CN113341036B

CN113341036B - 一种评价天然蜂花粉与酶法破壁蜂花粉致敏性的方法

Info

Publication number: CN113341036B
Application number: CN202110894683.XA
Authority: CN
Inventors: 李强强; 陶宇逍; 尹舒婷; 吴黎明; 薛晓锋; 王妙
Original assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-08-05
Filing date: 2021-08-05
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2041-08-05
Also published as: CN113341036A

Abstract

本发明涉及食品技术领域，具体涉及一种基于胱抑素（Cystatin）和前纤维蛋白（Profilin）指标评价天然蜂花粉及破壁蜂花粉致敏性的方法。本发明首次提出以胱抑素（Cystatin）和前纤维蛋白（Profilin）作为天然蜂花粉或破壁蜂花粉的致敏性评价指标，并据此提供具体评价方法。同时本发明还进一步优化了斑点免疫印迹法在测定天然蜂花粉与破壁蜂花粉致敏性上的应用，作为相互验证的手段。本发明所述的评价方法能够快速、准确地对天然蜂花粉与破壁蜂花粉致敏性进行评价，为蜂花粉的标准化生产和品质控制提供评估依据。

Description

一种评价天然蜂花粉与酶法破壁蜂花粉致敏性的方法

技术领域

本发明涉及食品技术领域，具体涉及一种基于胱抑素和前纤维蛋白评价天然蜂花粉与酶法破壁蜂花粉致敏性的方法。

背景技术

基于降低蜂花粉的致敏性，使蜂花粉的营养成分得到更充分的释放，提高蜂花粉的营养价值等原因，现有技术通常将蜂花粉进行加工处理，如破壁、发酵、酶解等。如CN102948656A公开了一种针对花粉的破壁、脱敏、水溶性成分提取的方法，其通过酶切处理提高了花粉的破壁率，同时一定程度解决了花粉易致敏的问题。

然而，在此类破壁蜂花粉的实际使用过程中，消费者因食用酶法破壁蜂花粉而过敏的情况时有发生；而目前现有技术中缺少针对酶法破壁蜂花粉致敏性的快捷、准确的评价方法。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明针对现有技术中缺乏针对酶法破壁蜂花粉致敏性评价方法的问题，提出一种有效的评价方法。

本发明通过对现有蜂花粉致敏性研究后发现，蜂花粉中存在多种致敏蛋白，包括前纤维蛋白（Profilin）、扩张蛋白（Expansin）、醇溶谷蛋白（Prolamin）、油质蛋白（OleosinB2）和谷氧还蛋白（Glutaredoxin）等等。但在针对酶法破壁蜂花粉致敏性研究后发现，上述致敏蛋白难以对破壁蜂花粉致敏性进行准确、有效评价。

为此，本发明基于蛋白组学技术对酶法破壁蜂花粉蛋白提取物进一步分析鉴定，发现了一种此前未在蜂花粉中见到的致敏蛋白，即胱抑素（Cystatin）。并进一步发现，胱抑素和前纤维蛋白联合作为评价指标可实现对酶法破壁蜂花粉致敏性的有效评价，同时该联合指标也可作为未经处理的天然蜂花粉致敏性的评价指标。

基于此，本发明第一方面提供致敏蛋白前纤维蛋白和胱抑素作为蜂花粉致敏性评价指标的新应用；所述蜂花粉为天然蜂花粉或酶法破壁蜂花粉。

进一步优选地，所述蜂花粉为天然油菜蜂花粉或经酶解处理的酶法破壁油菜蜂花粉。

更进一步地，所述酶法破壁油菜蜂花粉是经纤维素酶、果胶酶及木瓜蛋白酶酶解制得的油菜蜂花粉。

本发明的第二方面提供上述蜂花粉致敏性的评价方法。通过该方法可以快速、准确的评价此类蜂花粉是否具有致敏性，为此类蜂花粉的标准化生产和品质控制提供评估依据。

本发明提供的上述蜂花粉致敏性的评价方法，包括：以胱抑素和前纤维蛋白为评价指标，利用蛋白组学技术检测蜂花粉蛋白提取物中胱抑素和前纤维蛋白的特征肽段，根据质谱检测及分析结果评价样品的致敏性；

所述蜂花粉为未经破壁处理的天然蜂花粉或经酶解处理的酶法破壁蜂花粉。

进一步地，本发明所述的评价方法中，在所述蛋白组学技术检测实施前，对蜂花粉蛋白提取物进行酶切处理；

所述酶切处理使用的酶为质谱级胰蛋白酶；所述蛋白提取物中蛋白质量与胰蛋白酶的质量比为（30-100）：1；优选50:1。研究表明，通过控制胰酶用量，起到充分酶切蜂花粉蛋白提取物的作用，同时又避免过度酶切而影响鉴定结果的准确性。

所述酶切处理的条件为：37℃下孵育12-14 h。

所述蛋白组学检测条件为：

所述检测采用纳升级液相色谱仪串联组合型质谱仪进行；

EASY-nLC 1000纳升级液相色谱仪串联LTQ-Orbitrap Elite组合型质谱仪（Thermo Fisher Scientific，USA）；

富集柱（100 μm × 2 cm，5 μm）和分析柱（75 μm × 15 cm，3 μm，100 Å）均为Thermo Fisher Scientific公司生产的反相 C18柱；

色谱条件设置如下：流动相流速为350 nL/min，流动相A为 0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液；

流动相洗脱梯度设置如下：

时间（min）流动相A 流动相B

0 97 3

5 92 8

85 80 20

105 70 30

110 10 90

120 10 90

质谱条件设置如下：

一级全扫描：离子源为电喷雾离子源（ESI），喷雾电压为2.3 kV，离子传输管温度为275℃，S-Lens射频为55%，分辨率为60000，扫描范围为 300-8000 m/z。

二级扫描是在一级扫描基础上进行的，选取前20个离子信号强度最强的母离子。二级扫描参数：分辨率为15000，隔离窗口为2 m/z，碎裂模式为高能碰撞离子解离（HCD），能量为30 %。

通过上述质谱检测条件的优化，起到提高质谱检测灵敏度和准确度的作用。

本发明所述的评价方法中，所述质谱检测及分析还包括：

根据蛋白质组学检测获得的质谱数据，利用Uniprot蛋白质数据库检索获得蛋白质氨基酸序列；

根据蛋白质氨基酸序列，利用AllergenOnline致敏蛋白数据库进行蛋白质序列同源性比对，获得胱抑素和前纤维蛋白的特征肽段；

通过DNAStar软件根据胱抑素和前纤维蛋白的一级序列进行抗原表位分析。

进一步地，为了提高上述蜂花粉致敏性评价方法的准确性，本发明所述的评价方法还包括：利用斑点免疫印迹技术进行相互验证；

所述斑点免疫印迹技术包括：蛋白提取、蛋白上样、孵育抗体、膜显色反应。

更进一步地，为了解决斑点免疫显色方法对蜂花粉致敏性检测的适用性问题，本发明对蛋白的上样量、孵育抗体所用抗体的选用及比例进行优化；具体为：所述蛋白的上样量为20~100 μg；且所用抗体为按体积比1：1000~2000比例稀释的人血清IgE抗体和按体积比1：1000~2000比例稀释的HRP标记抗人IgE小鼠单克隆抗体。

作为本发明的具体实施方式之一，所述斑点免疫印迹技术具体步骤如下：

（1）利用植物蛋白提取试剂盒对不同处理组的蜂花粉粉末进行蛋白提取，然后利用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒测定各组样品蛋白提取液的蛋白浓度；

（2）准备一张5 cm×5 cm的硝化纤维膜，将4组样品点在膜上，保证各组样品蛋白上样量相同，为20~100 μg，然后将膜晾干；

（3）将膜放入含有5% BSA的10cm培养皿中浸泡，室温孵育1 h，然后将膜取出放入按体积比1：1000~2000比例稀释的含有人血清IgE抗体的BSA溶液中室温孵育1 h；

（4）将膜取出后用TBS-T溶液清洗3次，每次5min，然后将膜放入按体积比1：1000~2000比例稀释的含有HRP标记抗人IgE小鼠单克隆抗体的BSA溶液中室温孵育1 h；

（5）将膜取出后用TBS-T溶液清洗3次，每次5min，然后利用DAB显色试剂盒按照操作说明进行膜显色反应，直至膜上有棕色点显现后终止反应，并将膜晾干后扫描留存。

在上述斑点免疫印迹技术中，所述蛋白上样量为20~100 μg，所用抗体为按1：1000~2000比例稀释的人血清IgE抗体和按1：1000~2000比例稀释的HRP标记抗人IgE小鼠单克隆抗体均为针对天然蜂花粉及酶法破壁蜂花粉样品进行的剂量参数优化而获得，以使斑点免疫印迹技术更适用于此类蜂花粉，使评价结果更准确。

本发明提出的评价方法能够快速准确地对天然蜂花粉或酶法破壁蜂花粉中致敏原进行鉴定，解决了一直以来限制蜂花粉开发和应用的致敏性难题。

本发明的有益效果如下：

本发明从天然油菜蜂花粉中鉴定出一种新的致敏原（即胱抑素），并基于此首次提出以胱抑素和前纤维蛋白作为评价天然蜂花粉与酶法破壁蜂花粉致敏性的指标，并提供具体评价步骤。

同时，在该联合指标的评价方法基础上，本发明还进一步提出通过优化的斑点免疫印迹法应用于测定天然蜂花粉与酶法破壁蜂花粉的致敏性，以此作为补充手段，进一步验证天然蜂花粉与酶法破壁蜂花粉致敏性的评价结果。

本发明所述的评价方法具有准确性高、方便快捷的优点，为天然蜂花粉与酶法破壁蜂花粉的标准化生产和品质控制提供评估依据。

附图说明

图1为胱抑素（Cystatin）的抗原表位分析结果。

图2为前纤维蛋白（Profilin）的抗原表位分析结果。

图3为未经破壁的天然油菜蜂花粉（BP）、经纤维素酶和果胶酶酶解处理的破壁油菜蜂花粉（EBP-A）、经纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶酶解处理的破壁油菜蜂花粉（EBP-B）中胱抑素和前纤维蛋白含量的差异。

图4为未经破壁的天然油菜蜂花粉（BP）、经纤维素酶和果胶酶酶解处理的破壁油菜蜂花粉（EBP-A）、经纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶酶解处理的破壁油菜蜂花粉（EBP-B）中蛋白提取物与免疫球蛋白E（IgE）的特异性结合水平。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中涉及的试剂耗材均可通过市售购买得到。

试验样品的制备

本发明所述评价方法所适用的样品为未经破壁处理的天然油菜蜂花粉冻干粉，以及两种经酶解处理的破壁油菜蜂花粉冻干粉，该样品可通过市售购买得到，或自制。

本发明所述样品可通过下述方法制得。

样品1：经纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶酶解处理的破壁油菜蜂花粉冻干粉；

其制备方法，具体步骤如下：

1）准确称取5.0g研磨好的油菜蜂花粉粉末（100~300目），并加入10mL蒸馏水，涡旋混匀后密封包装于食品级自封袋内，然后进行巴氏杀菌，条件为63℃，30 min，获得蜂花粉溶液；

2）杀菌完成后在无菌超净工作台内转移蜂花粉溶液至无菌离心管中，然后分别按300 U/g蜂花粉加入纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶，充分混合后用质量浓度为2%的维生素C溶液调整pH值至4.0，然后于无菌恒温培养箱内45℃下孵育24 h，获得酶解蜂花粉溶液；

3）利用真空冷冻干燥机对酶解蜂花粉溶液进行真空冷冻干燥，所需干燥时长约为48 h，获得酶解蜂花粉冻干粉。

利用GB 5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》测定，该冻干粉的含水量在7%以下，符合要求。

样品2：经纤维素酶、果胶酶酶解处理的破壁油菜蜂花粉冻干粉；

其制备方法与实施例1的制备工艺的区别在于：加入450 U/g蜂花粉的纤维素酶和450 U/g蜂花粉的果胶酶，未加入木瓜蛋白酶。

样品3：市售购买得到的未经破壁处理的常规天然油菜蜂花粉冻干粉。

实施例1

本实施例提供了一种评价油菜蜂花粉致敏性的方法，具体步骤如下：

1）蛋白抽提，得到沉淀蛋白：

分别准确称取100.0mg样品1~3，加入1mL蛋白抽提剂；

超声破碎，条件为超声3s，间隔3s，重复30次，超声结束后继续室温振荡30-60min；

然后于4℃，13000g条件下离心15min，吸取400μL上清液，并向其中加入2mL丙酮冰上放置60min以沉淀蛋白，去上清，得到沉淀蛋白；

其中，蛋白抽提剂由pH7.4的25mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、150mmol/L氯化钠、1mmol/L乙二胺四乙酸、1%乙基苯基聚乙二醇和5%甘油组成。

2）蛋白酶切，得到肽段：

2.1）沉淀蛋白的复溶，得到复溶蛋白溶液：

沉淀蛋白用100μL 5mol/L尿素溶液复溶，得到复溶蛋白溶液；

然后利用Brandford法测定复溶蛋白溶液的蛋白浓度；再根据蛋白浓度计算蛋白质量；

2.2）乙酰化反应：

向复溶蛋白溶液中加入400μL 40mmol/L碳酸氢铵溶液，然后加入50μL 100mmol/L二硫苏糖醇溶液，室温反应1h，再加入250μL 100mmol/L碘乙酰胺溶液，室温避光1h，进行乙酰化反应。

2.3）酶解，孵育：

向乙酰化后的蛋白溶液中加入蛋白质量的1/50的质谱级胰酶（Trypsin），37℃下孵育12h，加入1µL甲酸终止反应。

3）肽段除盐：

肽段除盐采用的是Millipore公司的除盐洗脱柱Ziptips，操作如下：

首先用Ziptip活化液和平衡液分别冲洗ZiptipC18柱10次，然后用Ziptip反复抽吸孵育后的蛋白溶液10次，使其肽段充分结合在Ziptip柱上，再利用Ziptip洗脱液冲洗柱上吸附的肽段，重复10次。

将带有肽段的洗脱液进行真空干燥，然后用0.1%甲酸溶液溶解，于4℃，13000g条件下离心10min取上清。

用Nanodrop2000测定肽段浓度；根据肽段浓度，确定质谱上样体积。

4）质谱检测鉴定：

利用EASY-nLC1000纳升级液相色谱仪串联LTQ-OrbitrapElite组合型质谱仪（ThermoFisherScientific，USA）；其中：

富集柱（100μm×2cm，5μm）和分析柱（75μm×15cm，3μm，100Å）均为ThermoFisherScientific公司生产的反相C18柱。

色谱条件设置如下：

流动相流速为350nL/min，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液。

流动相洗脱梯度设置见表1。

质谱条件设置如下：

一级全扫描：离子源为电喷雾离子源（ESI），喷雾电压为2.3kV，离子传输管温度为275℃，S-Lens射频为55%，分辨率为60000，扫描范围为300-8000m/z。

二级扫描是在一级扫描基础上进行的，选取前20个离子信号强度最强的母离子。二级扫描参数：分辨率为15000，隔离窗口为2m/z，碎裂模式为高能碰撞离子解离（HCD），能量为30%。

5）检测数据分析

经质谱采集的原始数据导入PeaksDB7.5分析软件进行定性分析。定性分析的参数设置如下：

从Uniprot下载芸苔属植物（Brassica）蛋白质数据库进行质谱数据检索。设置母离子质量误差为15ppm，子离子质量误差为0.05Da，Trypsin酶切最大漏切位点数为2，可变修饰为oxidation（M,+15.99），固定修饰为carbamidomethyl（C,+57.02）。所有检索结果采用正反库融合的算法控制蛋白和肽段的假阳性率（FDR）小于1%。

经Uniprot蛋白质数据库检索获得的蛋白质氨基酸序列，采用AllergenOnline致敏蛋白数据库进行蛋白质序列同源性比对，获得胱抑素和前纤维蛋白的特征肽段（见表2），由此验证了样品1-3中含有胱抑素和前纤维蛋白这两种蛋白。

进一步地，通过DNAStar软件，根据胱抑素和前纤维蛋白的一级序列进行抗原表位分析。检测结果显示：经抗原表位分析为阳性，验证了胱抑素和前纤维蛋白潜在的致敏能力（见图1~2）。

进一步地，经相对定量分析发现，相比较样品3，样品1-2中胱抑素和前纤维蛋白的含量显著下降（见图3），说明了样品1-2的破壁油菜蜂花粉冻干粉的致敏性较低，安全性相对较高，不会引起临床过敏症状或引起临床过敏症状的几率较低。

实施例2:

为了提高致敏性评价的准确性，本发明对样品1~3进行斑点免疫印迹检测。具体检测步骤如下：

1、试验分组：

天然油菜蜂花粉组（BP），即样品3，准备3个平行样品；

经纤维素酶和果胶酶酶解处理的破壁油菜蜂花粉（EBP-A）组，即样品2，准备3个平行样品；

经纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶酶解处理的破壁油菜蜂花粉（EBP-B）组，即样品1，准备3个平行样品；

2、试验步骤：

（1）、利用植物蛋白提取试剂盒，按照操作说明对同质量的样品1~3进行蛋白提取；

然后利用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒，按照操作说明测定各组样品蛋白提取液的蛋白浓度；

（2）、准备一张5 cm×5 cm的硝化纤维膜，将4组样品点在膜上，各组样品的蛋白上样量均为50 μg，然后将膜晾干；

（3）、将膜放入含有5% BSA的10cm培养皿中浸泡，室温孵育1 h，然后将膜取出放入按1：1000比例稀释的含有人血清IgE抗体的BSA溶液中室温孵育1 h；

（4）、将膜取出后用TBS-T溶液清洗3次，每次5 min，然后将膜放入按1：1500比例稀释的含有HRP标记抗人IgE小鼠单克隆抗体的BSA溶液中室温孵育1 h；

（5）、将膜取出后用TBS-T溶液清洗3次，每次5 min，然后利用DAB显色试剂盒，按照操作说明进行膜显色反应，直至膜上有棕色点显现后终止反应，并将膜晾干后扫描留存。

3、试验结果：

斑点免疫印迹检测结果显示：

（1）未经破壁处理的天然油菜蜂花粉中，蛋白提取物与免疫球蛋白E（IgE）的特异性结合水平最高；

（2）经纤维素酶和果胶酶酶解处理的破壁油菜蜂花粉蛋白提取物与IgE特异性结合水平较未经破壁处理的油菜蜂花粉中蛋白提取物显著下降，但与经纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶酶解处理的破壁油菜蜂花粉中蛋白提取物相比较高；

（3）经纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶酶解处理的破壁油菜蜂花粉中蛋白提取物与IgE的特异性结合水平最低；

如图4所示，经纤维素酶和果胶酶酶解处理的破壁油菜蜂花粉的致敏性有所改善，但效果不如经纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶酶解处理的破壁油菜蜂花粉好。该结果进一步验证了实施例1对致敏蛋白的检测结果，可用来作为补充方法进一步验证对天然蜂花粉与破壁蜂花粉致敏性评价的准确性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.胱抑素和前纤维蛋白在蜂花粉致敏性评价中作为评价指标的应用；所述蜂花粉为天然蜂花粉或酶法破壁蜂花粉。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蜂花粉为天然油菜蜂花粉或酶法破壁油菜蜂花粉。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述酶法破壁油菜蜂花粉是指经纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶酶解制得的油菜蜂花粉。

4.一种蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，以胱抑素和前纤维蛋白作为评价指标；所述蜂花粉为天然蜂花粉或酶法破壁蜂花粉。

5.根据权利要求4所述的蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，利用蛋白组学技术检测蜂花粉样品的蛋白提取物中胱抑素和前纤维蛋白的特征肽段，根据质谱检测及分析结果评价蜂花粉样品的致敏性。

6.根据权利要求5所述的蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，在所述蛋白组学技术检测实施前，对蜂花粉蛋白提取物进行酶切处理；

所述酶切处理使用的酶为质谱级胰蛋白酶；所述蛋白提取物中蛋白质量与胰蛋白酶的质量比为（30-100）：1。

7.根据权利要求6所述的蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，所述蛋白组学检测条件为：

所述检测采用纳升级液相色谱仪串联组合型质谱仪进行；

富集柱和分析柱均为反相C18柱；

色谱条件设置如下：

流动相流速为350 nL/min，流动相A为 0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液；

流动相洗脱梯度设置如下：

时间（min）流动相A 流动相B

0 97 3

5 92 8

85 80 20

105 70 30

110 10 90

120 10 90

质谱条件设置如下：

一级全扫描：

离子源为电喷雾离子源ESI，喷雾电压为2.3 kV，离子传输管温度为275℃，S-Lens射频为55%，分辨率为60000，扫描范围为 300-8000 m/z；

二级扫描是在一级扫描基础上进行的，选取前20个离子信号强度最强的母离子；

二级扫描参数：分辨率为15000，隔离窗口为2 m/z，碎裂模式为高能碰撞离子解离HCD，能量为30 %。

8.根据权利要求7所述的蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，所述质谱检测及分析还包括：

9.根据权利要求8所述的蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，所述评价方法还包括：利用斑点免疫印迹技术进行相互验证；

10.根据权利要求9所述的蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，所述蛋白的上样量为20~100 μg；

所述孵育抗体中所用抗体为按体积比1：1000~2000比例稀释的人血清IgE抗体和按体积比1：1000~2000比例稀释的HRP标记抗人IgE小鼠单克隆抗体。