白包括：小麦中的麦醇溶蛋白(gliadin)和麦谷蛋白(glutenin)；大麦中的角蛋白(hordein)；黑麦中的醇溶蛋白(secalin)和燕麦中的燕麦蛋白(avenin)；高分子量谷蛋白(HMW-GS)和低分子量谷蛋白(LMW-GS)属于小麦的麦谷蛋白。不溶于醇组分的蛋白通常被认为是醇溶性蛋白质，因为在种子萌发过程中硫氧还蛋白的含量的变化，从而影响蛋白质结构中的二硫键在醇中的溶解度。

麸质蛋白是一类特殊的食品致敏原成分，也是国际上最早关注和研究的食品过敏原。乳糜泻患者对此类蛋白异常敏感是因为这类患者体内分解麦醇溶蛋白细胞酶活性较低，不能充分水解致病性植物蛋白抗原致使其与其他蛋白发生了免疫交叉反应。常见的临床症状包括：腹泻，食欲不振，骨质疏松等。据报道乳糜泻常与自身免疫性疾病有关，如Ⅰ型糖尿病。同时还与肠恶性肿瘤发病率相关，如肠癌，肠T细胞淋巴癌。近年来，相关疾病发病率日益增加，严重影响部分人群的生活质量。从而成为全球性需要解决的食品安全问题之一，引发人们的广泛关注。麸质蛋白广泛存在于啤酒，面包，酱油，饼干等食品中，是人们摄取蛋白质的重要来源。如今人们开发了几种治疗乳糜泻的方法，但效果不理想，目前唯一有效的治疗方法是严格的终身无麸质饮食。

啤酒是以大麦、小麦等含免疫原蛋白的谷类食品为主要原料发酵而成的饮料。在糖化，发酵过程中葡聚糖酶、蛋白酶、α-淀粉酶等一些酶可以将此类蛋白进行不同程度的降解，这将给提取过程带来了很大的难度。ELISA技术被证明是非常有效的检测麸质蛋白的方法，但在生产过程中麸质蛋白可能降解成肽段，影响其免疫表位的检测，从而不能精准的检测麸质蛋白的含量。目前，报道出两种酶联免疫吸附试验(ELISA)是最有效的分析麸质蛋白的方法。一种是抗黑麦(secalin)的单克隆抗体R5，它可以检测含有QQFP、QQQFP、LQPFP和QLPFP的氨基酸序列；另一种是针对检测ω-gliadins中含有PQPQPFPQE和PQQPPFPEE的表位。目前只研发出两种抗体对其进行检测，因抗体有限不能同时检测到多类麸质蛋白，容易出现假阳性和假阴性的结果，定量限最低在15ppm左右，与定义无麸质食品的定量限相同，对于含有低含量的麸质蛋白的食品，用此方法检测带来很大的难度。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种可以快速高效率的提取啤酒中麸质蛋白的方法，并且通过质谱与平行反应监测法(LC-PRM)对麸质蛋白中的特异性肽段进行绝对定量。经实验证明，本发明最多可以检测到一种啤酒中有256个麸质蛋白，通过LC-PRM方法对检测限为0.1ppt-1ppb范围内。本发明检测灵敏度高，即使采用1毫升的样品，仍可以检测到特异性肽段标记物。

本发明提供了一种啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，具体包括如下步骤：

(1)分别提取啤酒中的不溶性麸质蛋白组分F1、可溶性麸质蛋白组分F2以及啤酒中的多肽组分F3；

(2)将步骤(1)得到的F1和F2进行酶解，F3进行除盐；

(3)将酶解后的麸质蛋白组分F1和F2，以及除盐后的F3分别进行液相-质谱分析；

(4)以Sequest HT为搜索引擎，采用Proteome Discoverer软件对液相-质谱分析结果进行检索，通过与Uniprot数据库中的禾本科植物进行比对，完成麸质蛋白的鉴定；

(5)麸质蛋白的绝对定量：

a)挑选麸质蛋白的标准肽段，所述标准肽段序列如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7所示；

b)合成步骤a)中的标准肽段；

c)将组分F1、组分F2和组分F3分别进行液相-质谱分析；

d)将步骤c)得到的数据导入Skyline软件，即可得到麸质肽段的母离子的相对定量值；

e)将步骤b)得到的标准肽段分别以不同浓度分别进行液相-质谱分析；

f)将步骤e)得到的数据导入Skyline软件，得到每条标准肽段对应的响应值，根据响应值所对应的浓度制作各标准肽段的标准曲线；

g)将步骤d)得到的相对定量值带入步骤f)得到的标准曲线，从而得到每种麸质蛋白的绝对定量值。

进一步地，上述技术方案中，所述步骤(1)中啤酒中的不溶性麸质蛋白组分F1、可溶性麸质蛋白组分F2以及啤酒中的多肽组分F3的提取方法包括如下步骤：

①啤酒经过放置、超声处理进行消泡，将消泡后的啤酒加入截留分子质量为3kDa的超滤管中浓缩；

②超滤管外衬管中的溶液，即为啤酒中的多肽组分F3；

③取超滤管内衬管中的溶液，按体积比为1:3～4加入-20℃～-25℃的0.1M醋酸铵甲醇中，于-20℃～-25℃提取反应8h～20h；

④离心、分离沉淀和上清液，沉淀用丙酮清洗3～4次，风干，即得不溶性麸质蛋白组分F1；

⑤步骤③所述上清液加入-20℃的丙酮后，于-20℃～-25℃提取2h～10h，所得沉淀用丙酮清洗3～5次；离心，弃上清，风干，即得可溶性麸质蛋白组分F2。

进一步地，上述技术方案中，所述步骤①中的浓缩采取方式为4000g 4℃～10℃离心40～70min；所述步骤④与步骤⑤所采取的离心条件为8000g 4℃～10℃离心10～20min。

进一步地，上述技术方案中，所述步骤③中的0.1M醋酸铵甲醇还可以是：0.1M醋酸铵50％甲醇水(v：v)溶液、50％异丙醇水(v：v)溶液、80％异丙醇水(v：v)溶液或60％乙醇水(v：v)溶液。

进一步地，上述技术方案中，所述步骤(2)中的F1和F2进行酶解，具体包括如下步骤：

①将F1与F2分别溶于6M盐酸胍10mM～50mM Tris-Hcl(PH＝8.0～8.2)缓冲液中；

②分别将步骤①所得F1和F2装入截留分子质量为10kDa的超滤管中，分别加入100mmol/L二硫苏糖醇至浓度为20mmol/L，混匀后45℃～60℃孵育1h～1.5h后离心弃上清；

③分别加入100mmol/L碘乙酰胺至浓度为20mmol/L，避光反应40～45min后离心弃上清；

④沉淀物分别用10mmol/L的NH₄HCO₃清洗3～4次，离心弃上清；

⑤按照质量比为1:30～50的比例加入胰蛋白酶或糜蛋白酶，37℃酶解12h～24h；离心，收集外衬管中溶液。

进一步地，上述技术方案中，所述步骤①-④中的离心条件均为14000g，室温，离心20～30min。

进一步地，上述技术方案中，所述步骤(2)中的F3进行除盐的方法为：将组分F3通过固相微萃取柱，即可完成除盐。

进一步地，上述技术方案中，所述步骤(4)中与Uniprot数据库中的禾本科植物进行比对的肽鉴定的假检出率小于1％，肽允许最多有两个漏切位点；鉴定的参数设置如下：前体离子的质量误差设为10ppm，碎片离子的质量误差设为0.02Da；肽段设定范围为6～144个氨基酸；动态修饰设为甲硫氨酸上+15.995Da的氧化修饰，静态修饰设为半胱氨酸上+57.021Da的甲基化修饰，蛋白质N端的乙酰化为+42.011Da。

发明有益效果

麸质蛋白的种类繁多，并且其在醇中的溶解度会随着生长过程而改变，这给提取带来了很大的难度。本发明在提取过程中分成醇溶性和醇不溶性组分，能够提取出更多的麸质蛋白，并且重现性良好。

本发明提供一种可以快速高效率的提取啤酒中麸质蛋白的方法，并且通过质谱与平行反应监测法(LC-PRM)对麸质蛋白中的特异性肽段进行绝对定量。得到定量的肽段最高检出限为1μg/L(1ppb)，最低检出限为0.0001μg/L(0.1ppt)，较ELISA方法灵敏度相比，LC-PRM法测定麸质蛋白至少提高103倍，甚至更多。即使采用1毫升的样品，仍可以检测到特异性肽段标记物。经实验证明，本发明最多可以检测到一种啤酒中有256个麸质蛋白，实现了同时检测多种类型的麸质蛋白。并且Orbitrap质量分析器可以准确地计算出所定量的肽段的前体离子的荷质比，减少假阳性的结果概率。

具体实施方式

下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

1)麸质蛋白提取

①啤酒经过放置、超声等处理进行消泡，然后将20ml啤酒加入截留分子质量为3kDa的超滤管中，4000g 4℃离心60min浓缩。超滤管外衬管中的溶液为啤酒中的多肽组分F3。

②取5ml超滤管内衬管中的溶液，加入4倍体积的预冷至-20℃的0.1M醋酸铵甲醇，置于-20℃提取12h。

③8000g 4℃离心10min，分离沉淀和上清液，沉淀用丙酮清洗3次，风干，此组分为不溶性麸质蛋白组分F1。

④步骤③所述上清液加入-20℃的丙酮后，于-20℃提取4个小时，所得沉淀用丙酮清洗3次。8000g 4℃离心10min，弃上清，置于通风橱中风干，此组分为可溶性醇溶组分F2。

2)F1和F2的酶解与F3的除盐

①将F1与F2分别溶于500μL的6M盐酸胍10mMTris-Hcl(PH＝8.0)缓冲液中。

②选取F1与F2两个组分蛋白500μg分别装入截留分子质量10kDa的超滤管中，加入适量体积的100mmol/L二硫苏糖醇(DTT)使其浓度达到20mmol/L，混匀后50℃孵育1h后，14000g室温条件离心20min。

③加入适量体积的100mmol/L碘乙酰胺(IAA)使其浓度达到20mmol/L，避光反应40min后，14000g室温条件离心20min。

④用10mmol/L的NH₄HCO₃清洗3次，14000g室温条件离心20min。

⑤按照质量比为1:30的比例加入胰蛋白酶和糜蛋白酶，37℃酶解12h。14000g室温条件离心20min收集肽段(上清液)，备用，进行质谱分析。

⑥将未经过酶解的F3组分，取400微升通过Oasis HLB固相微萃取柱，进行除盐，所用洗脱液为80％乙腈，19.9％水，0.1％三氟乙酸(v：v)。将洗脱液进行真空冻干后用0.1％FA(v:v)溶液复溶。备用，进行质谱分析。

3)麸质蛋白的液相-质谱分析

液相条件：样品经过Ultimate 3000RSLC nano System，上样加载到C18PepMap100反相预柱上，通过C18毛细管(75μm i.d.×12cm)分析柱进行分离，进样量为1微升。流动相A：0.1％FA，B：80％ACN 0.1％FA流速：0.3微升/分钟。洗脱程序：0-10min(4％B)；10-13min(4-10％B)；13-35min(10-35％B)；35-41min(35-55％B)；41-42min(55-95％B)；42-52min(95％B)；52-53min(95-4％B)；53-70min(4％B)。

质谱条件：将分离得到的肽段通过nanoESI源离子化，在Q Exactive(ThermoFisher Scientific,USA)中进行串联质谱分析(MS/MS)。Orbitrap检测完整肽段的分辨率设为70000；使用27％标准化碰撞能量对选定的肽段进行MS/MS分析；Orbitrap检测离子碎片的分辨率设为17500，选取高于阈值离子计数3×10⁶的前15个母离子在一级MS全扫描之后进行MS/MS分析，动态排除设为30.0s。施加电压为：2.3KV，MS/MS的自动增益控制(AGC)设为1×10⁵，一级质谱扫描范围为350到1800m/z。

4)麸质蛋白的鉴定

以Sequest HT作为搜索引擎，将液相-质谱分析出来的结果通过ProteomeDiscoverer(2.2.0.388)进行检索。通过与Uniprot数据库中的禾本科植物(大麦214798个序列；小麦214165个序列)进行比对，进行麸质蛋白的种类鉴定。肽鉴定的假检出率控制(FDR)在1％以内。对于酶解后肽，胰蛋白酶和糜蛋白酶被指定为裂解酶，允许最多有两个漏切位点。只有符合完全切割特异性的肽才被允许。对于组分F3，未经消化的肽被搜索，没有指定的酶专一性。前体离子的质量误差设为10ppm，碎片离子的质量误差设为0.02Da。最小肽段设定为6个氨基酸，最大值设为144个。动态修饰设为甲硫氨酸上+15.995Da的氧化修饰，静态修饰设为半胱氨酸上+57.021Da的甲基化修饰，蛋白质N端的乙酰化为+42.011Da。

本实施例选用8种啤酒(1号-8号)详细信息如表1，依照上述方法进行麸质蛋白个数的检测，结果如表2所示。

表1 8种市售啤酒的详细信息

表2 8种啤酒每一组分(F1，F2，F3)鉴定到麸质蛋白的个数

5)麸质蛋白的绝对定量

①麸质蛋白的标准肽段的挑选标准：肽段来自于麸质蛋白；肽段长度在6-20个氨基酸；肽段带有两个电荷；没有漏切位点；不同多肽分离效果好；FDR＜1％；无动态修饰。挑选的标准肽段序列为：SEQ ID NO.1：DVSPECRPVAL；SEQ ID NO.2：QQVPQPQQPQQPF；SEQ IDNO.3：QPQQPFPL；SEQ ID NO.4：QQPQQTIPQQPQQPFPL；SEQ ID NO.5：SQQQPPF；SEQ ID NO.6：QPFPQPQPF；SEQ ID NO.7：SQQQQPVLPQQSPF；

②步骤①挑选出的标准肽段由南京杰肽生物科技有限公司合成。

③PRM方法的建立

液相条件与步骤3)相同；

质谱条件：

设置2.3kv的喷雾电压和275℃的毛细管温度；将合成的肽段荷质比输入到列表中进行二级质谱的扫描；设置350到2000m/z以70000的分辨率进行MS1全扫描，然后以35000的分辨率列表中的前体进行PRM扫描。MS2的AGC设定为1×10⁵。MS2的最大值为100ms，MS2的隔离窗设置为1m/z。

将步骤②合成的标准肽段按照上述条件进行液相-质谱检测。

④绝对定量

将组分F1、F2、F3按照步骤③方法进行液相-质谱检测，采集的原始数据导入Skyline软件(4.2.0.18305)，利用各肽高信噪比的产物离子面积进行相对定量计算；将步骤③得到的数据同样导入Skyline软件，得到相应的响应值。根据响应值所对应的浓度制作各肽的标准曲线，标准曲线如表4所示。将F1、F2、F3的相对定量的数据导入标准曲线中，从而得到各肽绝对定量的数据。本实施例选用的8种啤酒(1号-8号)中，7条麸质蛋白肽段的绝对定量值如表3所示。

表3 8种啤酒中7条麸质蛋白肽段的绝对定量值

表4合成肽段的具体信息

实施例2

将实施例1中步骤1)麸质蛋白提取中的步骤②中的0.1M醋酸铵甲醇分别替换成0.1M醋酸铵50％甲醇水溶液(v：v)、50％异丙醇水溶液(v：v)、80％异丙醇水溶液(v：v)；60％乙醇水溶液(v：v)；20％TCA丙酮(v：v)，进行麸质蛋白的提取，其余步骤同实施例1。结果如表5所示，采用上述提取液进行提取，分别可以得到麸质蛋白的个数为225个、167个、183个、207个、187个、32个。

如表6比较六种提取方法所鉴定的蛋白质覆盖率和检测到的肽段数量。以一种蛋白(uniprot ID：Q94IJ6)为例，除第六种提取液(20％TCA丙酮)外，其余5种的方法都可以检测到这个蛋白。结果表明：运用第一种方法鉴定到覆盖率为38％，比对到24条肽段，相比其他方法，通过0.1M醋酸铵甲醇为提取液鉴定到的蛋白覆盖率最高，肽段个数最多。此外还有A0A159k154，Q7Y074，Q5UNP2，Q8W3W8四种蛋白也可以得出同样的结论。尽管本实验未将所有鉴定到的蛋白都研究，但仍可以得出结论，使用第一种方法不仅可以识别更多的麸质蛋白，而且还可以增加蛋白质覆盖率和检测到的肽段个数。所以采用0.1M醋酸铵甲醇作为提取液提取效果最佳。

表5不同提取液提取得到麸质蛋白的个数

表6五种麸质蛋白的蛋白质覆盖率和鉴定肽的数目

注：表6中提取液1代表0.1M醋酸铵甲醇；2代表0.1M醋酸铵50％甲醇；3代表50％异丙醇；4代表80％异丙醇；5代表60％乙醇；6代表20％TCA丙酮

按照实施例1所述方法重复3次试验，F1与F2共鉴定到的结果如表7所示，可见，本发明所述方法重复性好，可信性高。

表7重复性试验

序列表

<110> 大连工业大学

<120> 一种啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法

<130> 2020

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Val Ser Pro Glu Cys Arg Pro Val Ala Leu

1 5 10

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Gln Val Pro Gln Pro Gln Gln Pro Gln Gln Pro Phe

1 5 10

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Pro Gln Gln Pro Phe Pro Leu

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Gln Pro Gln Gln Thr Ile Pro Gln Gln Pro Gln Gln Pro Phe Pro

1 5 10 15

Leu

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ser Gln Gln Gln Pro Pro Phe

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Pro Phe

1 5

<210> 7

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ser Gln Gln Gln Gln Pro Val Leu Pro Gln Gln Ser Pro Phe

1 5 10

Claims

1.一种啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)分别提取啤酒中的不溶性麸质蛋白组分F1、可溶性麸质蛋白组分F2以及啤酒中的多肽组分F3，包括如下步骤：

②超滤管外衬管中的溶液，即为啤酒中的多肽组分F3；

③取超滤管内衬管中的溶液，按体积比为1:3～4加入-20℃～-25℃的0.1M醋酸铵甲醇或0.1M醋酸铵体积比50％甲醇水溶液或体积比50％异丙醇水溶液或体积比80％异丙醇水溶液或体积比60％乙醇水溶液中，于-20℃～-25℃提取反应8h～20h；

⑤步骤④所述上清液加入-20℃的丙酮后，于-20℃～-25℃提取2h～10h，所得沉淀用丙酮清洗3～5次；离心，弃上清，风干，即得可溶性麸质蛋白组分F2；

(2)将步骤(1)得到的F1和F2进行酶解，F3进行除盐；

(5)麸质蛋白的绝对定量：

a)挑选麸质蛋白的标准肽段，所述标准肽段序列如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ IDNO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7所示；

b)合成步骤a)中的标准肽段；

c)将组分F1、组分F2和组分F3分别进行液相-质谱分析；

g)将步骤d)得到的相对定量值带入步骤f)得到的标准曲线，从而得到每种麸质蛋白的绝对定量值；

液相条件：通过75μm i.d.×12cm的C18毛细管分析柱进行分离；流动相A：0.1％FA，B：80％ACN 0.1％FA；洗脱程序：0-10min 4％B；10-13min 4-10％B；13-35min10-35％B；35-41min 35-55％B；41-42min 55-95％B；42-52min 95％B；52-53min 95-4％B；53-70min 4％B。

2.根据权利要求1所述的啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，其特征在于，所述步骤①中的浓缩采取方式为4000g 4℃～10℃离心40～70min；所述步骤④与步骤⑤所采取的离心条件为8000g 4℃～10℃离心10～20min。

3.根据权利要求1所述的啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，其特征在于，所述步骤(2)中的F1和F2进行酶解，具体包括如下步骤：

①将F1与F2分别溶于6M盐酸胍10mM～50mM Tris-Hcl PH＝8.0～8.2缓冲液中；

④沉淀物分别用10mmol/L的NH₄HCO₃清洗3～4次，离心弃上清；

4.根据权利要求3所述的啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，其特征在于，所述步骤①-④中的离心条件均为14000g，室温，离心20～30min。

5.根据权利要求1所述的啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，其特征在于，所述步骤(2)中的F3进行除盐的方法为：将组分F3通过固相微萃取柱，即可完成除盐。

6.根据权利要求1所述的啤酒中麸质蛋白的鉴定和绝对定量方法，其特征在于，所述步骤(4)中与Uniprot数据库中的禾本科植物进行比对的肽鉴定的假检出率小于1％，肽允许最多有两个漏切位点；鉴定的参数设置如下：前体离子的质量误差设为10ppm，碎片离子的质量误差设为0.02Da；肽段设定范围为6～144个氨基酸；动态修饰设为甲硫氨酸上+15.995Da的氧化修饰，静态修饰设为半胱氨酸上+57.021Da的甲基化修饰，蛋白质N端的乙酰化为+42.011Da。