CN115925789B - 一种鉴别鹿制品混合物种属来源的特征多肽库及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于鹿制品种属鉴别领域，具体涉及一种鉴别鹿制品混合物种属来源的特征多肽库及其应用。该特征多肽库可以同时鉴别7种鹿科动物的鹿制品混合物。本发明的特征肽段来源为β珠蛋白，广泛存在鹿科动物血液中，故只要含有微量血液的样品都可适用。本发明通过大量的实验研究，得到了能够进行区别鉴定的特征多肽，专属性强，检测方法简单快捷，提高了鹿科动物相关产品的质量控制水平，提高了临床用药的安全性和有效性，且检出限低，检测样品用量少。
Description
技术领域
本发明属于鹿制品种属鉴别领域，具体涉及一种鉴别鹿制品混合物种属来源的特征多肽库及其应用。
背景技术
鹿科动物浑身是宝。自古以来鹿制品就一直是皇室和达官贵族的长寿补品，现在也已经成为普通百姓防病强身、滋补美容、延年益寿的保健佳品。随着现代养鹿业的飞速发展，人类开发出的鹿制品越来越多，极大的丰富了鹿制品在医疗保健中的神奇功效，使广大民众受益无穷。鹿制品给人类提供了极其丰富的产品，其中最贵重的产品之一就是鹿茸。其次如鹿胎、鹿心、鹿血、鹿筋、鹿鞭、鹿尾等都是医药的贵重原料，这些鹿制品都具有着极高的药用价值和保健功效。由于鹿科动物种类繁多，市场上的鹿制品来源无法通过肉眼区分，也无法通过显微鉴别、薄层色谱及液相色谱等常规方法鉴别，并且由于鹿制品价格较高，出现以部分伪品掺正品售卖的现象。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种鉴别鹿制品混合物种属来源的特征多肽库。
本发明还提供了一种上述特征多肽库在鉴别鹿制品混合物种属来源中的应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种鉴别鹿制品混合物种属来源的特征多肽库，所述特征多肽库的序列如SEQ ID NO.1-19所示，具体为：
其中，上述序列中：
肽段7：序列FFEHFGDLSSADAVmGNPK，m为M的氧化翻译后修饰；
肽段9：序列FFEHFGDLSTPDAVmGNPK，m为M的氧化翻译后修饰；
肽段10：序列VVAGVAnALAHR，n为N的脱酰胺翻译后修饰；
肽段11：序列FFEHFGDLSTADAVmGNPK，m为M的氧化翻译后修饰；
肽段19：序列VVTGVANnALAHR，n为N的脱酰胺翻译后修饰。
本发明还提供了一种上述特征多肽库在快速鉴别鹿制品混合物中种属来源中的应用，鉴别原则具体为：
（1）样品中检出与驼鹿对照药材相应的肽段1或肽段2或肽段3，且未检出肽段7和肽段12，则认为混合样品为驼鹿来源；
（2）样品中检出与驯鹿对照药材相应的肽段4或肽段5或肽段6，且未检出肽段1,（或未检出肽段7和肽段14），则认为混合样品为驯鹿来源；
（3）样品中检出与白尾鹿对照药材相应的肽段7，且未检出肽段3和肽段12（或为检出肽段6和肽段14）则认为混合样品为白尾鹿来源；
（4）样品中检出与白唇鹿对照药材相应的肽段8，且未检出肽段15，则认为混合样品为白唇鹿来源；
（5）样品中检出与黇鹿对照药材相应的肽段9，且未检出肽段16和肽段17和肽段18，则认为混合样品为黇鹿来源；
（6）样品中检出与梅花鹿对照药材相应的肽段10，且未检出肽段7和肽段8和肽段19，则认为混合样品为梅花鹿来源；
（7）样品中检出与马鹿对照药材相应的肽段11，且未检出肽段3和肽段6和肽段9和肽段10，则认为混合样品为马鹿来源。
鉴别过程中，具体包括以下步骤：
（1）样品制备方法：样品粉碎，过筛，称取粉末50mg，加入10mL变性缓冲液，摇匀，置80℃处理过夜，取出放冷至室温，12000r离心10分钟，取500μL样品提取液，使用分子量3kDa的超滤离心管对样品进行脱盐和酶解，即得。
（2）采用高效液相-三重四级杆质谱联用进行鉴定。
本发明所使用的的变性缓冲液为：6M盐酸胍，1M Tris，2.5mM乙二胺四乙酸，加浓盐酸调pH至8.0。
进一步的，所述脱盐和酶解的具体步骤为：将样品提取液加入超滤离心管上层，12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL水，12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL水，12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL 1%的NH4HCO3溶液和10μL 10mg/ml的牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15分钟，取出放冷至室温，离心，取上清液。
进一步的，所述液相的条件为：色谱柱为Agilent SB C18 (2.1×100mm，1.8μm)，柱温43℃，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱，进样量为5 μL。
上述梯度洗脱为：0~9min,3%B→7.5%B; 9~13min, 7.5%B→25%B; 13~14min,25%B→90%B; 14~17min, 90%B; 17~17.5min, 90%B →97%B,17.5~21min,97%B。
进一步的，所述质谱的条件为：采用质谱检测器，电喷雾离子化（ESI），正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46L/hr；辅助气流速850 L/hr；喷雾电压3.5KV；离子源温度150℃；辅助气温度400℃。锥孔电压30V，碰撞电压35V)，溶剂延迟（solvent delay）为0～4min和16～20min。
本发明提供了一种鹿制品特征多肽库，可以同时鉴别7种鹿科动物的鹿制品混合物。本发明的特征肽段来源为β珠蛋白，广泛存在鹿科动物血液中，故只要含有微量血液的样品都可适用。
本发明的有益效果为：
（1）本发明使用高效液相-三重四级杆质谱联用的方法，可以同时鹿制品的混合物中7种鹿科动物的鉴别鉴定，高效且专属性好。
（2）本发明通过大量的实验研究，得到了能够进行区别鉴定的特征多肽，专属性强，检测方法简单快捷，提高了鹿科动物相关产品的质量控制水平，提高了临床用药的安全性和有效性，且检出限低，检测样品用量少。
附图说明
图1为实施例2鉴别过程中判定原则流程图。
图2为肽段1、2、3正确序列以及b、y离子归属。
图3为肽段4、5、6正确序列以及b、y离子归属。
图4为肽段7正确序列以及b、y离子归属。
图5为肽段8、9正确序列以及b、y离子归属。
图6为肽段10、11正确序列以及b、y离子归属。
图7为肽段12正确序列以及b、y离子归属。
图8为肽段13、14正确序列以及b、y离子归属。
图9为肽段15正确序列以及b、y离子归属。
图10为肽段16、17、18正确序列以及b、y离子归属。
图11为肽段19正确序列以及b、y离子归属。
图12为实施例2中各特征多肽段的出峰时间；其中：(A)驼鹿肽段1、2、3MRM出峰时间(B)驯鹿肽段4、5、6MRM出峰时间(C)白尾鹿肽段7MRM出峰时间(D)白唇鹿肽段8、9MRM出峰时间(E)梅花鹿肽段10、11MRM出峰时间。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
实施例1 特征多肽的筛选
样品上清液通过纳升液相色谱-高分辨质谱分析后，将质谱数据导入PEAKS 8.5软件，使用 “ AdμLt-beta globin of deer”蛋白的数据库，进行全部肽段的从头测序及肽段匹配。共从头测序到33185条肽段，数据库匹配，共鉴定到333条肽段。使用高效液相-三重四级杆质谱联用仪验证鉴定到的333条肽段对与马鹿、梅花鹿、驼鹿、驯鹿、白唇鹿、白尾鹿及黇鹿的专属性，考察并选择响应强度最高的母离子与子离子作为定性离子与定量离子。
实施例2
样品制备方法：马鹿茸、梅花鹿茸、驼鹿茸、驯鹿茸、黇鹿茸、白尾鹿茸、白唇鹿茸样品粉碎，过筛，称取粉末50mg，加入10mL变性缓冲液（6M盐酸胍，1M Tris，2.5mM乙二胺四乙酸，加浓盐酸调pH至8.0），摇匀，置80℃处理过夜，取出放冷至室温，12000r离心10分钟，取500μL，使用分子量3kDa的超滤离心管对样品进行脱盐和酶解（12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL水，12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μLμL水，12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL 1% NH4HCO3溶液和10μL牛胰蛋白酶(10mg/ml)溶液，37℃酶解15分钟，取出放冷至室温，离心，取上清液），即得。
液相条件：色谱柱为Agilent SB C18 (2.1×100mm，1.8μm)，柱温43℃，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱。（0~9min,3%B→7.5%B; 9~13min, 7.5%B→25%B; 13~14min,25%B→90%B; 14~17min, 90%B; 17~17.5min, 90%B →97%B,17.5~21min,97%B）进样量为5 μL。质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化（ESI），正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46L/hr；辅助气流速850 L/hr；喷雾电压3.5KV；离子源温度150℃；辅助气温度400℃。锥孔电压30V，碰撞电压35V)。溶剂延迟（solvent delay）为0～4min和16～20min。
检测过程中所使用的特征多肽库如表1所示。
表1
各肽段的正确序列以及b、y离子归属如图2-图11所示，各特征多肽段的出峰时间如图12所示。
判定原则流程图如图1所示，具体判定原则为：
1.样品中检出与驼鹿对照药材相应的肽段1或肽段2或肽段3，且未检出肽段7和肽段12，则认为混合样品为驼鹿来源。
2.样品中检出与驯鹿对照药材相应的肽段4或肽段5或肽段6，且未检出肽段1,（或未检出肽段7和肽段14），则认为混合样品为驯鹿来源。
3.样品中检出与白尾鹿对照药材相应的肽段7，且未检出肽段3和肽段12（或为检出肽段6和肽段14）则认为混合样品为白尾鹿来源。
4.样品中检出与白唇鹿对照药材相应的肽段8，且未检出肽段15，则认为混合样品为白唇鹿来源。
5.样品中检出与黇鹿对照药材相应的肽段9，且未检出肽段16和肽段17和肽段18，则认为混合样品为黇鹿来源。
6.样品中检出与梅花鹿对照药材相应的肽段10，且未检出肽段7和肽段8和肽段19，则认为混合样品为梅花鹿来源。
7.样品中检出与马鹿对照药材相应的肽段11，且未检出肽段3和肽段6和肽段9和肽段10，则认为混合样品为马鹿来源。
效果验证
专属性验证：分别对马鹿茸、梅花鹿茸、驼鹿茸、驯鹿茸、黇鹿茸、白尾鹿茸、白唇鹿茸样品进行实验，各个鹿科动物茸中的专属肽段均可检出，且其他鹿科动物中未检出，故认为该方法专属性好。
耐用性实验：分别使用 Agilent ZORBAX SB RRHD, Agilent ZORBAX EclipseRRHD, Waters ACQUITY UPLC HSS色谱柱对马鹿茸、梅花鹿茸、驼鹿茸、驯鹿茸、黇鹿茸、白尾鹿茸、白唇鹿茸样品进行实验，各个鹿科动物茸中的专属肽段均可检出，故认为该方法耐用性好。
重复性实验：将马鹿茸、梅花鹿茸、驼鹿茸、驯鹿茸、黇鹿茸、白尾鹿茸、白唇鹿茸样品平行制备3份进行实验，各个鹿科动物茸中的专属肽段均可检出，故认为该方法重复性好。
序列表
<110> 山东省食品药品检验研究院
<120> 一种鉴别鹿制品混合物种属来源的特征多肽库及其应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
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1 5 10
Claims (8)
1.一种鉴别鹿制品混合物种属来源的特征多肽库，其特征在于，所述特征多肽库具体为：
所述特征多肽库中：
肽段7：序列FFEHFGDLSSADAVmGNPK，m为M的氧化翻译后修饰；
肽段9：序列FFEHFGDLSTPDAVmGNPK，m为M的氧化翻译后修饰；
肽段10：序列VVAGVAnALAHR，n为N的脱酰胺翻译后修饰；
肽段11：序列FFEHFGDLSTADAVmGNPK，m为M的氧化翻译后修饰；
肽段19：序列VVTGVANnALAHR，n为N的脱酰胺翻译后修饰。
2.一种如权利要求1所述的特征多肽库在快速鉴别鹿制品混合物中种属来源中的应用，其特征在于，鉴别原则具体为：
（1）样品中检出与驼鹿对照药材相应的肽段1或肽段2或肽段3，且未检出肽段7和肽段12，则认为混合样品为驼鹿来源；
（2）样品中检出与驯鹿对照药材相应的肽段4或肽段5或肽段6，且未检出肽段1，或未检出肽段7和肽段14，则认为混合样品为驯鹿来源；
（3）样品中检出与白尾鹿对照药材相应的肽段7，且未检出肽段3和肽段12，或未检出肽段6和肽段14，则认为混合样品为白尾鹿来源；
（4）样品中检出与白唇鹿对照药材相应的肽段8，且未检出肽段15，则认为混合样品为白唇鹿来源；
（5）样品中检出与黇鹿对照药材相应的肽段9，且未检出肽段16和肽段17和肽段18，则认为混合样品为黇鹿来源；
（6）样品中检出与梅花鹿对照药材相应的肽段10，且未检出肽段7和肽段8和肽段19，则认为混合样品为梅花鹿来源；
（7）样品中检出与马鹿对照药材相应的肽段11，且未检出肽段3和肽段6和肽段10，则认为混合样品为马鹿来源。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）样品制备方法：样品粉碎，过筛，称取粉末50mg，加入10mL变性缓冲液，摇匀，置80℃处理过夜，取出放冷至室温，12000r离心10分钟，取500μL样品提取液，使用分子量3kDa的超滤离心管对样品进行脱盐和酶解，即得；
（2）采用高效液相-三重四级杆质谱联用进行鉴定。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述变性缓冲液为：6M盐酸胍，1M Tris，2.5mM乙二胺四乙酸，加浓盐酸调pH至8.0。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述脱盐和酶解的具体步骤为：将样品提取液加入超滤离心管上层，12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL水，12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL水，12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL 1%NH4HCO3溶液和10μL浓度为10mg/ml的牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15分钟，取出放冷至室温，离心，取上清液。
6. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述液相的条件为：色谱柱为Agilent SBC18，2.1×100mm，1.8μm，柱温43℃，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱，进样量为5 μL。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述梯度洗脱为：0~9min,3%B→7.5%B; 9~13min, 7.5%B→25%B; 13~14min,25%B→90%B; 14~17min, 90%B; 17~17.5min, 90%B →97%B,17.5~21min,97%B。
8. 根据权利要求3-6任一项所述的应用，其特征在于，所述质谱的条件为：采用质谱检测器，电喷雾离子化，正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46L/hr；辅助气流速850 L/hr；喷雾电压3.5KV；离子源温度150℃；辅助气温度400℃；锥孔电压30V，碰撞电压35V，溶剂延迟为0～4min和16～20min。
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| CN115925789A (zh) | 2023-04-07 |
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