CN116143874A - 一种鉴别梅花鹿或马鹿源特征多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种鉴别梅花鹿或马鹿源特征多肽及其应用。本发明提供的特征多肽具体序列为：FFEHFGDLSTADAVmGNPK、VVTGVAnALAHR和VVAGVAnALAHR。本发明使用高效液相‑三重四级杆质谱联用的方法，可以很好的鉴别出鹿茸正品来源：马鹿以及梅花鹿并加以区分，高效且专属性好，也可应用于其他鹿科动物产品中。本发明通过大量的实验研究，得到了能够进行区别鉴定的特征多肽，专属性强，检测方法简单快捷，提高了梅花鹿、马鹿相关产品的质量控制水平，提高了临床用药的安全性和有效性。

Description

一种鉴别梅花鹿或马鹿源特征多肽及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种鉴别梅花鹿或马鹿源特征多肽及其应用。
背景技术
鹿科动物是中国一种重要的家养经济动物，鹿科动物产品作为珍贵的食品和药品具有非凡的经济效益。其中，鹿茸是最重要的动物药之一，在中医中的应用非常广泛，中医中对鹿茸的记载最早可以追溯到2000年前。鹿肉是高蛋白、低脂肪的优质肉类，营养价值很高，鹿血特别是茸血，能泡制鹿血酒或制成鹿血粉，有补虚和补血的功效。其他相关产品还有鹿胎、鹿鞭、鹿心等都具有很高的食用和药用价值。目前，仅通过外观难以辨认鹿科动物产品的来源，比如鹿茸以及鹿血，中医认为梅花鹿及马鹿最好。然而经常有商家挂羊头卖狗肉，以相对便宜的产品以次充好，甚至有使用非鹿科动物产品假冒正品欺骗消费者。因此，如何鉴别出梅花鹿或马鹿的正品来源成为了亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中存在的技术空白，本发明提供了一种能够鉴别出鹿茸正品来源并能够区分梅花鹿及马鹿的特征多肽。
本发明还提供了一种上述特征多肽在鉴别鹿茸正品来源及区分梅花鹿、马鹿中的应用，本发明使用高效液相-三重四级杆质谱联用的方法，可以很好的鉴别出鹿茸正品来源：马鹿以及梅花鹿并加以区分，高效且专属性好，也可应用于其他鹿科动物产品中。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种梅花鹿或马鹿源特征多肽，所述特征多肽具体序列为：
肽段1如SEQ ID NO.1所示：序列FFEHFGDLSTADAVmGNPK，m为M的氧化翻译后修饰；
肽段2如SEQ ID NO.2所示：序列VVTGVAnALAHR，n为N的脱酰胺翻译后修饰；
肽段3如SEQ ID NO.3所示：序列VVAGVAnALAHR，n为N的脱酰胺翻译后修饰。
进一步的，所述肽段1的检验离子对：定量离子m/z700.32（z=3）→880.36；定性离子m/z700.32（z=3）→244.20；所述肽段2的检验离子对：定量离子：m/z604.84（z=2）→567.34；定性离子m/z604.84（z=2）→682.40；所述肽段3的检验离子对：定量离子：m/z589.83（z=2）→567.34；定性离子m/z589.83（z=2）→682.40。
本发明还提供了一种上述梅花鹿或马鹿源特征多肽在鉴别鹿茸正品来源及区分马鹿或梅花鹿中的应用，当样品中检出与梅花鹿对照药材或马鹿对照药材相应的肽段1，则认为样品为梅花鹿或者马鹿来源；当样品中检出与马鹿对照药材相应的肽段1并且检出肽段2，则认为样品为马鹿来源；当样品中检出与梅花鹿对照药材相应的肽段1并且检出肽段3，则认为样品为梅花鹿来源。
进一步的，具体包括以下步骤：
（1）样品制备方法：样品粉碎，过筛，称取粉末50mg，加入10mL变性缓冲液，摇匀，置80℃处理过夜，取出放冷至室温，12000r离心10分钟，取500μL的样品提取液，使用分子量3kDa的超滤离心管对样品进行脱盐和酶解即得；
（2）采用高效液相-三重四级杆质谱联用进行鉴定。
本发明所使用的的变性缓冲液为6M盐酸胍，1M Tris，2.5mM乙二胺四乙酸，加浓盐酸调pH至8.0；所述脱盐和酶解具体步骤为：将样品提取液加入超滤离心管上层，12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL水，12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL水，12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL 1% NH4HCO3溶液和10μL 10mg/mL的牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15分钟，取出放冷至室温，离心，取上清液。
进一步的，步骤（2）中，所述液相的条件为：色谱柱为Agilent SB C18 (2.1×100mm，1.8μm)，柱温43℃，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱，进样量为5 μL。
上述梯度洗脱为：0~9min,3%B→7.5%B; 9~13min, 7.5%B→25%B; 13~14min,25%B→90%B; 14~17min, 90%B; 17~17.5min, 90%B →97%B,17.5~21min,97%B。
上述质谱的条件为：采用质谱检测器，电喷雾离子化（ESI），正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46L/hr；辅助气流速850 L/hr；喷雾电压3.5KV；离子源温度150℃；辅助气温度400℃。锥孔电压30V，碰撞电压35V)。溶剂延迟（solvent delay）为0～4min和16～20min。
本发明提供的特征多肽，在检测过程中，
判断依据为：肽段1为梅花鹿及马鹿专属，当质谱中检出肽段1检验离子对色谱峰，即认为样品为梅花鹿或者马鹿。肽段2在马鹿中存在但在梅花鹿中不存在，肽段3在梅花鹿中存在但在马鹿中不存在。
判定原则：样品中检出与梅花鹿对照药材或马鹿对照药材相应的肽段1，则认为样品为梅花鹿或者马鹿来源。样品中检出与马鹿对照药材相应的肽段1并且检出肽段2，则认为样品为马鹿来源。样品中检出与梅花鹿对照药材相应的肽段1并且检出肽段3，则认为样品为梅花鹿来源。
本发明的有益效果为：
（1）本发明使用高效液相-三重四级杆质谱联用的方法，可以很好的鉴别出鹿茸正品来源：马鹿以及梅花鹿并加以区分，高效且专属性好，也可应用于其他鹿科动物产品中。
（2）本发明通过大量的实验研究，得到了能够进行区别鉴定的特征多肽，专属性强，检测方法简单快捷，提高了梅花鹿、马鹿相关产品的质量控制水平，提高了临床用药的安全性和有效性。
附图说明
图1为肽段1的序列及离子归属。
图2为肽段2的序列及离子归属。
图3为肽段3的序列及离子归属。
图4为肽段1的专属性验证结果。
图5为肽段2的专属性验证结果。
图6为肽段3的专属性验证结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
实施例1 特征多肽的筛选
样品上清液通过纳升液相色谱-高分辨质谱分析后，将质谱数据导入PEAKS 8.5软件，使用 “ Adult-beta globin of deer”蛋白的数据库，进行全部肽段的从头测序及肽段匹配。共从头测序到33185条肽段，数据库匹配，共鉴定到333条肽段。使用高效液相-三重四级杆质谱联用仪验证鉴定到的333条肽段对与马鹿、梅花鹿、驼鹿、驯鹿、白唇鹿、白尾鹿及黇鹿的专属性，考察并选择响应强度最高的母离子与子离子作为定性离子与定量离子。
实施例2
（1）样品制备方法：马鹿茸、梅花鹿茸、驼鹿茸、驯鹿茸、黇鹿茸、白尾鹿茸、白唇鹿茸样品粉碎，过筛，称取粉末50mg，加入10mL变性缓冲液（6M盐酸胍，1M Tris，2.5mM乙二胺四乙酸，加浓盐酸调pH至8.0），摇匀，置80℃处理过夜，取出放冷至室温，12000r离心10分钟，取500μL，使用分子量3kDa的超滤离心管对样品进行脱盐和酶解（12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL水，12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL水，12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL 1% NH4HCO3溶液和10μL牛胰蛋白酶溶液（10mg/ml），37℃酶解15分钟，取出放冷至室温，离心，取上清液），即得。
（2）对照药材制备方法：同样品制备方法；
（3）液相条件：色谱柱为Agilent SB C18 (2.1×100mm，1.8μm)，柱温43℃，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱。（0~9min,3%B→7.5%B; 9~13min, 7.5%B→25%B; 13~14min,25%B→90%B; 14~17min, 90%B; 17~17.5min, 90%B→97%B,17.5~21min,97%B）进样量为5 μL。质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化（ESI），正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46L/hr；辅助气流速850 L/hr；喷雾电压3.5KV；离子源温度150℃；辅助气温度400℃。锥孔电压30V，碰撞电压35V)。溶剂延迟（solvent delay）为0～4min和16～20min。
检验肽段1：序列FFEHFGDLSTADAVmGNPK（m为M的氧化翻译后修饰），检验离子对：定量离子m/z700.32（z=3）→880.36；定性离子m/z700.32（z=3）→244.20;
肽段2：序列VVTGVAnALAHR（n为N的脱酰胺翻译后修饰），检验离子对：定量离子：m/z604.84（z=2）→567.34；定性离子m/z604.84（z=2）→682.40;
肽段3：序列VVAGVAnALAHR（n为N的脱酰胺翻译后修饰），检验离子对：定量离子：m/z589.83（z=2）→567.34；定性离子m/z589.83（z=2）→682.40;
具体鉴定结果如图4-6所示：样品中检出与梅花鹿对照药材或马鹿对照药材相应的肽段1，则认为样品为梅花鹿或者马鹿来源。样品中检出与马鹿对照药材相应的肽段1并且检出肽段2，则认为样品为马鹿来源。样品中检出与梅花鹿对照药材相应的肽段1并且检出肽段3，则认为样品为梅花鹿来源。
效果实施例耐用性实验：分别使用 Agilent ZORBAX SB RRHD, Agilent ZORBAXEclipse RRHD, Waters ACQUITY UPLC HSS色谱柱对马鹿茸、梅花鹿茸、驼鹿茸、驯鹿茸、黇鹿茸、白尾鹿茸、白唇鹿茸样品进行实验，发现马鹿、梅花鹿中均可检出专属肽段，而其他鹿种中无法检出，证明该方法耐用性良好。
Figure _1

Claims (8)

1.一种梅花鹿或马鹿源特征多肽，其特征在于，所述特征多肽具体序列为：
肽段1：序列FFEHFGDLSTADAVmGNPK，m为M的氧化翻译后修饰；
肽段2：序列VVTGVAnALAHR，n为N的脱酰胺翻译后修饰；
肽段3：序列VVAGVAnALAHR，n为N的脱酰胺翻译后修饰。
2.根据权利要求1所述的梅花鹿或马鹿源特征多肽，其特征在于，所述肽段1的检验离子对：定量离子m/z700.32（z=3）→880.36；定性离子m/z700.32（z=3）→244.20；所述肽段2的检验离子对：定量离子：m/z604.84（z=2）→567.34；定性离子m/z604.84（z=2）→682.40；所述肽段3的检验离子对：定量离子：m/z589.83（z=2）→567.34；定性离子m/z589.83（z=2）→682.40。
3.一种如权利要求1或2所述的梅花鹿或马鹿源特征多肽在鉴别鹿茸正品来源及区分马鹿或梅花鹿中的应用，其特征在于，当样品中检出与梅花鹿对照药材或马鹿对照药材相应的肽段1，则认为样品为梅花鹿或者马鹿来源；当样品中检出与马鹿对照药材相应的肽段1并且检出肽段2，则认为样品为马鹿来源；当样品中检出与梅花鹿对照药材相应的肽段1并且检出肽段3，则认为样品为梅花鹿来源。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）样品制备方法：样品粉碎，过筛，称取粉末50mg，加入10mL变性缓冲液，摇匀，置80℃处理过夜，取出放冷至室温，12000r离心10分钟，取500μL的样品提取液，使用分子量3kDa的超滤离心管对样品进行脱盐和酶解即得；
（2）采用高效液相-三重四级杆质谱联用进行鉴定。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，所述变性缓冲液为6M盐酸胍，1M Tris，2.5mM乙二胺四乙酸，加浓盐酸调pH至8.0；所述脱盐和酶解具体步骤为：将样品提取液加入超滤离心管上层，12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL水，12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL水，12000r离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL 1%NH4HCO3溶液和10μL 10mg/mL的牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15分钟，取出放冷至室温，离心，取上清液。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述液相的条件为：色谱柱为Agilent SB C18 (2.1×100mm，1.8μm)，柱温43℃，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱，进样量为5 μL。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述梯度洗脱为：0~9min,3%B→7.5%B; 9~13min, 7.5%B→25%B; 13~14min,25%B→90%B; 14~17min, 90%B; 17~17.5min, 90%B →97%B,17.5~21min,97%B。
8.根据权利要去5-7任一项所述的应用，其特征在于，所述质谱的条件为：采用质谱检测器，电喷雾离子化（ESI），正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46L/hr；辅助气流速850 L/hr；喷雾电压3.5KV；离子源温度150℃；辅助气温度400℃；锥孔电压30V，碰撞电压35V)；溶剂延迟（solvent delay）为0～4min和16～20min。
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CN117147881A (zh) * 2023-10-30 2023-12-01 山东省食品药品检验研究院 一种狍鹿角特征肽段及检测狍鹿角的方法和应用
CN117147881B (zh) * 2023-10-30 2024-01-02 山东省食品药品检验研究院 一种狍鹿角特征肽段及检测狍鹿角的方法和应用

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