CN114113381A - 一种舒氏海龙特征多肽及其应用和鉴别舒适海龙的方法 - Google Patents
一种舒氏海龙特征多肽及其应用和鉴别舒适海龙的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114113381A CN114113381A CN202111341671.0A CN202111341671A CN114113381A CN 114113381 A CN114113381 A CN 114113381A CN 202111341671 A CN202111341671 A CN 202111341671A CN 114113381 A CN114113381 A CN 114113381A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- syngnathus
- mass
- pretreated
- ammonium bicarbonate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 31
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 31
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 241001478428 Syngnathus Species 0.000 claims description 55
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 45
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 41
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 24
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 23
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 22
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 22
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 20
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 17
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 17
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 claims description 17
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 17
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 claims description 16
- 241001540526 Leptonotus elevatus Species 0.000 claims description 15
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 14
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000005173 quadrupole mass spectroscopy Methods 0.000 claims description 14
- KKTCWAXMXADOBB-UHFFFAOYSA-N azanium;hydrogen carbonate;hydrate Chemical compound [NH4+].O.OC([O-])=O KKTCWAXMXADOBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 8
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 7
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 7
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 5
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- XBJFCYDKBDVADW-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;formic acid Chemical compound CC#N.OC=O XBJFCYDKBDVADW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 claims description 3
- 241000282470 Canis latrans Species 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 241000894007 species Species 0.000 description 12
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 11
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 6
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 4
- 241001530108 Schlegelia Species 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000337587 Syngnathus acus Species 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- 241001113926 Gelsemium Species 0.000 description 2
- 241001478511 Syngnathus schlegeli Species 0.000 description 2
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- PUUYVMYCMIWHFE-BQBZGAKWSA-N Gly-Ala-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PUUYVMYCMIWHFE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- JRDYDYXZKFNNRQ-XPUUQOCRSA-N Gly-Ala-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN JRDYDYXZKFNNRQ-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- GLACUWHUYFBSPJ-FJXKBIBVSA-N Gly-Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN GLACUWHUYFBSPJ-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 238000013051 Liquid chromatography–high-resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 235000010575 Pueraria lobata Nutrition 0.000 description 1
- 244000046146 Pueraria lobata Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005485 electric heating Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010027668 glycyl-alanyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000037427 ion transport Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明涉及一种舒氏海龙特征多肽及其应用和鉴别舒适海龙的方法,属于生物技术检测技术领域。本发明提供了一种舒氏海龙特征多肽,所述特征多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的特征多肽针对舒氏海龙具有优异的专属性和稳定性,特异性强,可用于舒氏海龙的鉴别,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术检测技术领域,具体涉及一种舒氏海龙特征多肽及其应用和鉴别舒适海龙的方法。
背景技术
海龙是我国重要的动物药材,具有温肾壮阳、散结消肿的功效,用药历史悠久,基原众多。中国药典中规定海龙药用基源为海龙科动物刁海龙Solenognathus hardwickii(Gray)、拟海龙Syngnathoides biaculeatus(Bloch)或尖海龙Syngnathusa cusLinnaeus的干燥体。
目前市场上以尖海龙售卖的药材按照生物学分类鉴定实际为舒氏海龙Syngnathus schlegeli。尖海龙分布于挪威、英国、爱尔兰等西欧地区,往非洲大陆直到好望角,在我国海域鲜有分布。舒氏海龙模式产地为中国烟台,在中国有广泛的采集记录。舒氏海龙是市场上价格低廉,供应量大的主流海龙品种。中医临床用药实际给付的均为舒氏海龙,二者具有实质等同性。
目前海龙的种类鉴别和质量控制方法主要有性状鉴定法、HPLC指纹图谱法和分子生物学法。性状鉴定法一般要求海龙个体完整,且需要鉴定者具有丰富的经验,该方法存在一定的主观性;HPLC指纹图谱法专属性较低;分子生物学法具有高专属性,但受限于样品中遗传物质保存的完好程度,对于海龙炮制品、提取物、虫蛀霉变以及多个个体混杂的样品,因提取DNA困难而无法顺利实验。近年来,越来越多的方法和标准中使用特征肽段对天然药物进行鉴别或定量研究。各物种中所含的蛋白质存在个别位点氨基酸的差别,可用适当的蛋白酶将差异位点截取出来,作为具有标识意义的多肽段,即特征肽段。特征肽段的检测一般使用质谱手段,无需考虑蛋白质活性,制备方法简单且肽段性质较为稳定。现有的海龙鉴定的方法限制因素较多,无法在海龙粉末、炮制品、提取物等衍生制品中进行应用,海龙蛋白中的特征肽段,有潜力作为海龙物种鉴定的指标成分。目前,各数据库中均未收载舒适海龙相关蛋白序列信息,无法通过蛋白序列比对获得差异肽段,因此尚未有舒氏海龙特征多肽的相关记载。
发明内容
本发明的目的在于提供一种舒氏海龙特征多肽及其应用和鉴别舒适海龙的方法。本发明提供的特征多肽针对舒氏海龙具有优异的专属性和稳定性,特异性强,可用于海龙药材种属鉴别,具体为舒氏海龙的鉴别,具有良好的应用前景。
本发明提供了一种舒氏海龙特征多肽,所述特征多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明还提供了上述技术方案所述特征多肽在鉴别舒适海龙中的应用。
优选的是,所述鉴别使用质谱法进行,检测离子对包括:质荷比为m/z513.7→558.3的定量离子,质荷比为m/z513.7→657.4的定性离子。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述的特征多肽鉴别舒适海龙的方法,包括以下步骤:
(1)将预处理的海龙提取液或预处理的海龙粉滤液分别与胰蛋白酶混合,得到混合液,将所述混合液与碳酸氢铵水溶液混合,酶解后过滤,取滤液,得到供试品溶液;
(2)以上述技术方案所述舒适海龙特征肽为对照品,加水溶解,加碳酸氢铵水溶液稀释成不同的浓度,得到对照品溶液;
(3)利用三重四极杆质谱法进行检测分析;
所述步骤(1)或(2)之间没有时间先后顺序的限定。
优选的是,步骤(1)中,所述预处理的海龙提取液的制备方法包括以下步骤:将海龙粉碎,与水混合后煎煮三次,煎煮时间分别为4h、3h和2h,合并煎煮液,使用碳酸氢铵水溶液进行稀释,得到预处理的海龙提取液;
所述预处理的海龙粉滤液的制备过程包括以下步骤:将海龙粉与水混合,煎煮1h,过滤,取滤液,得到预处理的海龙粉滤液。
优选的是,所述胰蛋白酶以胰蛋白酶水溶液的形式进行添加,所述胰蛋白酶在所述胰蛋白酶水溶液中的质量浓度为1mg/ml。
优选的是,所述碳酸氢铵水溶液中碳酸氢铵的质量百分含量为1%。
优选的是,所述酶解的条件为37℃酶解2h。
优选的是,所述三重四极杆质谱法以0.1%甲酸乙腈为流动相A,以0.1%甲酸溶液为流动相B,进行梯度洗脱:0~3min,5%A→8%A;流速为每分钟0.5ml。
优选的是,所述三重四极杆质谱法采用质谱检测器,电喷雾正离子模式,进行多反应监测,选择质荷比m/z 513.7→558.3的定量离子,m/z 513.7→657.4的定性离子作为检测离子对。
本发明提供了一种舒氏海龙特征多肽。本发明提供的特征多肽作为舒氏海龙鉴别的指标成分,可与其他物种的海龙进行区分,为开发舒氏海龙及相关产品的鉴别方法奠定基础。具体的,本发明所述特征多肽具有以下有益效果:
(1)本发明通过将蛋白序列中的差异性多肽段截取出来,采用质谱进行检测,操作简单快捷,测定结果稳定,不受海龙样品的形态和加工过程的干扰,填补了舒氏海龙物种鉴别以及海龙制品中舒适海龙检测方法的空白;
(2)本发明提供的特征多肽及检测方法,为数据库缺乏的近缘物种中特征肽段的寻找提供了参考;
(3)本发明提供的特征多肽针对舒氏海龙具有优异的专属性和稳定性,特异性强,可用于舒适海龙药材的鉴别,具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明提供的海龙供试品溶液主成分分析结果图;
图2为本发明提供的对照品溶液测定后的标准曲线图;
图3为本发明提供的稳定性考察图。
具体实施方式
本发明提供了一种舒氏海龙特征多肽,所述特征多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示:GA-(Hyp)-GAVGPTGAR。本发明所述Hyp为4Hyp,即4-羟基脯氨酸。本发明提供了舒氏海龙具有特征性识别意义的肽段。本发明将舒氏海龙、刁海龙、拟海龙、多棘刁海龙等不同种海龙的水提取物经过胰蛋白酶酶解后,使用纳升液相色谱-高分辨质谱联用仪分析,获得海龙蛋白质全肽段质谱图;将质谱数据进行化学计量学分析,再使用三重四极杆质谱对实验结果进行专属性验证;最终提供了1个特征离子对,对应1条特征肽段,专属性验证结果良好。
本发明还提供了上述技术方案所述特征多肽在鉴别舒适海龙中的应用。
在本发明中,所述鉴别使用质谱法进行,检测离子对包括:质荷比为m/z 513.7(双电荷)→558.3的定量离子,质荷比为m/z 513.7(双电荷)→657.4的定性离子。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述的特征多肽鉴别舒适海龙的方法,包括以下步骤:
(1)将预处理的海龙提取液或预处理的海龙粉滤液分别与胰蛋白酶混合,得到混合液,将所述混合液与碳酸氢铵水溶液混合,酶解后过滤,取滤液,得到供试品溶液;
(2)以上述技术方案所述舒适海龙特征肽为对照品,加水溶解,加碳酸氢铵水溶液稀释成不同的浓度,得到对照品溶液;
(3)利用三重四极杆质谱法进行检测分析;
所述步骤(1)或(2)之间没有时间先后顺序的限定。
本发明所述方法通过将蛋白序列中的差异性多肽段截取出来,采用质谱进行检测,操作简单快捷,测定结果稳定,不受海龙样品的形态和加工过程的干扰,填补了舒氏海龙物种鉴别以及海龙制品中舒适海龙检测方法的空白,为数据库缺乏的近缘物种中特征肽段的寻找提供了参考。
本发明将预处理的海龙提取液或预处理的海龙粉滤液分别与胰蛋白酶混合,得到混合液,将所述混合液与碳酸氢铵水溶液混合,酶解后过滤,取滤液,得到供试品溶液。在本发明中,所述预处理的海龙提取液的制备方法优选包括以下步骤:将海龙粉碎,与水混合后煎煮三次,煎煮时间分别为4h、3h和2h,合并煎煮液,使用碳酸氢铵水溶液进行稀释,得到预处理的海龙提取液。本发明优选取100g粉碎的海龙,煎煮液优选共计500mL。在本发明中,所述稀释优选为稀释10倍。具体的,本发明优选取煎煮液5mL,置于50mL两瓶中,使用碳酸氢铵水溶液稀释至刻度,摇匀,得到预处理的海龙提取液。在本发明中,所述预处理的海龙粉滤液的制备过程优选包括以下步骤:将海龙粉与水混合,煎煮1h,过滤,取滤液,得到预处理的海龙粉滤液。得到预处理的海龙提取液和预处理的海龙粉滤液后,本发明优选量取1~5mL海龙提取液或海龙粉滤液,优选加入胰蛋白酶溶液100μL,摇匀后,加碳酸氢铵水溶液至50mL,摇匀,密塞后进行酶解。在本发明中,所述酶解的条件优选为37℃酶解2h。酶解后,本发明优选放冷,更优选放冷至常温,本发明所述常温的温度范围优选为10~30℃。放冷后,本发明进行过滤,去滤液,作为供试品溶液。
在本发明中,所述胰蛋白酶以胰蛋白酶水溶液的形式进行添加,所述胰蛋白酶在所述胰蛋白酶水溶液中的质量浓度为1mg/ml。在本发明中,所述碳酸氢铵水溶液中碳酸氢铵的质量百分含量为1%。
本发明以上述技术方案所述舒适海龙特征肽为对照品,加水溶解,加碳酸氢铵水溶液稀释成不同的浓度,得到对照品溶液。在本发明中,所述碳酸氢铵水溶液中碳酸氢铵的质量百分含量为1%。本发明对所述舒适海龙特征肽的来源没有特殊限定,采用人工合成方法即可,如本发明舒氏海龙特征肽是委托强耀生物科技有限公司按照指定的氨基酸序列合成所获得。在本发明中,对照品溶液的制备方法更优选为:称取舒适海龙特征肽10mg,置50ml量瓶中,加水溶解并定容,精密量取上述溶液5ml,置200ml量瓶中,加1%碳酸氢铵水溶液稀释至刻度,摇匀,作为对照品贮备液;分别精密吸取上述贮备液1ml、2ml、5ml、10ml、20ml、25ml置50ml量瓶中,加1%碳酸氢铵水溶液稀释至刻度,摇匀,制成系列浓度对照品溶液。
本发明利用三重四极杆质谱法进行检测分析。在本发明中,所述三重四极杆质谱法优选以0.1%甲酸乙腈为流动相A,以0.1%甲酸溶液为流动相B,进行梯度洗脱:0~3min,5%A→8%A;流速为每分钟0.5ml。在本发明中,所述三重四极杆质谱法优选采用质谱检测器,电喷雾正离子模式,进行多反应监测,选择质荷比m/z 513.7(双电荷)→558.3的定量离子,m/z 513.7(双电荷)→657.4的定性离子作为检测离子对。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种舒氏海龙特征多肽及其应用和鉴别舒适海龙的方法做进一步详细的介绍,本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
(一)仪器和材料
Thermo EASY-nLC 1000纳升液相,Thermo Scientific Orbitrap-Fusion高分辨质谱,AB Triple Quad 6500+高效液相色谱质谱联用仪,赛多利斯XSE205电子天平,胰蛋白酶(Sigma公司生产)、碳酸氢铵、乙酸均为分析纯。甲酸、乙腈均为色谱纯。
用于进行实验的海龙样品为市场收集,经山东省农业科学院PCR实验鉴定基源。
(二)测定条件
1、Orbitrap-Fusion高分辨质谱测定条件
色谱条件:以Thermo Acclaim PepMap C18柱(100μm×3.5cm,5μm)脱盐富集,Thermo Acclaim PepMap C18柱(75μm×15cm,3μm)分离,流速300nL/min,流动相A为2%乙腈的0.1%甲酸水溶液,流动相B为含98%乙腈的0.1%甲酸水溶液,进行梯度洗脱(0~1min,1%B→6%B;1~96min,6%B→22%B;96~113min,22%B→30%B;113~117min,30%B→95%B;117~120min,95%B)。
质谱条件:离子源为Nanospray Flex纳喷源。以正离子模式进行分析,喷雾电压为1800V,离子传输毛细管温度为275℃,S-Lens传输效率设置为60%。一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器,分辨率为60000,采集范围为350~1550(m/z);二级质谱采用Orbitrap作为质量分析器,采用Rapid Scan模式进行扫描,利用Top20数据依赖模式进行母离子选择,采用HCD模式进行碎裂,碎裂能量NCE设置为30%。
2、三重四极杆质谱测定条件
以0.1%甲酸乙腈为流动相A,以0.1%甲酸溶液为流动相B,进行梯度洗脱(0~3min,5%A→8%A);流速为每分钟0.5ml。采用质谱检测器,电喷雾正离子模式(ESI+),进行多反应监测(MRM),选择质荷比m/z 513.7(双电荷)→558.3(定量离子),m/z 513.7(双电荷)→657.4(定性离子)作为检测离子对。
实施例1
舒适海龙特征肽段寻找
(1)供试品溶液的制备
海龙水提液:取供试品海龙100g粉碎,置三角瓶中,加水煎煮三次,分别4h,3h,2h,合并煎煮液,共500mL,微沸浓缩至液体粘稠,转移至硅胶碗中,于60℃电热恒温鼓风干燥箱中干燥至固体,得海龙水提物;
供试品溶液:称取海龙水提物样品0.1g,加1%碳酸氢铵水溶液50ml,超声处理30min使溶解,用微孔滤膜过滤,取续滤液100μL,加1mg/ml的胰蛋白酶水溶液10μL,37℃酶解2h,取出放冷至室温,即得。
(2)特征离子的选择及序列推测
供试品溶液通过纳升液相色谱-高分辨质谱分析后,将质谱数据导入科迈恩数据分析软件,进行样品一级和二级质谱离子信息的化学计量学分析,通过PCA主成分分析结果可以看到舒氏海龙与其它物种的海龙分别落在不同区域(图1),说明舒适海龙中存在特征成分。进一步分析得到代表舒适海龙差异性的质谱离子对信息m/z 513.7(双电荷)→558.3、657.4。通过进一步解析,推测该离子对应的舒适海龙特征肽段序列为GA-(Hyp)-GAVGPTGAR。
按照推测的氨基酸序列委托合成舒适海龙特征肽对照品,将对照品与舒适海龙供试品溶液同时检测,两者保留时间与二级质谱信息均一致,从而确认该序列正确性。
效果验证
1、舒适海龙特征肽专属性研究
采用三重四极杆质谱测定条件对所有物种海龙的水提物进行检测,结果显示三批舒氏海龙种均出现舒适海龙特征肽色谱峰,而其它刁海龙、拟海龙、多棘刁海龙、宝珈枪吻海龙、长粗吻海龙、葛氏海龙中均未出现相应的色谱峰。表明该特征肽为舒适海龙中特有,可以作为指标成分对舒适海龙进行鉴别。
2、舒适海龙特征肽在海龙粉和海龙提取物中的应用
(1)样品制备
海龙提取液供试品溶液制备:取供试品海龙100g粉碎,置三角瓶中,加水煎煮三次,分别4h,3h,2h,合并煎煮液,共500mL;取海龙提取液5ml,置50ml量瓶中,加1%碳酸氢铵水溶液稀释至刻度,摇匀,量取1ml至5ml量瓶中,加1mg/ml胰蛋白酶水溶液100μl,摇匀,再加1%碳酸氢铵水溶液定容至刻度,摇匀,密塞,37℃恒温酶解2h,放冷,滤过,取续滤液,作为供试品溶液。
海龙粉供试品溶液制备:取海龙粉1g,加水50ml煎煮1h,滤过,取滤液1ml至5ml量瓶中,自“加1mg/ml胰蛋白酶水溶液100μl”起,照上文方法制备。
系列浓度对照品溶液:称取舒适海龙特征肽对照品10mg,置50ml量瓶中,加水溶解并定容,精密量取上述溶液5ml,置200ml量瓶中,加1%碳酸氢铵水溶液稀释至刻度,摇匀,作为对照品贮备液。分别精密吸取上述贮备液1ml、2ml、5ml、10ml、20ml、25ml置50ml量瓶中,加1%碳酸氢铵水溶液稀释至刻度,摇匀,制成系列浓度对照品溶液。
(2)利用三重四极杆质谱测定条件进行测定。
(3)仪器精密度考察
取对照品溶液,连续进样6针,定量离子峰面积RSD分别为0.35%,表明方法精密度良好。
(4)线性关系考察
取系列浓度对照品溶液进样测定,分别以定量离子峰面积值为纵坐标,以对照品浓度为横坐标,绘制标准曲线,得到线性方程y=4961021.6967x-154493.9504,r=0.9999,方法线性关系良好(见图2)。
(5)重复性考察
取海龙提取液样品,平行制备六份供试品溶液,照上述测定方法进行测定。定量离子峰面积测定结果RSD为1.04%。方法重复性良好。
(6)稳定性考察
取上述重复性测定样品,连续进样24h,以进样次序为横坐标,以每次进样测得的峰面积为纵坐标绘图,总进样峰面积RSD为1.31%,可见样品在24h内稳定性良好,具体结果如图3所示。
(7)样品测定
对收集的10批舒氏海龙提取液样品和2批舒氏海龙粉样品进行测定,结果均检出舒适海龙特征肽,表明该特征肽可用于海龙制品中舒氏海龙成分的鉴别。
对比例1
将318个候选离子中筛选出5个具有鉴别潜力的离子信息,经过三重四极杆质谱验证,并不是任意的离子均能够实现舒氏海龙成分的鉴定,部分离子对舒适海龙的专属性不足,仅质核比为513.7的离子专属性良好,具体结果见表1。
表1专属性验证结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 山东省食品药品检验研究院
东阿阿胶股份有限公司
<120> 一种舒氏海龙特征多肽及其应用和鉴别舒适海龙的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> GAMMA-CARBOXY GLUTAMIC ACID HYDROXYLATION
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=4Hyp
<220>
<221> UNSURE
<222> (9)..(9)
<223> The 'Xaa' at location 9 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (3)..(3)
<223> The 'Xaa' at location 3 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 1
Gly Ala Xaa Gly Ala Val Gly Pro Thr Gly Ala Arg
1 5 10
Claims (10)
1.一种舒氏海龙特征多肽,其特征在于,所述特征多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述特征多肽在鉴别舒适海龙中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述鉴别使用质谱法进行,检测离子对包括:质荷比为m/z 513.7→558.3的定量离子,质荷比为m/z513.7→657.4的定性离子。
4.一种基于权利要求1所述的特征多肽鉴别舒适海龙的方法,包括以下步骤:
(1)将预处理的海龙提取液或预处理的海龙粉滤液分别与胰蛋白酶混合,得到混合液,将所述混合液与碳酸氢铵水溶液混合,酶解后过滤,取滤液,得到供试品溶液;
(2)以权利要求1所述舒适海龙特征肽为对照品,加水溶解,加碳酸氢铵水溶液稀释成不同的浓度,得到对照品溶液;
(3)利用三重四极杆质谱法进行检测分析;
所述步骤(1)或(2)之间没有时间先后顺序的限定。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述预处理的海龙提取液的制备方法包括以下步骤:将海龙粉碎,与水混合后煎煮三次,煎煮时间分别为4h、3h和2h,合并煎煮液,使用碳酸氢铵水溶液进行稀释,得到预处理的海龙提取液;
所述预处理的海龙粉滤液的制备过程包括以下步骤:将海龙粉与水混合,煎煮1h,过滤,取滤液,得到预处理的海龙粉滤液。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述胰蛋白酶以胰蛋白酶水溶液的形式进行添加,所述胰蛋白酶在所述胰蛋白酶水溶液中的质量浓度为1mg/ml。
7.根据权利要求4或5所述的方法,其特征在于,所述碳酸氢铵水溶液中碳酸氢铵的质量百分含量为1%。
8.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述酶解的条件为37℃酶解2h。
9.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述三重四极杆质谱法以0.1%甲酸乙腈为流动相A,以0.1%甲酸溶液为流动相B,进行梯度洗脱:0~3min,5%A→8%A;流速为每分钟0.5ml。
10.根据权利要求4或9所述的方法,其特征在于,所述三重四极杆质谱法采用质谱检测器,电喷雾正离子模式,进行多反应监测,选择质荷比m/z 513.7→558.3的定量离子,m/z513.7→657.4的定性离子作为检测离子对。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111341671.0A CN114113381B (zh) | 2021-11-12 | 2021-11-12 | 一种舒氏海龙特征多肽及其应用和鉴别舒适海龙的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111341671.0A CN114113381B (zh) | 2021-11-12 | 2021-11-12 | 一种舒氏海龙特征多肽及其应用和鉴别舒适海龙的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114113381A true CN114113381A (zh) | 2022-03-01 |
CN114113381B CN114113381B (zh) | 2024-01-30 |
Family
ID=80379190
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111341671.0A Active CN114113381B (zh) | 2021-11-12 | 2021-11-12 | 一种舒氏海龙特征多肽及其应用和鉴别舒适海龙的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114113381B (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115248277A (zh) * | 2022-06-27 | 2022-10-28 | 山东省食品药品检验研究院 | 刁海龙特征多肽及其应用和鉴别刁海龙的方法 |
CN116297952A (zh) * | 2023-03-10 | 2023-06-23 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种基于肽组学的用于海马物种鉴别的肽生物标志物及其应用 |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102218122A (zh) * | 2011-04-13 | 2011-10-19 | 济南宏济堂制药有限责任公司 | 一种海龙蛤蚧口服液的质量控制检测方法 |
CN106755310A (zh) * | 2016-11-16 | 2017-05-31 | 中国中医科学院中药研究所 | 鉴定海龙的成套试剂与方法 |
CN107085054A (zh) * | 2017-04-28 | 2017-08-22 | 河南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 肉蛋白多肽标志物用于牛肉的掺伪鉴别方法 |
CN112051124A (zh) * | 2020-10-20 | 2020-12-08 | 东阿阿胶股份有限公司 | 一种海龙胶口服液中海龙和/或甘草的快速薄层鉴别方法 |
AU2020103172A4 (en) * | 2020-09-23 | 2021-01-14 | Shandong Institute For Food And Drug Control | Method to identify donkey derived components in donkey-hide gelatin and the preparations |
AU2021100681A4 (en) * | 2020-07-30 | 2021-04-22 | Shandong Institute For Food And Drug Control | A type of svtle marker peptide of agkistrodon halys and the application |
CN113307846A (zh) * | 2021-06-23 | 2021-08-27 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿茸鹿角的特征多肽及其应用 |
CN113480599A (zh) * | 2021-06-23 | 2021-10-08 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿角胶的特征多肽及其应用 |
-
2021
- 2021-11-12 CN CN202111341671.0A patent/CN114113381B/zh active Active
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102218122A (zh) * | 2011-04-13 | 2011-10-19 | 济南宏济堂制药有限责任公司 | 一种海龙蛤蚧口服液的质量控制检测方法 |
CN106755310A (zh) * | 2016-11-16 | 2017-05-31 | 中国中医科学院中药研究所 | 鉴定海龙的成套试剂与方法 |
CN107085054A (zh) * | 2017-04-28 | 2017-08-22 | 河南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 肉蛋白多肽标志物用于牛肉的掺伪鉴别方法 |
AU2021100681A4 (en) * | 2020-07-30 | 2021-04-22 | Shandong Institute For Food And Drug Control | A type of svtle marker peptide of agkistrodon halys and the application |
AU2020103172A4 (en) * | 2020-09-23 | 2021-01-14 | Shandong Institute For Food And Drug Control | Method to identify donkey derived components in donkey-hide gelatin and the preparations |
CN112051124A (zh) * | 2020-10-20 | 2020-12-08 | 东阿阿胶股份有限公司 | 一种海龙胶口服液中海龙和/或甘草的快速薄层鉴别方法 |
CN113307846A (zh) * | 2021-06-23 | 2021-08-27 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿茸鹿角的特征多肽及其应用 |
CN113480599A (zh) * | 2021-06-23 | 2021-10-08 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿角胶的特征多肽及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
史筱莉;徐永健;牟金婷;司夏丹;: "大海马和刁海龙氨基酸与脂肪酸的组成分析与评价", 中国海洋药物, no. 02 * |
税丕先: "海龙及其混淆品掺假品的鉴别", 中国药业, no. 07 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115248277A (zh) * | 2022-06-27 | 2022-10-28 | 山东省食品药品检验研究院 | 刁海龙特征多肽及其应用和鉴别刁海龙的方法 |
CN115248277B (zh) * | 2022-06-27 | 2024-01-09 | 山东省食品药品检验研究院 | 刁海龙特征多肽及其应用和鉴别刁海龙的方法 |
CN116297952A (zh) * | 2023-03-10 | 2023-06-23 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种基于肽组学的用于海马物种鉴别的肽生物标志物及其应用 |
CN116297952B (zh) * | 2023-03-10 | 2023-10-31 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种基于肽组学的用于海马物种鉴别的肽生物标志物及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114113381B (zh) | 2024-01-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Muccio et al. | Isotope ratio mass spectrometry | |
CN113307846A (zh) | 一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿茸鹿角的特征多肽及其应用 | |
CN113480599A (zh) | 一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿角胶的特征多肽及其应用 | |
CN114113381A (zh) | 一种舒氏海龙特征多肽及其应用和鉴别舒适海龙的方法 | |
CN106932517B (zh) | 一种鉴别枣花蜜与糖浆掺假枣花蜜的分析方法 | |
CN107102077B (zh) | 一种鉴别洋槐蜜与糖浆掺假洋槐蜜的分析方法 | |
CN109212120A (zh) | 一种吴茱萸药材特征图谱的构建方法和吴茱萸药材质量检测方法 | |
CN116008409B (zh) | 一种鹿角胶特征图谱的构建方法及其应用 | |
CN109142598A (zh) | 一组驴源性特征肽和一种鉴定阿胶或阿胶制品的方法 | |
CN115060822B (zh) | 基于中药“印迹模板”成分簇的指纹图谱谱量学分析方法 | |
CN107192770B (zh) | 一种鉴别荆条蜜与糖浆掺假荆条蜜的分析方法 | |
CN109374785B (zh) | 淡竹叶药材uplc特征图谱的构建方法和检测方法 | |
WO2023082512A1 (zh) | 僵蚕特征多肽以及僵蚕、僵蚕水提物制品和其他僵蚕制品的鉴别方法 | |
Shi et al. | Rapid screening of illegally added drugs in functional food using a miniature ion trap mass spectrometer | |
CN109632980B (zh) | 一种同时检测尿苷和麦角甾醇的方法及其用途 | |
CN109632995B (zh) | 一种酸枣仁黄酮类成分uplc指纹图谱的建立方法及应用 | |
CN109900841A (zh) | 一种同时测定血浆中氨基糖苷类抗生素药物浓度的hplc-ms/ms方法 | |
CN106918655A (zh) | 一种远志uplc测定方法 | |
CN110261512B (zh) | 基于代谢组学的维药昆仑雪菊质量评价方法 | |
CN110398545B (zh) | 一种基于代谢组学分析鉴别松花粉原料的方法 | |
CN114354772A (zh) | 用于鳖甲和龟甲检测的特征多肽组合的筛选方法和应用 | |
CN109444287B (zh) | 一种甲胎蛋白的lc-ms/ms定量检测方法 | |
CN108333287B (zh) | 一种羚羊角粉的定量检测方法 | |
CN112345655A (zh) | 一种胡蜂毒液指纹图谱的建立方法、胡蜂毒液指纹图谱及其应用 | |
CN113884597B (zh) | 一种苣荬菜hplc-it-tof/ms指纹图谱的检测方法及其指纹图谱 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |