CN115248277A - 刁海龙特征多肽及其应用和鉴别刁海龙的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种刁海龙特征多肽及其应用和鉴别刁海龙的方法，属于生物技术检测技术领域。本发明提供了两条刁海龙独有的特征多肽，所述特征多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明提供的特征多肽针对刁海龙具有优异的专属性和稳定性，特异性强，可用于刁海龙的鉴别，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术检测技术领域，具体涉及两条刁海龙特征多肽及其应用和鉴别刁海龙的方法。
背景技术
海龙是我国重要的动物药材，具有温肾壮阳、散结消肿的功效，用药历史悠久，基原众多。中国药典中规定海龙药用基源为海龙科动物刁海龙Solenognathus hardwickii(Gray)、拟海龙Syngnathoides biaculeatus(Bloch)或尖海龙Syngnathusa cusLinnaeus的干燥体。
目前市场上海龙品种混乱且价格不等，其中刁海龙价格最高，刁海龙除作为原药材制成中成药外，还多以药酒的形式作为保健品使用。由于目前海龙未能有效的实现人工养殖，海龙野生资源日益减少，市场情况日趋复杂，且因刁海龙价格昂贵，多有以其他品种混淆或以次充好。
目前海龙的种类鉴别和质量控制方法主要有性状鉴定法、HPLC指纹图谱法和分子生物学法。性状鉴定法一般要求海龙个体完整，且需要鉴定者具有丰富的经验，该方法存在一定的主观性；HPLC指纹图谱法专属性较低；分子生物学法具有高专属性，但受限于样品中遗传物质保存的完好程度，对于海龙药酒、炮制品、提取物、虫蛀霉变以及多个个体混杂的样品，因提取DNA困难而无法顺利实验。近年来，越来越多的方法和标准中使用特征肽段对天然药物进行鉴别或定量研究。各物种中所含的蛋白质存在个别位点氨基酸的差别，可用适当的蛋白酶将差异位点截取出来，作为具有标识意义的多肽段，即特征肽段。特征肽段的检测一般使用质谱手段，无需考虑蛋白质活性，制备方法简单且肽段性质较为稳定。现有的海龙鉴定的方法限制因素较多，无法在海龙粉末、海龙药酒、炮制品、提取物等衍生制品中进行应用，海龙蛋白中的特征肽段，有潜力作为海龙物种鉴定的指标成分。目前，各数据库中均未收载刁海龙相关蛋白序列信息，无法通过蛋白序列比对获得差异肽段，因此尚未有刁海龙特征多肽的相关记载。
发明内容
本发明的目的在于提供两条刁海龙特征多肽及其应用和鉴别刁海龙的方法。本发明提供的特征多肽针对刁海龙具有优异的专属性和稳定性，特异性强，可用于海龙药材种属鉴别，具体为刁海龙的鉴别，具有良好的应用前景。
本发明提供了两条刁海龙特征多肽，所述特征多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述技术方案所述特征多肽在鉴别刁海龙中的应用。
进一步的，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2单独或共同在鉴别刁海龙中的应用。
优选的是，所述鉴别使用质谱法进行，检测离子对包括：SEQ ID NO.1质荷比为m/z526.7→811.4的定量离子，质荷比为m/z 526.7→527.3的定性离子；SEQ ID NO.2质荷比为m/z 690.3→856.5的定量离子，质荷比为m/z690.3→1052.6的定性离子。
本发明还提供了一种刁海龙的鉴别方法，采用SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的特征多肽作为对照品。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述的特征多肽鉴别刁海龙的方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：将预处理的海龙提取液或预处理的海龙药酒提取液分别与胰蛋白酶混合，得到混合液，将所述混合液与碳酸氢铵水溶液混合，酶解后过滤，取滤液，得到供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：以上述技术方案所述刁海龙特征肽为对照品，加水溶解，得到对照品溶液；
(3)检测分析：利用三重四极杆质谱法进行检测分析；
所述步骤(1)或(2)之间没有时间先后顺序的限定。
优选的是，步骤(1)中，所述预处理的海龙提取液的制备方法包括以下步骤：将海龙粉碎，与水混合后煎煮三次，煎煮时间分别为4h、3h和2h，合并煎煮液，使用碳酸氢铵水溶液进行稀释，得到预处理的海龙提取液；
所述预处理的海龙药酒提取液的制备过程包括以下步骤：将海龙药酒中海龙取出，低温干燥，用水煎煮三次，煎煮时间分别为4h、3h和2h，合并煎煮液，过滤，取滤液，得到预处理的海龙药酒提取液；
优选的是，所述胰蛋白酶以胰蛋白酶水溶液的形式进行添加，所述胰蛋白酶在所述胰蛋白酶水溶液中的质量浓度为1mg/ml。
优选的是，所述碳酸氢铵水溶液中碳酸氢铵的质量百分含量为1％。
优选的是，所述酶解的条件为37℃酶解2h。
优选的是，所述三重四极杆质谱法以0.1％甲酸乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱：0～3min，5％A→8％A；流速为每分钟0.5ml。
优选的是，所述三重四极杆质谱法采用质谱检测器，电喷雾正离子模式，进行多反应监测，SEQ ID NO.1选择质荷比m/z 526.7→811.4的定量离子，m/z 526.7→527.3的定性离子作为检测离子对，SEQ ID NO.2选择质荷比为m/z 690.3→856.5的定量离子，m/z690.3→1052.6的定性离子作为检测离子对。
本发明提供了两条刁海龙特征多肽。本发明提供的特征多肽作为刁海龙鉴别的指标成分，可与其他物种的海龙进行区分，为开发刁海龙及相关产品的鉴别方法奠定基础。具体的，本发明所述特征多肽具有以下有益效果：
(1)本发明通过将蛋白序列中的差异性多肽段截取出来，采用质谱进行检测，操作简单快捷，测定结果稳定，不受海龙样品的形态和加工过程的干扰，填补了刁海龙物种鉴别以及海龙制品中刁海龙检测方法的空白；
(2)本发明提供的特征多肽及检测方法，为数据库缺乏的近缘物种中特征肽段的寻找提供了参考；
(3)本发明提供的特征多肽针对刁海龙具有优异的专属性和稳定性，特异性强，可用于刁海龙药材的鉴别，具有良好的应用前景。
附图说明
附图1-9为本发明提供的刁海龙特征肽SEQ ID NO.1专属性图谱；
其中：图1：SEQ ID NO.1特征肽对照；图2：刁海龙样品；图3：拟海龙样品；图4：舒氏海龙样品；图5：多棘刁海龙样品；图6：宝珈枪吻海龙样品；图7：长粗吻海龙样品；图8：粗吻海龙样品；图9：葛氏海镯鱼样品。
附图10-18为本发明提供的刁海龙特征肽SEQ ID NO.2专属性图谱；
其中：图10：SEQ ID NO.2特征肽对照；图11：刁海龙样品；图12：拟海龙样品；图13：舒氏海龙样品；图14：多棘刁海龙样品；图15：宝珈枪吻海龙样品；图16：长粗吻海龙样品；图17：粗吻海龙样品；图18：葛氏海镯鱼样品。
具体实施方式
本发明提供了两条刁海龙特征多肽，所述特征多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：GA-(Hyp)-GLGGPTGPR，SEQ ID NO.2所示：VGPAGPGGAAGPAGPVGPVGKDGAR。本发明提供了刁海龙具有特征性识别意义的肽段。本发明将刁海龙、拟海龙、多棘刁海龙、舒氏海龙等不同种海龙的水提取物经过胰蛋白酶酶解后，使用纳升液相色谱-高分辨质谱联用仪分析，获得海龙蛋白质全肽段质谱图；将质谱数据进行化学计量学分析，再使用三重四极杆质谱对实验结果进行专属性验证；最终提供了2个特征离子对，对应2条特征肽段，专属性验证结果良好。
本发明还提供了上述技术方案所述特征多肽在鉴别刁海龙中的应用。
在本发明中，所述鉴别使用质谱法进行，检测离子对包括：SEQ ID NO.1质荷比为m/z 526.7→811.4的定量离子，质荷比为m/z 526.7→527.3的定性离子；SEQ ID NO.2质荷比为m/z 690.3→856.5的定量离子，质荷比为m/z690.3→1052.6的定性离子。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述的特征多肽鉴别刁海龙的方法，包括以下步骤：
(1)将预处理的海龙提取液或预处理的海龙药酒提取液分别与胰蛋白酶混合，得到混合液，将所述混合液与碳酸氢铵水溶液混合，酶解后过滤，取滤液，得到供试品溶液；
(2)以上述技术方案所述刁海龙特征肽为对照品，加碳酸氢铵水溶液溶解，得到对照品溶液；
(3)利用三重四极杆质谱法进行检测分析；
所述步骤(1)或(2)之间没有时间先后顺序的限定。
本发明所述方法通过将蛋白序列中的差异性多肽段截取出来，采用质谱进行检测，操作简单快捷，测定结果稳定，不受海龙样品的形态和加工过程的干扰，填补了刁海龙物种鉴别以及海龙制品中刁海龙检测方法的空白，为数据库缺乏的近缘物种中特征肽段的寻找提供了参考。
本发明将预处理的海龙提取液或预处理的海龙药酒提取液分别与胰蛋白酶混合，得到混合液，将所述混合液与碳酸氢铵水溶液混合，酶解后过滤，取滤液，得到供试品溶液。在本发明中，所述预处理的海龙提取液的制备方法优选包括以下步骤：将海龙粉碎，与水混合后煎煮三次，煎煮时间分别为4h、3h和2h，合并煎煮液，使用碳酸氢铵水溶液进行稀释，得到预处理的海龙提取液。本发明优选取100g粉碎的海龙，煎煮液优选共计500mL。在本发明中，所述稀释优选为稀释10倍。具体的，本发明优选取煎煮液5mL，置于50mL量瓶中，使用碳酸氢铵水溶液稀释至刻度，摇匀，得到预处理的海龙提取液。在本发明中，所述预处理的海龙药酒提取液的制备过程优选包括以下步骤：将海龙药酒中海龙取出，低温干燥，用水煎煮三次，煎煮时间分别为4h、3h和2h，合并煎煮液，过滤，取滤液，得到预处理的海龙药酒提取液。得到预处理的海龙提取液和预处理的海龙药酒提取液后，本发明优选量取1～5mL海龙提取液或海龙药酒提取液，优选加入胰蛋白酶溶液100μL，摇匀后，加碳酸氢铵水溶液至50mL，摇匀，密塞后进行酶解。在本发明中，所述酶解的条件优选为37℃酶解2h。酶解后，本发明优选放冷，更优选放冷至常温，本发明所述常温的温度范围优选为10～30℃。放冷后，本发明进行过滤，取滤液，作为供试品溶液。
在本发明中，所述胰蛋白酶以胰蛋白酶水溶液的形式进行添加，所述胰蛋白酶在所述胰蛋白酶水溶液中的质量浓度为1mg/ml。在本发明中，所述碳酸氢铵水溶液中碳酸氢铵的质量百分含量为1％。
本发明以上述技术方案所述刁海龙特征肽为对照品，加水溶解，得到对照品溶液。本发明对所述刁海龙特征肽的来源没有特殊限定，采用人工合成方法即可，如本发明2条刁海龙特征肽均是委托南京源肽生物科技有限公司按照指定的氨基酸序列合成所获得。
本发明利用三重四极杆质谱法进行检测分析。在本发明中，所述三重四极杆质谱法优选以0.1％甲酸乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱：0～3min，5％A→8％A；流速为每分钟0.5ml。在本发明中，所述三重四极杆质谱法优选采用质谱检测器，电喷雾正离子模式，进行多反应监测，SEQ ID NO.1选择质荷比为m/z 526.7→811.4的定量离子，m/z 526.7→527.3的定性离子；SEQ ID NO.2选择质荷比为m/z 690.3→856.5的定量离子，m/z 690.3→1052.6的定性离子。
下面结合具体实施例对本发明所述的两条刁海龙特征多肽及其应用和鉴别刁海龙的方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
三重四极杆质谱测定条件
以0.1％甲酸乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱(0～3min，5％A→8％A)；流速为每分钟0.5ml。采用质谱检测器，电喷雾正离子模式(ESI+)，进行多反应监测(MRM)，SEQ ID NO.1选择质荷比为m/z 526.7→811.4的定量离子，m/z 526.7→527.3的定性离子；SEQ ID NO.2选择质荷比为m/z 690.3→856.5的定量离子，m/z 690.3→1052.6的定性离子。
实施例1：刁海龙特征肽段寻找
(1)供试品溶液的制备
海龙水提液：取供试品海龙100g粉碎，置三角瓶中，加水煎煮三次，分别4h，3h，2h，合并煎煮液，共500mL，微沸浓缩至液体粘稠，转移至硅胶碗中，于60℃电热恒温鼓风干燥箱中干燥至固体，得海龙水提物；
供试品溶液：称取海龙水提物样品0.1g，加1％碳酸氢铵水溶液50ml，超声处理30min使溶解，用微孔滤膜过滤，取续滤液100μL，加1mg/ml的胰蛋白酶水溶液10μL，37℃酶解2h，取出放冷至室温，即得。
(2)特征离子的选择及序列推测
供试品溶液通过纳升液相色谱-高分辨质谱分析后，将质谱数据导入PEAKS 8.5软件，进行样品全部肽段的从头测序及序列预测，并分析得到的结果。从其分析结果中选择了刁海龙中可被检出，其他种属海龙中几乎未检出的肽段作为母离子，并对其二级图谱进行逐个分析，选择响应较好的子离子。通过分析得到代表刁海龙差异性的质谱离子对信息m/z526.7(双电荷)→811.4、527.3和m/z 690.3(双电荷)→856.5、1052.6。通过进一步解析，推测该离子对应的刁海龙特征肽段序列，SEQ ID NO.1为GA-(Hyp)-GLGGPTGPR，其中HYP为羟脯氨酸。SEQ ID NO.2为VGPAGPGGAAGPAGPVGPVGKDGAR。
按照推测的氨基酸序列委托合成刁海龙特征肽对照品，将对照品与刁海龙供试品溶液同时检测，两者保留时间与二级质谱信息均一致，从而确认该序列正确性。
实施例2：刁海龙特征肽专属性研究
采用三重四极杆质谱测定条件对所有物种海龙的水提物进行检测，结果显示三批刁海龙种均出现刁海龙特征肽色谱峰，而其它多棘刁海龙、拟海龙、舒氏海龙、宝珈枪吻海龙、长粗吻海龙、葛氏海镯鱼中均未出现相应的色谱峰。见附图1-9，见附图10-18。表明该特征肽为刁海龙中特有，可以作为指标成分对刁海龙进行鉴别。
实施例3：刁海龙特征肽在海龙提取物和海龙药酒中的应用
(1)样品制备
海龙提取液供试品溶液制备：取供试品海龙100g粉碎，置三角瓶中，加水煎煮三次，分别4h，3h，2h，合并煎煮液，共500mL；取海龙提取液5ml，置50ml量瓶中，加1％碳酸氢铵水溶液稀释至刻度，摇匀，量取1ml至5ml量瓶中，加1mg/ml胰蛋白酶水溶液100μl，摇匀，再加1％碳酸氢铵水溶液定容至刻度，摇匀，密塞，37℃恒温酶解2h，放冷，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
海龙药酒供试品溶液制备：取海龙药酒中海龙10g，低温干燥，加水煎煮三次，分别4h，3h，2h，合并煎煮液，共50mL；滤过，取滤液1ml至5ml量瓶中，自“加1mg/ml胰蛋白酶水溶液100μl”起，照上文方法制备。
刁海龙特征肽段对照品溶液：分别称取刁海龙特征肽对照品SEQ ID NO.1和SEQID NO.2各10mg，置50ml量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得。
(2)利用三重四极杆质谱测定条件进行测定。
(3)样品测定
对收集的10批刁海龙提取液样品和5批刁海龙药酒样品进行测定，结果均检出刁海龙特征肽，表明这两条特征肽均可用于海龙制品中刁海龙成分的鉴别。
实施例4：具有鉴别潜力的离子信息
将391个候选离子中筛选出5个具有鉴别潜力的离子信息，经过三重四极杆质谱验证，并不是任意的离子均能够实现刁海龙成分的鉴定，部分离子对刁海龙的专属性不足，仅质核比为526.7和690.3的离子专属性良好，具体结果见表1。
表1专属性验证结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 山东省食品药品检验研究院
<120> 刁海龙特征多肽及其应用和鉴别刁海龙的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (3)..(3)
<223> The 'Xaa' at location 3 stands for HYP.
<220>
<221> UNSURE
<222> (3)..(3)
<223> The 'Xaa' at location 3 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 1
Gly Ala Xaa Gly Leu Gly Gly Pro Thr Gly Pro Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Val Gly Pro Ala Gly Pro Gly Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Pro Val
1 5 10 15
Gly Pro Val Gly Lys Asp Gly Ala Arg
20 25
Claims (10)
1.一种刁海龙特征多肽，其特征在于，所述特征多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述特征多肽在鉴别刁海龙中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鉴别使用质谱法进行，SEQ ID NO.1检测离子对包括：质荷比为m/z 526.7→811.4的定量离子，质荷比为m/z 526.7→527.3的定性离子；和/或SEQ ID NO.2检测离子对包括：质荷比为m/z 690.3→856.5的定量离子，质荷比为m/z 690.3→1052.6的定性离子。
4.一种刁海龙的鉴别方法，其特征在于，采用权利要求1所述的特征多肽作为对照品。
5.根据权利要求4所述的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：将预处理的海龙提取液或预处理的海龙药酒提取液分别与胰蛋白酶混合，得到混合液，将所述混合液与碳酸氢铵水溶液混合，酶解后过滤，取滤液，得到供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：以权利要求1所述刁海龙特征肽为对照品，分别加水溶解，得到对照品溶液；
(3)检测分析：利用三重四极杆质谱法进行检测分析；
所述步骤(1)或(2)之间没有时间先后顺序的限定。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述预处理的海龙提取液的制备方法包括以下步骤：将海龙粉碎，与水混合后煎煮三次，煎煮时间分别为4h、3h和2h，合并煎煮液，使用碳酸氢铵水溶液进行稀释，得到预处理的海龙提取液；
所述预处理的海龙药酒提取液的制备过程包括以下步骤：将海龙药酒中海龙取出,低温干燥，用水煎煮三次，煎煮时间分别为4h、3h和2h，合并煎煮液，过滤，取滤液，得到预处理的海龙药酒提取液。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述胰蛋白酶以胰蛋白酶水溶液的形式进行添加，所述胰蛋白酶在所述胰蛋白酶水溶液中的质量浓度为1mg/ml。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述碳酸氢铵水溶液中碳酸氢铵的质量百分含量为1％；所述酶解的条件为37℃酶解2h。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述三重四极杆质谱法以0.1％甲酸乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱：0～3min，5％A→8％A；流速为每分钟0.5ml。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述三重四极杆质谱法采用质谱检测器，电喷雾正离子模式，进行多反应监测，SEQ ID NO.1选择质荷比m/z 526.7→811.4的定量离子，m/z 526.7→527.3的定性离子作为检测离子对，SEQ ID NO.2选择质荷比为m/z 690.3→856.5的定量离子，m/z 690.3→1052.6的定性离子作为检测离子对。
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