CN113176362B - 一种评估天然蜂花粉及发酵蜂花粉致敏性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及食品技术领域，具体涉及一种基于油质蛋白和谷氧还蛋白特征肽指标评价天然蜂花粉及发酵蜂花粉致敏性的方法。本发明首次提出以油质蛋白（Oleosin B2）和谷氧还蛋白（Glutaredoxin）作为未经处理的天然蜂花粉或经发酵处理的蜂花粉致敏性评价的评价指标，并据此提供具体评价过程。同时，在特定蛋白评价方法基础上，本发明还进一步提出通过检测蜂花粉的甲醇提取物中寡肽和氨基酸的含量作为补充手段，进一步验证蜂花粉致敏性的评价结果。本发明所述的评价方法具有准确性高、方便快捷的优点，为蜂花粉的标准化生产和品质控制提供评估依据。

Description

一种评估天然蜂花粉及发酵蜂花粉致敏性的方法
技术领域
本发明涉及食品技术领域，具体涉及一种基于油质蛋白和谷氧还蛋白特征肽指标评估天然蜂花粉及发酵蜂花粉致敏性的方法。
背景技术
蜂花粉因其丰富的营养价值、极高的食用和药用功效，目前已在食品、保健品、药品行业，以及畜牧养殖方面有所应用。然而，随着蜂花粉适用范围的扩大，食用蜂花粉随即带来的安全问题也逐渐引起人们的关注。
蜂花粉来源于植物花粉，虽然经过工蜂的处理，一部分致敏物质发生改变或降解，致敏性较其植物源花粉有所改善；但数据显示，仍有一部分易感人群食用蜂花粉后会产生临床过敏症状。
发酵法已被公认为是一种改善蜂花粉致敏性的主要加工方法，目前发酵蜂花粉已逐渐获得开发和应用。然而，由于现有技术缺少评估蜂花粉致敏性的科学方法，常规食品的致敏性评价方法无法准确评估蜂花粉的致敏程度，因此制约了蜂花粉发酵产品的标准化生产和品质控制。
发明内容
本发明通过对现有蜂花粉致敏性的研究发现，蜂花粉中存在多种致敏蛋白，如Profilin、Expansin、Prolamin以及油质蛋白（Oleosin B2）和谷氧还蛋白（Glutaredoxin）。
进一步地，通过对上述致敏蛋白的研究，本发明发现其中2种致敏蛋白，即油质蛋白（Oleosin B2）和谷氧还蛋白（Glutaredoxin），可作为天然蜂花粉或发酵蜂花粉致敏性的评价指标。
基于此，本发明的第一方面提供致敏蛋白油质蛋白（Oleosin B2）和谷氧还蛋白（Glutaredoxin）的新应用，即其在蜂花粉致敏性的评价中作为评价指标的应用。
进一步优选地，所述蜂花粉为未经处理的天然油菜蜂花粉或经发酵处理的发酵油菜蜂花粉。
更进一步地，所述发酵油菜蜂花粉是指经酵母菌和/或乳酸菌发酵制得的油菜蜂花粉。
本发明的第二方面提供上述蜂花粉致敏性的评价方法。通过该方法可以快速、准确的评价此类蜂花粉是否具有致敏性，为此类蜂花粉的标准化生产和品质控制提供评估依据。
本发明提供的上述蜂花粉致敏性的评价方法，包括：以油质蛋白（Oleosin B2）和谷氧还蛋白（Glutaredoxin）为评价指标，利用蛋白组学技术检测蜂花粉蛋白提取物中油质蛋白和谷氧还蛋白的特征肽段，根据质谱检测及分析结果评价样品的致敏性；
所述蜂花粉为未经处理的天然蜂花粉或经发酵处理的发酵蜂花粉。
进一步地，本发明所述的评价方法中，在所述蛋白组学技术检测实施前，对蜂花粉蛋白提取物进行酶切处理；
所述酶切处理使用的酶为质谱级胰蛋白酶；所述蛋白提取物中蛋白质量与胰蛋白酶的质量比为（30-100）：1；优选50:1。研究表明，通过控制胰酶用量，起到充分酶切蜂花粉蛋白提取物的作用，同时又避免过度酶切而影响鉴定结果的准确性。
所述酶切处理的条件为：37℃下孵育12-14 h。
所述蛋白组学检测条件为：
所述检测采用纳升级液相色谱仪串联组合型质谱仪进行；
EASY-nLC 1000纳升级液相色谱仪串联 LTQ-Orbitrap Elite组合型质谱仪（Thermo Fisher Scientific，USA）；
富集柱（100 μm × 2 cm，5 μm）和分析柱（75 μm × 15 cm，3 μm，100 Å）均为Thermo Fisher Scientific公司生产的反相 C18柱。
色谱条件设置如下：流动相流速为350 nL/min，流动相A为 0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液。
流动相洗脱梯度设置如下：
Figure 140561DEST_PATH_IMAGE001
质谱条件设置如下：
一级全扫描：离子源为电喷雾离子源（ESI），喷雾电压为2.3 kV，离子传输管温度为275℃，S-Lens射频为55%，分辨率为60000，扫描范围为 300-8000 m/z。
二级扫描是在一级扫描基础上进行的，选取前20个离子信号强度最强的母离子。二级扫描参数：分辨率为15000，隔离窗口为2 m/z，碎裂模式为高能碰撞离子解离（HCD），能量为30 %。
通过上述质谱检测条件的优化，起到提高质谱检测灵敏度和准确度的作用。
本发明所述的评价方法中，所述质谱检测及分析还包括：
根据蛋白质组学检测获得的质谱数据，利用Uniprot蛋白质数据库检索获得蛋白质氨基酸序列；
根据蛋白质氨基酸序列，利用AllergenOnline致敏蛋白数据库进行蛋白质序列同源性比对，获得油质蛋白（Oleosin B2）和谷氧还蛋白（Glutaredoxin）的特征肽段；
通过DNAStar软件根据油质蛋白和谷氧还蛋白的一级序列进行抗原表位分析。
进一步地，本发明还对油质蛋白和谷氧还蛋白的发酵代谢产物进行研究。研究发现，蜂花粉样品经发酵代谢后其产物中含有5种寡肽，包括Phe Ile、Glu Ile、Ile Ala Val、Glu Leu、Val Val；以及4种氨基酸，包括缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸。基于此，本发明提出还可在上述评价方法基础上，进一步结合蜂花粉中寡肽和氨基酸的含量来协同评价蜂花粉的致敏性，可进一步提高评价的准确性。
具体来讲，本发明所述的评价方法还包括：利用代谢组学技术检测蜂花粉甲醇提取物中的寡肽和氨基酸，并根据检测结果进一步评价蜂花粉的致敏性。
所述代谢组学检测条件为：
超高效液相色谱系统为安捷伦1290 Infinity II UPLC系列；使用ORBAXEclipase Plus C18 Rapid Resolution HD色谱柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm，AgilentTechnologies，CA，USA）。
分别在正、负离子模式下采集。
流动相A：含质量分数0.1%甲酸的水溶液；
流动性B：含质量分数0.1%甲酸的乙腈；
流速设置为0.3 mL/min，进样量为2 μL。
流动相梯度设置如下：
Figure 825751DEST_PATH_IMAGE002
质谱系统为安捷伦6545 ESI-Q-TOF高分辨高精度系列，选用正、负离子两种采集模式。
质谱参数设置如下：
正离子模式下毛细管电压，3.5 kV；
负离子模式下毛细管电压，3.0 kV；
碎裂电压，135 V；
干燥气温度，325℃；
干燥气流速，10 L/min；
喷雾电压，35 psi；
鞘气温度，370℃；
鞘气流速，12 L/min；
碰撞能，20 eV；
质谱范围，100-1700 m/z。
氮气用于干燥、雾化和碰撞。
参比离子用于质量精度的校准，正离子模式下参比离子为121.050873和922.009798；负离子模式下参比离子为112.985587和1033.988109。
安捷伦Mass Hunter工作站软件用于化合物的分析。
本发明的有益效果如下：
本发明首次提出以油质蛋白（Oleosin B2）和谷氧还蛋白（Glutaredoxin）作为未经处理的天然蜂花粉或经发酵处理的蜂花粉致敏性评价的评价指标，并据此提供具体评价过程。
同时，在特定蛋白评价方法基础上，本发明还进一步提出通过检测蜂花粉的甲醇提取物中寡肽和氨基酸的含量作为补充手段，进一步验证蜂花粉致敏性的评价结果。
本发明所述的评价方法具有准确性高、方便快捷的优点，为蜂花粉的标准化生产和品质控制提供评估依据。
附图说明
图1为基于蛋白组学技术从油菜蜂花粉中鉴定得到的油质蛋白（Oleosin B2）的代表性特征质谱图。
图2为基于蛋白组学技术从油菜蜂花粉中鉴定得到的谷氧还蛋白（Glutaredoxin）的代表性特征质谱图。
图3为油质蛋白（Oleosin B2）的抗原表位分析结果。
图4为谷氧还蛋白（Glutaredoxin）的抗原表位分析结果。
图5未发酵油菜蜂花粉（BP）、酵母菌发酵油菜蜂花粉（FBP-Y）、乳酸菌发酵油菜蜂花粉（FBP-L）、酵母菌和乳酸菌混合发酵油菜蜂花粉（FBP-M）中油质蛋白（Oleosin B2）和谷氧还蛋白（Glutaredoxin）的相对含量。
图6为未发酵油菜蜂花粉（BP）、酵母菌发酵油菜蜂花粉（FBP-Y）、乳酸菌发酵油菜蜂花粉（FBP-L）、酵母菌和乳酸菌混合发酵油菜蜂花粉（FBP-M）中寡肽含量差异。
图7为未发酵油菜蜂花粉（BP）、酵母菌发酵油菜蜂花粉（FBP-Y）、乳酸菌发酵油菜蜂花粉（FBP-L）、酵母菌和乳酸菌混合发酵油菜蜂花粉（FBP-M）中氨基酸含量差异。
图8为未发酵油菜蜂花粉（BP）、酵母菌发酵油菜蜂花粉（FBP-Y）、乳酸菌发酵油菜蜂花粉（FBP-L）、酵母菌和乳酸菌混合发酵油菜蜂花粉（FBP-M）中蛋白提取物与免疫球蛋白E（IgE）的特异性结合水平。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中涉及的试剂耗材均可通过市售购买得到。
蜂花粉致敏原的鉴定方法
本发明提供了蜂花粉致敏原的鉴定方法，通过该方法鉴定出蜂花粉中含有致敏蛋白：油质蛋白（Oleosin B2）和谷氧还蛋白（Glutaredoxin）。
具体鉴定步骤如下：
1）样品预处理，得到蜂花粉冻干粉：
准确称取5.0g研磨好的油菜蜂花粉粉末（100-300目）；
利用真空冷冻干燥机对蜂花粉粉末进行真空冷冻干燥，所需干燥时长约为48h，获得蜂花粉冻干粉。
利用GB5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》测定该冻干粉的含水量，在7%以下达标。
2）蛋白抽提，得到沉淀蛋白：
准确称取100.0mg油菜蜂花粉冻干粉，加入1mL蛋白抽提剂；
超声破碎，条件为超声3s，间隔3s，重复30次，超声结束后继续室温振荡30-60min；
然后于4℃，13000g条件下离心15min，吸取400μL上清液，并向其中加入2mL丙酮冰上放置60min以沉淀蛋白，去上清，得到沉淀蛋白；
其中，蛋白抽提剂由pH7.4的25mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、150mmol/L氯化钠、1mmol/L乙二胺四乙酸、1%乙基苯基聚乙二醇和5%甘油组成。
3）蛋白酶切，得到肽段：
3.1）沉淀蛋白的复溶，得到复溶蛋白溶液：
沉淀蛋白用100μL 5mol/L尿素溶液复溶，得到复溶蛋白溶液；
然后利用Brandford法测定复溶蛋白溶液的蛋白浓度；再根据蛋白浓度计算蛋白质量；
3.2）乙酰化反应：
向复溶蛋白溶液中加入400μL 40mmol/L碳酸氢铵溶液，然后加入50μL 100mmol/L二硫苏糖醇溶液，室温反应1h，再加入250μL 100mmol/L碘乙酰胺溶液，室温避光1h，进行乙酰化反应。
3.3）酶解，孵育：
向乙酰化后的蛋白溶液中加入蛋白质量的1/50的质谱级胰酶（Trypsin），37℃下孵育12h，加入1µL甲酸终止反应。
4）肽段除盐：
肽段除盐采用的是Millipore公司的除盐洗脱柱Ziptips，操作如下：
首先用Ziptip活化液和平衡液分别冲洗ZiptipC18柱10次，然后用Ziptip反复抽吸孵育后的蛋白溶液10次，使其肽段充分结合在Ziptip柱上，再利用Ziptip洗脱液冲洗柱上吸附的肽段，重复10次。
将带有肽段的洗脱液进行真空干燥，然后用0.1%甲酸溶液溶解，于4℃，13000g条件下离心10min取上清。
用Nanodrop2000测定肽段浓度；根据肽段浓度，确定质谱上样体积。
5）质谱检测鉴定：
利用EASY-nLC1000纳升级液相色谱仪串联LTQ-OrbitrapElite组合型质谱仪（ThermoFisherScientific，USA）；其中：
富集柱（100μm×2cm，5μm）和分析柱（75μm×15cm，3μm，100Å）均为ThermoFisherScientific公司生产的反相C18柱。
色谱条件设置如下：
流动相流速为350nL/min，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液。
流动相洗脱梯度设置见表1。
表1 流动相洗脱梯度
Figure 147011DEST_PATH_IMAGE003
质谱条件设置如下：
一级全扫描：离子源为电喷雾离子源（ESI），喷雾电压为2.3kV，离子传输管温度为275℃，S-Lens射频为55%，分辨率为60000，扫描范围为300-8000m/z。
二级扫描是在一级扫描基础上进行的，选取前20个离子信号强度最强的母离子。二级扫描参数：分辨率为15000，隔离窗口为2m/z，碎裂模式为高能碰撞离子解离（HCD），能量为30%。
定性分析：采集的原始数据导入PeaksDB7.5分析软件进行定性分析。
定性分析的参数设置：
从Uniprot下载芸苔属植物（Brassica）蛋白质数据库进行质谱数据检索。设置母离子质量误差为15ppm，子离子质量误差为0.05Da，Trypsin酶切最大漏切位点数为2，可变修饰为oxidation（M,+15.99），固定修饰为carbamidomethyl（C,+57.02）。所有检索结果采用正反库融合的算法控制蛋白和肽段的假阳性率（FDR）小于1%。
经Uniprot蛋白质数据库检索获得的蛋白质氨基酸序列，采用AllergenOnline致敏蛋白数据库进行蛋白质序列同源性比对，确定潜在致敏蛋白种类；然后对确定的潜在致敏蛋白进一步通过DNAStar软件进行结构分析确定其抗原表位属性。
基于上述方法从油菜蜂花粉中鉴定出5种潜在致敏蛋白，其中包括油质蛋白（Oleosin B2）和谷氧还蛋白（Glutaredoxin），其代表性特征质谱图与抗原表位属性见图1~4。
试验样品的制备
本发明所述评价方法所适用的样品为未经处理的天然蜂花粉冻干粉或经发酵处理的蜂花粉冻干粉，该样品可通过市售购买得到，或自制。
本发明所述样品可通过下述方法制得。
样品1：酵母菌制备的发酵蜂花粉冻干粉；
其制备方法，具体步骤如下：
1）准确称取5.0g研磨好的油菜蜂花粉粉末（100-300目），并加入10mL蒸馏水，涡旋混匀后密封包装于食品级自封袋内，然后进行巴氏杀菌，条件为63℃，30 min，获得蜂花粉溶液。
注：该油菜蜂花粉为市售购买得到的未经处理的常规油菜蜂花粉。
2）杀菌完成后在无菌超净工作台内转移蜂花粉溶液至无菌离心管中，然后加入150 mg干酵母粉，充分混合后于无菌恒温培养箱内37℃下孵育48 h，获得发酵蜂花粉溶液。
3）利用真空冷冻干燥机对发酵蜂花粉溶液进行真空冷冻干燥，所需干燥时长约为48 h，获得酵母菌制备的发酵蜂花粉冻干粉。
利用GB 5009.3-2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》测定该冻干粉的含水量，在7%以下达标。
样品2：乳酸菌制备的发酵蜂花粉冻干粉；
其制备方法与实施例1的制备工艺的区别在于：将干酵母粉替换为干乳酸菌粉。
样品3：由酵母菌和乳酸菌混合组成的混合菌制备的发酵蜂花粉冻干粉；
其制备方法与实施例1的制备工艺的区别在于：将干酵母粉替换为由干酵母粉和干乳酸菌粉按质量比1:1混合的混合菌粉，混合菌粉的总质量是300mg。
样品4：市售购买得到的未经处理的常规油菜蜂花粉冻干粉。
实施例1
本实施例提供一种油菜蜂花粉冻干粉致敏性的评价方法，包括如下步骤：
1、蛋白提取及酶切
1.1、蛋白提取
利用蛋白提取试剂盒对样品1-4所得的蜂花粉冻干粉进行蛋白提取；
1.2、酶切
选用质谱级胰蛋白酶，按蛋白质量：胰蛋白酶质量=30：1，在37℃下孵育12 h进行酶切处理，得到蛋白提取物。
2、蛋白组学技术检测
蛋白提取物进行蛋白组学检测条件为：
利用EASY-nLC 1000纳升级液相色谱仪串联LTQ-Orbitrap Elite组合型质谱仪（Thermo Fisher Scientific，USA）。
富集柱（100 μm × 2 cm，5 μm）和分析柱（75 μm × 15 cm，3 μm，100 Å）均为Thermo Fisher Scientific公司生产的反相 C18柱。
色谱条件设置如下：流动相流速为350 nL/min，流动相A为 0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液。
流动相洗脱梯度设置见表2。
表2 流动相洗脱梯度
Figure 714390DEST_PATH_IMAGE003
质谱条件设置如下：
一级全扫描：离子源为电喷雾离子源（ESI），喷雾电压为2.3 kV，离子传输管温度为275℃，S-Lens射频为55%，分辨率为60000，扫描范围为 300-8000 m/z。
二级扫描是在一级扫描基础上进行的，选取前20个离子信号强度最强的母离子。二级扫描参数：分辨率为15000，隔离窗口为2 m/z，碎裂模式为高能碰撞离子解离（HCD），能量为30 %。
3、检测数据分析
经蛋白质组学检测获得的质谱数据，需经Uniprot蛋白质数据库检索，获得蛋白质氨基酸序列；
然后，利用AllergenOnline致敏蛋白数据库对所获得的蛋白质氨基酸序列进行蛋白质序列同源性比对，获得油质蛋白（Oleosin B2）和谷氧还蛋白（Glutaredoxin）的特征肽段，由此验证了油菜蜂花粉中含有油质蛋白和谷氧还蛋白这两种蛋白。
进一步地，通过DNAStar软件，根据油质蛋白和谷氧还蛋白的一级序列进行抗原表位分析。检测结果显示：经抗原表位分析为阳性，验证了油质蛋白和谷氧还蛋白潜在的致敏能力（见图1~4）。
进一步地，经相对定量分析发现，相比较样品4未发酵的油菜蜂花粉，样品1-3发酵油菜蜂花粉组中油质蛋白和谷氧还蛋白的含量显著下降（见图5），说明了样品1-3的发酵油菜蜂花粉冻干粉的致敏性低，安全性相对较高，不会引起临床过敏症状。
实施例2
为了提高致敏性评价的准确性，本发明对样品1-4所述蜂花粉冻干粉中寡肽和氨基酸水平作进一步检测。
具体检测步骤如下：
1、预处理
分别准确称取等质量的未发酵蜂花粉冻干粉、酵母菌发酵蜂花粉冻干粉、乳酸菌发酵蜂花粉冻干粉和混合菌发酵蜂花粉冻干粉各300mg，加入1.5mL甲醇，涡旋混匀，冰水浴超声5min，13000g离心15min后取等量上清液，利用0.22μm尼龙滤膜过滤后待测；
2、质谱检测
利用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）进行检测，参数设置如下：
超高效液相色谱系统为安捷伦1290 Infinity II UPLC系列；使用ORBAXEclipase Plus C18 Rapid Resolution HD色谱柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm，AgilentTechnologies，CA，USA）。
分别在正、负离子模式下采集。
流动相A和B分别为水（含0.1%甲酸）和乙腈（含0.1%甲酸）。
流速设置为0.3 mL/min，进样量为2 μL。
流动相梯度设置见表3。
表3 流动相洗脱梯度
Figure 609925DEST_PATH_IMAGE004
质谱系统为安捷伦6545 ESI-Q-TOF高分辨高精度系列，选用正、负离子两种采集模式。
质谱参数设置如下：正离子模式下毛细管电压，3.5 kV；负离子模式下毛细管电压，3.0 kV；碎裂电压，135 V；干燥气温度，325℃；干燥气流速，10 L/min；喷雾电压，35psi；鞘气温度，370℃；鞘气流速，12 L/min；碰撞能，20 eV；质谱范围，100-1700 m/z。
氮气用于干燥、 雾化和碰撞。
参比离子用于质量精度的校准，正离子模式下参比离子为121.050873和922.009798；负离子模式下参比离子为112.985587和1033.988109。安捷伦Mass Hunter工作站软件用于化合物的分析。
3、检测结果：
如图6所示，经过发酵后的蜂花粉中5种寡肽含量与未发酵蜂花粉相比均显著上升；
如图7所示，经过发酵后的蜂花粉中4种氨基酸含量与未发酵蜂花粉相比显著上升。
已知5种寡肽和4种氨基酸均为致敏蛋白油质蛋白（Oleosin B2）和谷氧还蛋白（Glutaredoxin）的组成成分，因此上述检测结果反映出样品1-3所述发酵蜂花粉冻干粉中两种致敏蛋白发生降解，致敏性得到显著改善。
通过实施例1的蛋白检测及实施例2的寡肽、氨基酸的检测，结合两种检测结果能够更准确的评价蜂花粉的致敏性。
评价方法准确性的验证
为了进一步验证本发明所述的评价方法的准确性，本发明提供现有食品致敏性的评价方法对样品1-4蜂花粉冻干粉的致敏性进行评价。
具体检测步骤如下：
1、试验分组：
对照组（BP），即样品4，3个；
酵母菌发酵蜂花粉（FBP-Y）组，即样品1，3个；
乳酸菌发酵蜂花粉（FBP-L）组，即样品2，3个；
混合菌发酵蜂花粉（FBP-M）组，即样品3，3个；
2、试验步骤：
2.1、蛋白提取
利用植物蛋白提取试剂盒按照操作说明对同质量的未发酵蜂花粉冻干粉、酵母菌发酵蜂花粉冻干粉、乳酸菌发酵蜂花粉冻干粉和混合菌发酵蜂花粉冻干粉进行蛋白提取；
然后利用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒按照操作说明测定各组样品蛋白提取液的蛋白浓度；
2.2、准备一张5 cm×5 cm的硝化纤维膜，将4组样品点在膜上，保证蛋白量相同，然后将膜晾干；
2.3、将膜放入含有5% BSA的10cm培养皿中浸泡，室温孵育1 h，然后将膜取出放入含有人血清IgE抗体的BSA溶液中室温孵育1 h；
2.4、将膜取出后用TBS-T溶液清洗3次，每次5 min，然后将膜放入含有HRP标记抗人IgE小鼠单克隆抗体的BSA溶液中室温孵育1 h；
2.5、将膜取出后用TBS-T溶液清洗3次，每次5 min，然后利用DAB显色试剂盒按照操作说明进行膜显色反应，直至膜上有棕色点显现后终止反应，并将膜晾干后扫描留存。
3、试验结果：
斑点免疫印迹检测结果显示：
未发酵油菜蜂花粉中蛋白提取物与免疫球蛋白E（IgE）的特异性结合水平最高，3个发酵油菜蜂花粉组则显著下降（如图8所示），反映出样品1-3发酵蜂花粉冻干粉的致敏性更低，结果与实施例1一致。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.油质蛋白和谷氧还蛋白在蜂花粉致敏性评价中作为评价指标的应用，其特征在于，所述蜂花粉为天然蜂花粉或发酵蜂花粉；
所述油质蛋白的氨基酸序列为QASIFSRFFRMFSFIFPFVNVIKLIIASVTSLVCLAFSCVALGGSAVALIVSTPLFIMFSPILVPATIATTLLASGLMAGTTLGLTGIGLIMGLVRTAGGVSLLQSPLRKIIVNRIKARLGGGGGGSRLARLKKILGLLNKLRGMGAGGAAAPAAEPAPAAEAAPAAEAAPAAAPAAAPAAAP；
代表性肽段为TAGGVSLLQSPLR；
所述谷氧还蛋白的氨基酸序列为MAMQKAKEIVSGNAVVVFSKSFCPYCVRVKELLQQLGAKFIAVELDKESDGSQVQSALAEWTGQRTVPNVFIGEKHIGGCDSVTNLHRDGKLVPMLTEAGAIAATAGTTSA；
代表性肽段为AKEIVSGNAVVVFSK。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蜂花粉为天然油菜蜂花粉或发酵油菜蜂花粉。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发酵油菜蜂花粉是指经酵母菌和/或乳酸菌发酵制得的油菜蜂花粉。
4.一种蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，以权利要求1所述的油质蛋白和谷氧还蛋白作为评价指标；所述蜂花粉为天然蜂花粉或发酵蜂花粉。
5.根据权利要求4所述的蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，利用蛋白组学技术检测样品蜂花粉的蛋白提取物中油质蛋白和谷氧还蛋白的特征肽段，根据质谱检测及分析结果评价样品的致敏性。
6.根据权利要求5所述的蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，在所述蛋白组学技术检测实施前，对蜂花粉蛋白提取物进行酶切处理；
所述酶切处理使用的酶为质谱级胰蛋白酶；所述蛋白提取物中蛋白质量与胰蛋白酶的质量比为（30-100）：1。
7.根据权利要求6所述的蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，所述蛋白组学检测条件为：
所述检测采用纳升级液相色谱仪串联组合型质谱仪进行；
富集柱和分析柱均为反相C18柱；
色谱条件设置如下：
流动相流速为350 nL/min，流动相A为 0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液；
流动相洗脱梯度设置如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
质谱条件设置如下：
一级全扫描：
离子源为电喷雾离子源ESI，喷雾电压为2.3 kV，离子传输管温度为275℃，S-Lens射频为55%，分辨率为60000，扫描范围为 300-8000 m/z；
二级扫描是在一级扫描基础上进行的，选取前20个离子信号强度最强的母离子；
二级扫描参数：分辨率为15000，隔离窗口为2 m/z，碎裂模式为高能碰撞离子解离HCD，能量为30 %。
8.根据权利要求7所述的蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，所述质谱检测及分析还包括：
根据蛋白质组学检测获得的质谱数据，利用Uniprot蛋白质数据库检索获得蛋白质氨基酸序列；
根据蛋白质氨基酸序列，利用AllergenOnline致敏蛋白数据库进行蛋白质序列同源性比对，获得油质蛋白和谷氧还蛋白的特征肽段；
通过DNAStar软件根据油质蛋白和谷氧还蛋白的一级序列进行抗原表位分析。
9.根据权利要求8所述的蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，所述评价方法还包括：利用代谢组学技术检测蜂花粉甲醇提取物中的寡肽和氨基酸，并根据检测结果进一步评价蜂花粉的致敏性。
10.根据权利要求9所述的蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，所述代谢组学检测条件为：
流动相A：含质量分数0.1%甲酸的水溶液；
流动性B：含质量分数0.1%甲酸的乙腈；
流速：0.3 mL/min；
流动相梯度设置如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
质谱参数设置如下：
正离子模式下毛细管电压，3.5 kV；
负离子模式下毛细管电压，3.0 kV；
碎裂电压，135 V；
干燥气温度，325℃；
干燥气流速，10 L/min；
喷雾电压，35 psi；
鞘气温度，370℃；
鞘气流速，12 L/min；
碰撞能，20 eV；
质谱范围，100-1700 m/z；
氮气用于干燥、雾化和碰撞。
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