CN113307846A - 一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿茸鹿角的特征多肽及其应用 - Google Patents

一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿茸鹿角的特征多肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿茸鹿角的特征多肽及其应用。本发明提供的特征多肽具体为：肽段1如SEQ ID No.1所示：KAPQVSTPTLVELSR；肽段2如SEQ ID No.2所示：HHGGEFTVVLQADFQK。本发明提供的特征多肽及检测方法，为数据库缺乏的近缘物种中特征肽段的寻找提供了参考。本发明提供的特征多肽针对梅花鹿或马鹿的鹿茸及鹿角具有优异的专属性和稳定性，特异性强，可用于鹿茸、鹿角药材及其饮片以及使用原粉投料的中成药的鉴别，具有良好的应用前景。

Description

一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿茸鹿角的特征多肽及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿茸鹿角的特征多肽及其应用。
背景技术
鹿茸及鹿角是我国传统的名贵中药材，其中鹿茸为鹿科动物梅花鹿（Cervus nippon Temminck）或马鹿（Cervus elaphus Linnaeus）的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，有壮肾阳，益精血，强筋骨，调冲任，托疮毒的疗效；鹿角为鹿科动物梅花鹿（Cervus nippon Temminck）或马鹿（Cervus elaphus Linnaeus）已骨化的角或锯茸后翌年春季脱落的角基，有温肾阳，强筋骨，行血消肿的功效。在中医药中，多种成药使用鹿茸及鹿角为原料，导致其资源紧张，价格昂贵。
中国是世界上产鹿种类最多的国家，世界鹿科动物现存38种， 我国有16种。市场上出现的鹿茸及鹿角伪品，以驯鹿及驼鹿为主，另有部分狍鹿、黇鹿、白唇鹿、白尾鹿等的茸及角也被拿来以次充好。而鹿茸的炮制品如鹿茸片、鹿茸粉等通过观察性状难以鉴别真伪。《中国药典》2020年版中鹿茸的鉴别实验有三项，分别为显微鉴别及氨基酸的理化鉴别、薄层色谱鉴别。而鹿角仅有性状一项鉴别无法区分种属。
近年来，关于使用特征肽段对天然药物进行定性或定量研究的报道越来越多。如巩丽萍等利用特征肽段对阿胶中皮源进行鉴别，可以精准鉴别出阿胶中是否掺杂了马皮，程显隆等使用主成分分析等手段找到了鹿角胶相对于阿胶、新阿胶、黄明胶、龟甲胶的特征离子对。房芳等结合鸟枪蛋白组学技术对不同物种的热稳定特征肽进行检测和鉴定等，都对特征肽段鉴别动物源性做出大量研究。而现有技术中，由于鹿种属蛋白数据比较少，难以查找到目标特征肽段，主要由于以下几点：1.梅花鹿、马鹿及其伪品驼鹿、驯鹿、黇鹿、白唇鹿、白尾鹿等同为鹿科哺乳动物，遗传物质相似度高，所对应蛋白质的相似度高，较难找到差异；2.梅花鹿的自然种群现在仅分布在东北亚，即俄罗斯的乌苏里地区到中国、中国台湾、越南北部和日本等地；而鹿茸及鹿角药材仅在中国大规模使用，对于梅花鹿蛋白质组学的研究材料很少，可参考的蛋白质数据库匮乏，尤其是胶原蛋白及角蛋白的研究数据比较少，难以通过库内比对序列的方法找到不同鹿科动物胶的差异肽段。目前，尚未有针对梅花鹿马及鹿与其他鹿科动物进行鉴别、准确区分的方法。
发明内容
针对现有技术中存在的技术空白，本发明提供了一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿茸鹿角的特征多肽。
本发明还提供了上述特征多肽在鉴别梅花鹿或马鹿鹿茸鹿角种属鉴别中的应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿茸鹿角的特征多肽，所述特征多肽具体为：肽段1如SEQ ID No.1所示：KAPQVSTPTLVELSR；肽段2如SEQ ID No.2所示：HHGGEFTVVLQADFQK。
进一步的，所述SEQ ID No.1肽段1的质荷比为542.65；所述SEQ ID No.2肽段2的质荷比为604.97。
本发明还提供了一种用于鉴别梅花鹿或马鹿鹿茸鹿角的试剂盒，所述试剂盒中包含权利要求1或2所述的特征多肽。
本发明还提供了一种利用上述特征多肽鉴别梅花鹿或马鹿鹿茸鹿角的方法，包括以下步骤：
（1）对待测样品进行前处理，得待检测溶液；
（2）将待检测溶液通过液相-三重四级杆质谱法进行检测，分析对比待检测溶液中的质谱结果同肽段1、肽段2的质谱图，当质谱图中出现肽段1或肽段2的质谱图时，可判断待测样品为梅花鹿或马鹿。
进一步的，所述待测样品的前处理具体过程为：样品粉碎，过筛，称取样品粉末10mg，加入5ml变性缓冲液，和1ml DTT溶液，摇匀，置80℃处理过夜，取出放冷至室温，离心，量取上清液500μL，加入100μL IAA溶液，避光反应30min，混匀，离心；对样品溶液脱盐后，量取上清液100μL，加入900μL碳酸氢铵溶液（1%）和5μL牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解4h，取出放冷至室温，离心，取上清液，即得。
上述变性缓冲液具体制备过程为：称取573.1g 盐酸胍，121.1g 三羟甲基氨基甲烷，0.734g乙二胺四乙酸，加水溶解，加浓盐酸调pH至8.0，加水稀释至1L，摇匀，即得；所述DTT溶液的浓度为0.5M；所述IAA溶液的浓度为0.55M。
进一步的，所述牛胰蛋白酶溶液的具体制备过程为：液称取牛胰蛋白酶适量，用乙酸溶液溶解，制成浓度为10mg/ml的溶液，临用现配；所述乙酸溶液的浓度为2%。
本发明所使用的液相-三重四级杆质谱法中，液相条件为：色谱柱为ACQUITY UPLC® BEH C18 (2.1×50mm，1.7μm)，柱温43℃，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱。
上述梯度洗脱的条件为：0～9min,3%B→7.5%B；9～13min, 7.5%B→25%B；13～14min,25%B→90%B；14～17min, 90%B；17～17.5min, 10%B -97%B；17.5～21min,97%B，进样量为5μm。
本发明所使用的液相-三重四级杆质谱法中，质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化（ESI），正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46L/hr；辅助气流速850 L/hr；喷雾电压3.5KV；离子源温度150℃；辅助气温度400℃；锥孔电压30V，碰撞电压35V)；溶剂延迟（solvent delay）为0～8min和14～20min；选择m/z（三电荷）542.65→226.12、542.65→375.24作为检测离子对。
本发明的有益效果为：
（1）本发明提供的特征多肽及检测方法，为数据库缺乏的近缘物种中特征肽段的寻找提供了参考。
（2）本发明提供的特征多肽针对梅花鹿或马鹿的鹿茸鹿角具有优异的专属性和稳定性，特异性强，可用于鹿茸、鹿角药材及其饮片以及使用原粉投料的中成药的鉴别，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为m/z（三电荷）542.65的二级质谱图及y离子、b离子归属。
图2为m/z（三电荷）604.97的二级质谱图及y离子、b离子归属。
图3为m/z（三电荷）542.65的专属性实验结果。
图4为 m/z（三电荷）604.97的专属性实验结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施方式对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
（一）仪器和试剂：Thermo EASY-nLC 1000纳升液相，Thermo ScientificOrbitrap-Fusion高分辨质谱，AB Triple Quad 6500+高效液相色谱质谱联用仪，赛多利斯XSE205电子天平，胰蛋白酶（Sigma公司生产，批号：SLBG6452V）盐酸胍、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫苏糖醇（DTT）、碘代乙酰胺（IAA）、碳酸氢铵、乙酸均为分析纯。甲酸、乙腈均为色谱纯。
用于进行分析实验及专属性实验的为鹿茸、鹿角及鹿角胶样品，其中鹿茸与鹿角样品为企业提供，经山东省农业科学院PCR实验检定鹿源，鹿角胶样品为中国食品药品检定研究院提供。
实施例1
1、测定条件
1.1 纳升液相-高分辨质谱测定条件
纳升色谱条件：以Thermo Acclaim PepMap C18柱（100 μm×3.5 cm，5 μm）脱盐富集，Thermo Acclaim PepMap C18柱（75μm×15cm，3 μm）分离，流速300nL/min，流动相A为2%乙腈的0.1%甲酸水溶液，流动相B为含98%乙腈的0.1%甲酸水溶液，进行梯度洗脱(0~1min,1%B→6%B;1~96min,6%B→22%B;96~113min,22%B→30%B;113~117min,30%B→95%B; 117~120min,95%B）进样量为1 μm。高分辨质谱条件：离子源为Nanospray Flex纳喷源。以正离子模式进行分析，喷雾电压为1800V，离子传输毛细管温度为275 ℃，S-Lens传输效率设置为60%。一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，分辨率为60000，采集范围为350~1550（m/z）；二级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，采用Rapid Scan模式进行扫描，利用Top 20数据依赖模式进行母离子选择，采用HCD模式进行碎裂，碎裂能量NCE设置为30%。
1.2 液相-三重四极杆质谱测定条件
液相条件：色谱柱为ACQUITY UPLC® BEH C18 (2.1×50mm，1.7μm)，柱温43℃，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱。（0～9min,3%B→7.5%B；9～13min, 7.5%B→25%B；13～14min,25%B→90%B；14～17min, 90%B；17～17.5min, 10%B -97%B,17.5～21min,97%B）进样量为5 μm。质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化（ESI），正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46L/hr；辅助气流速850 L/hr；喷雾电压3.5KV；离子源温度150℃；辅助气温度400℃。锥孔电压30V，碰撞电压35V)。溶剂延迟（solvent delay）为0～8min和14～20min。选择m/z（三电荷）542.65→226.12、542.65→375.24作为鹿茸的检测离子对。
鹿茸、鹿角特征离子对选择
2.1 供试品溶液的制备
鹿茸及鹿角样品：样品粉碎，过2号筛。称取样品粉末10mg，加入5ml变性缓冲液（称取573.1g 盐酸胍，121.1g 三羟甲基氨基甲烷，0.734g乙二胺四乙酸，加水溶解，加浓盐酸调pH至8.0，加水稀释至1L，摇匀，即得）。和1ml DTT(0.5M)溶液，摇匀，置80℃处理过夜，取出放冷至室温，离心（12000rpm，10min）。量取上清液500μL，加入100μL IAA(0.55M)溶液，避光反应30min，混匀，离心（12000rpm，10min）；对样品溶液脱盐后，量取上清液100μL，加入900μL碳酸氢铵溶液（1%）和5μL牛胰蛋白酶溶（液称取牛胰蛋白酶适量，用乙酸溶液溶解，制成浓度为10mg/ml的溶液，临用现配），37℃酶解4h，取出放冷至室温，离心（12000rpm，10min），取上清液，即得。
2.2 特征离子的选择
上清液通过纳升液相色谱-高分辨质谱分析后，将质谱数据导入PEAKS 8.5软件，进行样品全部肽段的从头测序及序列预测，并分析得到的结果。从其分析结果中选择了仅马鹿及梅花鹿样品中可被检出，其他鹿科中几乎未检出的肽段作为母离子，并对其二级图谱进行逐个分析，选择响应较好的子离子。
筛选的特征离子对及其预测序列见表1， 肽段二级质谱图及b、y离子归属见图1-2。
表1 特征离子对及其预测序列
Figure 308952DEST_PATH_IMAGE001
3 鹿茸、鹿角样品特征离子对专属性研究
3.1鹿茸、鹿角特征离子对专属性实验
将肽段1、2离子对对所有鹿茸及鹿角样品进行测定，结果两个离子对在马鹿及梅花鹿茸、角样品的色谱图中出现色谱峰，如图3和图4所示，而驯鹿角、驼鹿角、狍鹿角、黇鹿角、白唇鹿角、白尾鹿角中相同保留时间未出现相应色谱峰，具体结果见表2。
表2 特征离子对专属性实验结果
样品编号 名称 肽段1 肽段2
bz001 马鹿茸片 检出 检出
bz002 马鹿茸片 检出 检出
bz003 马鹿茸片 检出 检出
bz004 马鹿茸片 检出 检出
bz005 马鹿茸片 检出 检出
bz006 马鹿茸片 检出 检出
bz007 马鹿茸片 检出 检出
bz008 马鹿茸片 检出 检出
bz009 马鹿茸片 检出 检出
ag010 马鹿茸片 检出 检出
jn011 梅花鹿茸片 检出 检出
ag012 马鹿茸片 检出 检出
ag013 梅花鹿茸片 检出 检出
ag014 梅花鹿茸片 检出 检出
ag015 马鹿茸片 检出 检出
ag016 马鹿茸片 检出 检出
ag017 梅花鹿茸片 检出 检出
ag018 马鹿茸片 检出 检出
ag019 马鹿茸片 检出 检出
lk020 梅花鹿茸片 检出 检出
yp021 马鹿角 检出 检出
yp022 马鹿角 检出 检出
yp023 马鹿茸 检出 检出
yp024 马鹿茸 检出 检出
yp025 黇鹿角 未检出 未检出
yp026 驼鹿角 未检出 未检出
yp027 驯鹿角 未检出 未检出
yp028 白尾鹿角 未检出 未检出
yp029 黇鹿角 未检出 未检出
yp030 黇鹿角 未检出 未检出
yp031 狍鹿角 未检出 未检出
yp032 白唇鹿角 未检出 未检出
鹿茸为雄鹿未骨化的角，在实验中发现鹿茸与鹿角中蛋白相似度较高，故使用纳升液相-高分辨质谱分析及特征离子对寻找时不再区分骨化程度。同时，在实验过程中，发现肽段1离子对可在马鹿及梅花鹿茸、角中检出，但在所有鹿角胶中无法检出，有可能是因为肽段1所归属的蛋白热不稳定，而鹿角胶的制作过程复杂，在反复熬煮过程中肽段1产生了变化。提示肽段1可用于鹿茸及鹿角药材及其饮片以及使用原粉投料的中成药的鉴别。
对比例1
使用前期实验中找到的离子对(m/z)475.76两电荷→204.13、(m/z)475.76两电荷→537.28对鹿角及鹿茸样品进行测定，发现除了正品马鹿、梅花鹿出现吸收峰外，黇鹿与白唇鹿样品中也出现吸收峰。
<110>山东省食品药品检验研究院
<120>一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿茸鹿角的特征多肽及其应用
<160> 2
<210> 1
<211>15
<212>PRT
<222>（1）…（15）
<400>1
Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Leu Ser Arg
1 5 10 15
<210> 2
<211>16
<212>PRT
<222>（1）…（16）
<400>2
His His Gly Gly Glu Phe Thr Val Val Leu Gln Ala Asp Phe Gln Lys
1 5 10 15

Claims (10)

1.一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿茸鹿角的特征多肽，其特征在于，所述特征多肽具体为：肽段1如SEQ ID No.1所示：KAPQVSTPTLVELSR；肽段2如SEQ ID No.2所示：HHGGEFTVVLQADFQK。
2.根据权利要求1所述的特征多肽，其特征在于，所述SEQ ID No.1肽段1的质荷比为542.65；所述SEQ ID No.2肽段2的质荷比为604.97。
3.一种用于鉴别梅花鹿或马鹿鹿茸鹿角的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求1或2所述的特征多肽。
4.一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿茸鹿角的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对待测样品进行前处理，得待检测溶液；
（2）将待检测溶液通过液相-三重四级杆质谱法进行检测，分析对比待检测溶液中的质谱结果同肽段1、肽段2的质谱图，当质谱图中出现肽段1或肽段2的质谱图时，可判断待测样品为梅花鹿或马鹿。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待测样品的前处理具体过程为：样品粉碎，过筛，称取样品粉末10mg，加入5ml变性缓冲液，和1ml DTT溶液，摇匀，置80℃处理过夜，取出放冷至室温，离心，量取上清液500μL，加入100μL IAA溶液，避光反应30min，混匀，离心；对样品溶液脱盐后，量取上清液100μL，加入900μL碳酸氢铵溶液（1%）和5μL牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解4h，取出放冷至室温，离心，取上清液，即得。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述变性缓冲液具体制备过程为：称取573.1g 盐酸胍，121.1g 三羟甲基氨基甲烷，0.734g乙二胺四乙酸，加水溶解，加浓盐酸调pH至8.0，加水稀释至1L，摇匀，即得；所述DTT溶液的浓度为0.5M；所述IAA溶液的浓度为0.55M。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述牛胰蛋白酶溶液的具体制备过程为：液称取牛胰蛋白酶适量，用乙酸溶液溶解，制成浓度为10mg/ml的溶液，临用现配；所述乙酸溶液的浓度为2%。
8.根据权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于，所述液相-三重四级杆质谱法中，液相条件为：色谱柱为ACQUITY UPLC® BEH C18 (2.1×50mm，1.7μm)，柱温43℃，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱。
9.根据权利要求8所述的方法，所述梯度洗脱的条件为：0～9min,3%B→7.5%B；9～13min, 7.5%B→25%B；13～14min,25%B→90%B；14～17min, 90%B；17～17.5min, 10%B-97%B；17.5～21min,97%B，进样量为5μm。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述液相-三重四级杆质谱法中，质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化（ESI），正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46L/hr；辅助气流速850 L/hr；喷雾电压3.5KV；离子源温度150℃；辅助气温度400℃；锥孔电压30V，碰撞电压35V)；溶剂延迟（solvent delay）为0～8min和14～20min；选择m/z（三电荷）542.65→226.12、542.65→375.24作为检测离子对。
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