CN111825744B - 一组用于鉴别阿胶及阿胶制品中牛源性成分的短肽 - Google Patents

一组用于鉴别阿胶及阿胶制品中牛源性成分的短肽 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一组用于鉴别阿胶及阿胶制品中牛源性成分的短肽，以及使用所述短肽通过质谱法鉴定阿胶及其制品中牛源性成分的方法，所述的短肽具有特定的序列结构及特定m/z值(包括特定的母离子和一对子离子)，其序列分别如SEQ ID NO.2‑6、11‑12、16‑17、21、23、25‑27、31、37、41、46、50所示，所述肽段及其m/z为牛源阿胶特有，在驴源阿胶中未见存在。

Description

一组用于鉴别阿胶及阿胶制品中牛源性成分的短肽
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一组用于鉴别阿胶及阿胶制品中牛源性成分的短肽。
本申请为分案申请，母案申请号为：CN201610158016.4，发明名称为：一组鉴别阿胶及其制品中牛源性成分的多肽。
背景技术
阿胶为马科动物驴的皮，经煎煮、浓缩制成的固体胶，原产自山东省东阿县，至今已有近三千年历史。阿胶是传统的滋补上品、补血圣药，味甘平，入肺、肝、肾经，具有补血止血、滋阴润燥等功效，药食两用，长期服用可补血养血、美白养颜、抗衰老、抗疲劳、提高免疫力，适用人群广泛。李时珍著《本草纲目》载：“阿胶《本经》上品。弘景曰：‘出东阿，故名阿胶’”。阿胶是中药材中典型的最讲究“地道性”的药材，道地阿胶必汲取东阿之水，得传承人之奇秘技艺炼制而成。道地阿胶表面平整，无油气孔，质硬而脆，断面光亮细腻，碎片对光照视呈棕色半透明状，李时珍赞其"黄透如琥珀色，光黑如瑿漆”。
早在1996年就曾曝光过假阿胶事件。时隔多年之后，阿胶造假不仅没有得到遏制，而且越演越烈。这些不法企业利用牛皮、马皮下脚料等劣质材料冒充驴皮制作伪劣阿胶，并以次充好向市场销售。
导致阿胶造假事件屡禁不止的一部分原因是缺少鉴定的技术支持，动物皮经过熬制溶解之后，破坏了本身的特性，很难鉴别出动物皮的来源。目前国家也没有有效鉴别阿胶成分的方法，只能靠从生产源头进行控制，以上情况导致了许多不法企业钻空子。
迫切需要一种高效准确鉴定阿胶及其制品真伪的方法。随着代谢组学技术的发展，利用肽组学直接鉴定动物源成分成为可能。
发明内容
本发明对阿胶和牛皮胶中的多肽进行了研究，建立了从多肽水平对阿胶及其制品中牛源性成分进行鉴别的技术，填补了国内外阿胶及其制品鉴别的空白。
本发明首先涉及一组用于单独或组合检测阿胶及其制品中牛源性成分的多肽，所述的阿胶制品包括但不限于阿胶糕、阿胶膏、阿胶浆、阿胶口服液、阿胶糖、阿胶补血颗粒，所述的多肽的序列为：
SEQ ID NO.1：GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR；
SEQ ID NO.2：GPPGPQGPR；
SEQ ID NO.3：PGEVGPPGPPGPAGEK；
SEQ ID NO.4：NGLPGGPGLR；
SEQ ID NO.5：DGASGHPGPIGPPGPR；
SEQ ID NO.6：GDGGPPGATGFPGAAGR；
SEQ ID NO.7：IGQPGAVGPAGIR；
SEQ ID NO.8：GVAGEPGRNGLPGGPGLR；
SEQ ID NO.9：GPPGPMGPPGLAGPPGESGR；
SEQ ID NO.10：GSTGEIGPAGPPGPPGLR。
SEQ ID NO.11：GDIGSPGR；
SEQ ID NO.12：GEAGSPGIAGPK；
SEQ ID NO.13：GEPGPAGAVGPAGAVGPR；
SEQ ID NO.14：GETGTAGDAGPIGPVGAR；
SEQ ID NO.15：GETGMAGAVGPAGAVGPR；
SEQ ID NO.16：GGPGPAGPR；
SEQ ID NO.17：IGQPGAVGPAGIR；
SEQ ID NO.18：GPPGPMGPPGLAGPPGESGR；
SEQ ID NO.19：TGQPGPSGISGPPGPPGPAGK；
SEQ ID NO.20：SGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR；
SEQ ID NO.21：GDGGPPGATGFPGAAGR；
SEQ ID NO.22：VGPPGPSGNAGPPGPPGPAGK；
SEQ ID NO.23：NGLPGGPGLR；
SEQ ID NO.24：GPPGPMGPPGLAGPPGESGR；
SEQ ID NO.25：GIPGPVGAAGATGAR；
SEQ ID NO.26：GEAGPAGPAGPAGPR；
SEQ ID NO.27：IGYAVGPAAVLDAAR；
SEQ ID NO.28：GIPGVSGSVGEPGPIGISGPPGAR；
SEQ ID NO.29：AGPVGAAGAPGPQGPVGPVGK；
SEQ ID NO.30：AGPPGPPGPAGK；
SEQ ID NO.31：GEPGPAGLPGPPGER；
SEQ ID NO.32：GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR；
SEQ ID NO.33：GETGHAGPAGPIGPVGAR；
SEQ ID NO.34：GPPGSAGAPGK；
SEQ ID NO.35：GLPGVAGSVGEPGPLGIAGPPGAR；
SEQ ID NO.36：GETGPAGPAGPIGPVGAR；
SEQ ID NO.37：SGETGASGPPGFVGEK；
SEQ ID NO.38：GPPGAQGPPGSPGPLGIAGLTGAR；
SEQ ID NO.39：GPPGAGGPPGPR；
SEQ ID NO.40：GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK；
SEQ ID NO.41：DGASGHPGPIGPPGPR；
SEQ ID NO.42：GAAGPPGPPGSAGTPGLQGMPGER；
SEQ ID NO.43：GPPGESGAAGPTGPIGSR；
SEQ ID NO.44：GPPGAGGPPGPR；
SEQ ID NO.45：GVAGEPGRNGLPGGPGLR；
SEQ ID NO.46：GESGAPGVPGIAGPR；
SEQ ID NO.47：GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR；
SEQ ID NO.48：GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK；
SEQ ID NO.49：PGEVGPPGPPGPAGEK；
SEQ ID NO.50：GSTGEIGPAGPPGPPGLR。
其m/z分别为：
肽段1：694.7；
肽段2：440.2；
肽段3：737.9；
肽段4：477.8；
肽段5：495.6；
肽段6：729.3；
肽段7：596.8；
肽段8：565.3；
肽段9：611.6；
肽段10：816.9；
肽段11：387.7；
肽段12：528.8；
肽段13：511.6；
肽段14：791.9；
肽段15：777.9；
肽段16：391.2；
肽段17：604.8；
肽段18：908.9；
肽段19：923.5；
肽段20：659.3；
肽段21：737.3；
肽段22：605.3；
肽段23：485.7；
肽段24：601.0；
肽段25：634.3；
肽段26：631.3；
肽段27：722.4；
肽段28：1066.1；
肽段29：879.0；
肽段30：517.8；
肽段31：718.3；
肽段32：705.4；
肽段33：791.9；
肽段34：464.3；
肽段35：711.0；
肽段36：780.9；
肽段37：746.9；
肽段38：700.0；
肽段39：516.8；
肽段40：1169.1；
肽段41：500.9；
肽段42：727.3；
肽段43：790.9；
肽段44：516.8；
肽段45：570.6；
肽段46：677.3；
肽段47：691.7；
肽段48：779.7；
肽段49：745.9；
肽段50：824.9。
50条多肽对应的母离子、子离子见下表1，
表1牛源性多肽序列及其对应的母离子、子离子
Figure BDA0002562160760000041
Figure BDA0002562160760000051
Figure BDA0002562160760000061
本发明所涉及前处理方法包括如下步骤：
(1)对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽滤液：
(2)通过质谱法检测待测样本的多肽成分，分析样本中的动物皮来源成分。
所述的质谱前处理步骤如下：
(1)将待测样品均质成粉末状态，称取0.1g～0.5g阿胶样品或1.0-2.0g阿胶制品，加入1％NH4HCO3溶液，超声处理10～30min使样品完全溶解，定容至50mL；
(2)溶液过0.22μm滤膜；
(3)取10～20μLTrypsin酶溶液(1μg/μL的Trypsin酶溶液)加入到100μL～200μL上述滤液中，37℃酶解16-18小时，待上机检测。
本发明还涉及两种检测阿胶及其制品的质谱方法，所述的质谱法检测为，
采用AB SCIEX
Figure BDA0002562160760000062
5600质谱检测，
流动相A：0.05～0.2％甲酸-乙腈溶液，流动相B：0.05～0.2％甲酸-水，
流速：0.1～0.5mL/min，
TOF扫描范围：100-3000Da，
正离子反应模式，GS1：35，GS2：45，Curtain Gas：35，ISVF：5500，TEM：500，DP：100，CE：10。
采用AB SCIEX三重四级杆质谱检测，
流动相A：0.05～0.2％甲酸-乙腈，流动相B：0.05～0.2％甲酸-水，
流速：0.1～0.5mL/min，
电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式：MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管温度：475℃；鞘气压力：40；辅助气压力：6。
所述的分析样本中的牛源性成分为，将待测样品的质谱结果对比SEQ ID NO.1～50的各条特异性多肽的质谱谱图，出现SEQ ID NO.1～50的各条特异性多肽的质谱检测谱图时，即可判断该组织样本存在牛源性成分。
附图说明
图1，GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR色谱图
图2，GPPGPQGPR色谱图
图3，PGEVGPPGPPGPAGEK色谱图
图4，NGLPGGPGLR色谱图
图5，DGASGHPGPIGPPGPR色谱图
图6，GDGGPPGATGFPGAAGR色谱图
图7，IGQPGAVGPAGIR色谱图
图8，GVAGEPGRNGLPGGPGLR色谱图
图9，GPPGPMGPPGLAGPPGESGR色谱图
图10，GSTGEIGPAGPPGPPGLR色谱图
图11，GDIGSPGR色谱图
图12，GEAGSPGIAGPK色谱图
图13，GEPGPAGAVGPAGAVGPR色谱图
图14，GETGTAGDAGPIGPVGAR色谱图
图15，GETGMAGAVGPAGAVGPR色谱图
图16，GGPGPAGPR色谱图
图17，IGQPGAVGPAGIR色谱图
图18，GPPGPMGPPGLAGPPGESGR色谱图
图19，TGQPGPSGISGPPGPPGPAGK色谱图
图20，SGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR色谱图
图21，GDGGPPGATGFPGAAGR色谱图
图22，VGPPGPSGNAGPPGPPGPAGK色谱图
图23，NGLPGGPGLR色谱图
图24，GPPGPMGPPGLAGPPGESGR色谱图
图25，GIPGPVGAAGATGAR色谱图
图26，GEAGPAGPAGPAGPR色谱图
图27，IGYAVGPAAVLDAAR色谱图
图28，GIPGVSGSVGEPGPIGISGPPGAR色谱图
图29，AGPVGAAGAPGPQGPVGPVGK色谱图
图30，AGPPGPPGPAGK色谱图
图31，GEPGPAGLPGPPGER色谱图
图32，GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR色谱图
图33，GETGHAGPAGPIGPVGAR色谱图
图34，GPPGSAGAPGK色谱图
图35，GLPGVAGSVGEPGPLGIAGPPGAR色谱图
图36，GETGPAGPAGPIGPVGAR色谱图
图37，SGETGASGPPGFVGEK色谱图
图38，GPPGAQGPPGSPGPLGIAGLTGAR色谱图
图39，GPPGAGGPPGPR色谱图
图40，GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK色谱图
图41，DGASGHPGPIGPPGPR色谱图
图42，GAAGPPGPPGSAGTPGLQGMPGER色谱图
图43，GPPGESGAAGPTGPIGSR色谱图
图44，GPPGAGGPPGPR色谱图
图45，GVAGEPGRNGLPGGPGLR色谱图
图46，GESGAPGVPGIAGPR色谱图
图47，GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR色谱图
图48，GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK色谱图
图49，PGEVGPPGPPGPAGEK色谱图
图50，GSTGEIGPAGPPGPPGLR色谱图
图51，在纯品驴阿胶胶原中检测SEQ ID NO.1～50所示多肽的色谱特征图
图52，样品1的检测结果图
图53，样品2的检测结果图
图54，驴阿胶对照品检测结果图
具体实施方式
实施例1，筛选牛阿胶胶原特异性多肽
通过质谱分析纯品牛胶原样本和驴胶原样本，利用ProteinPilot软件对质谱结果进行检索比对分析，从而确定最优选的牛胶原专属多肽序列。
首先，对选取的纯品胶原样本进行质谱分析，步骤包括：
(一)样本前处理步骤：
(1)称取0.1g～0.5g均质成粉末状态的纯品样品，加入1％NH4HCO3溶液，超声处理10～30min使样品完全溶解，定容至50mL；
(2)溶液过0.22μm滤膜；
(3)取10～20μLTrypsin酶溶液(1μg/μL的Trypsin酶溶液)加入到100μL～200μL上述滤液中，37℃酶解16-18小时，待上机检测。
(二)上机检测，
(1)采用AB SCIEX
Figure BDA0002562160760000081
5600质谱检测方法如下，
流动相A：0.05～0.2％甲酸-乙腈溶液，流动相B：0.05～0.2％甲酸-水，
流速：0.1～0.5mL/min，
TOF扫描范围：100-3000Da，
正离子反应模式，GS1：35，GS2：45，Curtain Gas：35，ISVF：5500，TEM：500，DP：100，CE：10。
(2)采用AB SCIEX三重四级杆质谱检测方法如下，
流动相A：0.05～0.2％甲酸-乙腈，流动相B：0.05～0.2％甲酸-水，
流速：0.1～0.5mL/min，
电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式：MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管温度：475℃；鞘气压力：40；辅助气压力：6。
其次，依据纯品胶原样本的质谱结果，利用ProteinPilot软件对质谱结果进行检索比对分析，筛选得到在牛胶原中确实存在的专属多肽组，组中的各条多肽序列信息如下：
SEQ ID NO.1：GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR；
SEQ ID NO.2：GPPGPQGPR；
SEQ ID NO.3：PGEVGPPGPPGPAGEK；
SEQ ID NO.4：NGLPGGPGLR；
SEQ ID NO.5：DGASGHPGPIGPPGPR；
SEQ ID NO.6：GDGGPPGATGFPGAAGR；
SEQ ID NO.7：IGQPGAVGPAGIR；
SEQ ID NO.8：GVAGEPGRNGLPGGPGLR；
SEQ ID NO.9：GPPGPMGPPGLAGPPGESGR；
SEQ ID NO.10：GSTGEIGPAGPPGPPGLR。
SEQ ID NO.11：GDIGSPGR；
SEQ ID NO.12：GEAGSPGIAGPK；
SEQ ID NO.13：GEPGPAGAVGPAGAVGPR；
SEQ ID NO.14：GETGTAGDAGPIGPVGAR；
SEQ ID NO.15：GETGMAGAVGPAGAVGPR；
SEQ ID NO.16：GGPGPAGPR；
SEQ ID NO.17：IGQPGAVGPAGIR；
SEQ ID NO.18：GPPGPMGPPGLAGPPGESGR；
SEQ ID NO.19：TGQPGPSGISGPPGPPGPAGK；
SEQ ID NO.20：SGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR；
SEQ ID NO.21：GDGGPPGATGFPGAAGR；
SEQ ID NO.22：VGPPGPSGNAGPPGPPGPAGK；
SEQ ID NO.23：NGLPGGPGLR；
SEQ ID NO.24：GPPGPMGPPGLAGPPGESGR；
SEQ ID NO.25：GIPGPVGAAGATGAR；
SEQ ID NO.26：GEAGPAGPAGPAGPR；
SEQ ID NO.27：IGYAVGPAAVLDAAR；
SEQ ID NO.28：GIPGVSGSVGEPGPIGISGPPGAR；
SEQ ID NO.29：AGPVGAAGAPGPQGPVGPVGK；
SEQ ID NO.30：AGPPGPPGPAGK；
SEQ ID NO.31：GEPGPAGLPGPPGER；
SEQ ID NO.32：GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR；
SEQ ID NO.33：GETGHAGPAGPIGPVGAR；
SEQ ID NO.34：GPPGSAGAPGK；
SEQ ID NO.35：GLPGVAGSVGEPGPLGIAGPPGAR；
SEQ ID NO.36：GETGPAGPAGPIGPVGAR；
SEQ ID NO.37：SGETGASGPPGFVGEK；
SEQ ID NO.38：GPPGAQGPPGSPGPLGIAGLTGAR；
SEQ ID NO.39：GPPGAGGPPGPR；
SEQ ID NO.40：GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK；
SEQ ID NO.41：DGASGHPGPIGPPGPR；
SEQ ID NO.42：GAAGPPGPPGSAGTPGLQGMPGER；
SEQ ID NO.43：GPPGESGAAGPTGPIGSR；
SEQ ID NO.44：GPPGAGGPPGPR；
SEQ ID NO.45：GVAGEPGRNGLPGGPGLR；
SEQ ID NO.46：GESGAPGVPGIAGPR；
SEQ ID NO.47：GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR；
SEQ ID NO.48：GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK；
SEQ ID NO.49：PGEVGPPGPPGPAGEK；
SEQ ID NO.50：GSTGEIGPAGPPGPPGLR。
上述50条多肽的质谱谱图和m/z的数值如下：
图1是多肽GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR在牛胶原中的色谱图，其m/z为694.7。
图2是多肽GPPGPQGPR在牛胶原中的色谱图，其m/z为440.2。
图3是多肽PGEVGPPGPPGPAGEK在牛胶原中的色谱图，其m/z为737.9。
图4是多肽NGLPGGPGLR在牛胶原中的色谱图，其m/z为477.8。
图5是多肽DGASGHPGPIGPPGPR在牛胶原中的色谱图，其m/z为495.6。
图6是多肽GDGGPPGATGFPGAAGR在牛胶原中的色谱图，其m/z为729.3。
图7是多肽IGQPGAVGPAGIR在牛胶原中的色谱图，其m/z为596.8。
图8是多肽GVAGEPGRNGLPGGPGLR在牛胶原中的色谱图，其m/z为565.3。
图9是多肽GPPGPMGPPGLAGPPGESGR在牛胶原中的色谱图，其m/z为611.6。
图10是多肽GSTGEIGPAGPPGPPGLR在牛胶原中的色谱图，其m/z为816.9。
图11是多肽GDIGSPGR在牛胶原中的色谱图，其m/z为387.7。
图12是多肽GEAGSPGIAGPK在牛胶原中的色谱图，其m/z为528.8。
图13是多肽GEPGPAGAVGPAGAVGPR在牛胶原中的色谱图，其m/z为511.6。
图14是多肽GETGTAGDAGPIGPVGAR在牛胶原中的色谱图，其m/z为791.9。
图15是多肽GETGMAGAVGPAGAVGPR在牛胶原中的色谱图，其m/z为777.9。
图16是多肽GGPGPAGPR在牛胶原中的色谱图，其m/z为391.2。
图17是多肽IGQPGAVGPAGIR在牛胶原中的色谱图，其m/z为604.8。
图18是多肽GPPGPMGPPGLAGPPGESGR在牛胶原中的色谱图，其m/z为908.9。
图19是多肽TGQPGPSGISGPPGPPGPAGK在牛胶原中的色谱图，其m/z为923.5。
图20是多肽SGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR在牛胶原中的色谱图，其m/z为659.3。
图21是多肽GDGGPPGATGFPGAAGR在牛胶原中的色谱图，其m/z为737.3。
图22是多肽VGPPGPSGNAGPPGPPGPAGK在牛胶原中的色谱图，其m/z为605.3。
图23是多肽NGLPGGPGLR在牛胶原中的色谱图，其m/z为485.7。
图24是多肽GPPGPMGPPGLAGPPGESGR在牛胶原中的色谱图，其m/z为601.0。
图25是多肽GIPGPVGAAGATGAR在牛胶原中的色谱图，其m/z为634.3。
图26是多肽GEAGPAGPAGPAGPR在牛胶原中的色谱图，其m/z为631.3。
图27是多肽IGYAVGPAAVLDAAR在牛胶原中的色谱图，其m/z为722.4。
图28是多肽GIPGVSGSVGEPGPIGISGPPGAR在牛胶原中的色谱图，其m/z为1066.1。
图29是多肽AGPVGAAGAPGPQGPVGPVGK在牛胶原中的色谱图，其m/z为879.0。
图30是多肽AGPPGPPGPAGK在牛胶原中的色谱图，其m/z为517.8。
图31是多肽GEPGPAGLPGPPGER在牛胶原中的色谱图，其m/z为718.3。
图32是多肽GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR在牛胶原中的色谱图，其m/z为705.4。
图33是多肽GETGHAGPAGPIGPVGAR在牛胶原中的色谱图，其m/z为791.9。
图34是多肽GPPGSAGAPGK在牛胶原中的色谱图，其m/z为464.3。
图35是多肽GLPGVAGSVGEPGPLGIAGPPGAR在牛胶原中的色谱图，其m/z为711.0。
图36是多肽GETGPAGPAGPIGPVGAR在牛胶原中的色谱图，其m/z为780.9。
图37是多肽SGETGASGPPGFVGEK在牛胶原中的色谱图，其m/z为746.9。
图38是多肽GPPGAQGPPGSPGPLGIAGLTGAR在牛胶原中的色谱图，其m/z为700.0。
图39是多肽GPPGAGGPPGPR在牛胶原中的色谱图，其m/z为516.8。
图40是多肽GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK在牛胶原中的色谱图，其m/z为1169.1。
图41是多肽DGASGHPGPIGPPGPR在牛胶原中的色谱图，其m/z为500.9。
图42是多肽GAAGPPGPPGSAGTPGLQGMPGER在牛胶原中的色谱图，其m/z为727.3。
图43是多肽GPPGESGAAGPTGPIGSR在牛胶原中的色谱图，其m/z为790.9。
图44是多肽GPPGAGGPPGPR在牛胶原中的色谱图，其m/z为516.8。
图45是多肽GVAGEPGRNGLPGGPGLR在牛胶原中的色谱图，其m/z为570.6。
图46是多肽GESGAPGVPGIAGPR在牛胶原中的色谱图，其m/z为677.3。
图47是多肽GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR在牛胶原中的色谱图，其m/z为691.7。
图48是多肽GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK在牛胶原中的色谱图，其m/z为779.7。
图49是多肽PGEVGPPGPPGPAGEK在牛胶原中的色谱图，其m/z为745.9。
图50是多肽GSTGEIGPAGPPGPPGLR在牛胶原中的色谱图，其m/z为824.9。
最后，用相同的方法处理并检测驴胶原样本，质谱检测结果进行匹配，结果显示，SEQ ID NO.1～50所示的各条多肽样本，在驴胶原中不存在。
图51是在驴胶原中检测上述多肽SEQ ID NO.1～50的色谱特征图，可见谱图中未检出SEQ ID NO.1～50所述的色谱峰。
实施例2，检测不特定阿胶样本，判断是否为牛胶原冒充产品
对某市公安局送检的动物皮熬制的阿胶及其制品样本及市售阿胶产品进行质谱分析，确定是否为纯品驴胶原阿胶。
对待测样品的处理和检测方法同实施例1中的处理和检测方法
步骤(一)样本前处理步骤：
(1)将待测样品均质成粉末状态，称取0.1的阿胶样品或称取2.0g阿胶制品，加入1％NH4HCO3溶液，超声处理10-30min使样品完全溶解，定容至50mL；
(2)溶液过0.22μm滤膜；
(3)取10μLTrypsin酶溶液(1μg/μL的Trypsin酶溶液)加入到100μL上述滤液中，37℃酶解16-18小时，待上机检测。
步骤(二)上机检测，
采用AB SCIEX
Figure BDA0002562160760000121
5600质谱检测，
流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水，
流速：0.25mL/min，
TOF扫描范围：350-1500Da，
正离子反应模式，GS1：35，GS2：45，Curtain Gas：35，ISVF：5500，TEM：500，DP：100，CE：10。
采用AB SCIEX三重四级杆质谱检测，
流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水，
流速：0.3mL/min，
电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式：MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管温度：475℃；鞘气压力：40；辅助气压力：6。
检测结果对比实施例1中的各条牛胶原特异性多肽的质谱谱图，出现实施例1所述质谱检测谱图时，即可判断该组织样本含有牛源性成分。
经检测：某市公安局送检的样品中，
样品1为仅检出牛源性成分，未检出驴源性成分：
选取实施例1中的两条牛胶原多肽和已知两条驴胶原特异性多肽作为参考，相同的检测条件下，样品1中仅检出选取的两条牛胶原多肽的色谱峰(见图52左上、右上)，未见驴胶原特异性多肽色谱峰(见图52左下、右下)；
样品2既检出驴源性成分也检出牛源性成分：
选取实施例1中的两条牛胶原多肽和已知两条驴胶原特异性多肽作为参考，相同的检测条件下，样品2中既检出选取的两条牛胶原多肽的色谱峰(见图53左上、右上)，也可见驴胶原特异性多肽色谱峰(见图53左下、右下)；
对照品东阿阿胶出产的桃花姬制品仅检出驴源性成分：
选取实施例1中的两条牛胶原多肽和已知两条驴胶原特异性多肽作为参考，相同的检测条件下，对照中未检出选取的两条牛胶原多肽的色谱峰(见图54左上、右上)，仅检出驴胶原特异性多肽色谱峰(见图54左下、右下)；
最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用作的本发明保护范围的限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛海关技术中心
<120> 一组用于鉴别阿胶及阿胶制品中牛源性成分的短肽
<160> 19
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<400> 2
Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Pro Arg
1 5
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<400> 3
Pro Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Lys
1 5 10 15
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<400> 4
Asn Gly Leu Pro Gly Gly Pro Gly Leu Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<400> 5
Asp Gly Ala Ser Gly His Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg
1 5 10 15
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<400> 6
Gly Asp Gly Gly Pro Pro Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<400> 11
Gly Asp Ile Gly Ser Pro Gly Arg
1 5
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<400> 12
Gly Glu Ala Gly Ser Pro Gly Ile Ala Gly Pro Lys
1 5 10
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<400> 16
Gly Gly Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg
1 5
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<400> 17
Ile Gly Gln Pro Gly Ala Val Gly Pro Ala Gly Ile Arg
1 5 10
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<400> 21
Gly Asp Gly Gly Pro Pro Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<400> 23
Asn Gly Leu Pro Gly Gly Pro Gly Leu Arg
1 5 10
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<400> 25
Gly Ile Pro Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Arg
1 5 10 15
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<400> 26
Gly Glu Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Arg
1 5 10 15
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<400> 27
Ile Gly Tyr Ala Val Gly Pro Ala Ala Val Leu Asp Ala Ala Arg
1 5 10 15
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<400> 31
Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Glu Arg
1 5 10 15
<210> 37
<211> 16
<212> PRT
<400> 37
Ser Gly Glu Thr Gly Ala Ser Gly Pro Pro Gly Phe Val Gly Glu Lys
1 5 10 15
<210> 41
<211> 16
<212> PRT
<400> 41
Asp Gly Ala Ser Gly His Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg
1 5 10 15
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<400> 46
Gly Glu Ser Gly Ala Pro Gly Val Pro Gly Ile Ala Gly Pro Arg
1 5 10 15
<210> 50
<211> 18
<212> PRT
<400> 50
Gly Ser Thr Gly Glu Ile Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Leu Arg

Claims (2)

1.一组多肽在检测阿胶及其制品中的牛源性成分中的应用，
所述的应用为，将所述多肽单独用于检测阿胶及其制品中的牛源性成分；
所述的阿胶制品是阿胶糕、阿胶膏、阿胶浆、阿胶口服液、阿胶糖、阿胶补血颗粒；
所述的多肽为序列结构小于18个氨基酸的短肽，所述的多肽的序列为：
肽段2：SEQ ID NO.2：GPPGPQGPR。
2.一种检测阿胶及其制品中是否含有牛源性成分的检测方法，所述方法包括如下步骤：
步骤(1)，对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽滤液：
步骤(2)，通过质谱法检测步骤(1)获得的多肽滤液，检测待测样本中是否含有权利要求1所述肽段的质谱峰；
步骤(1)所述的对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽滤液的步骤如下：
1)将待测样品均质成粉末状态，称取0.1g～0.5g阿胶样品或1.0～2.0g阿胶制品，加入1％NH4HCO3溶液，超声处理10～30min使样品完全溶解，定容至50mL；
2)溶液过0.22μm滤膜；
3)取10～20μLTrypsin酶溶液加入到上述100μL～200μL滤液中，37℃酶解16-18小时，待上机检测；
步骤(2)通过质谱法检验步骤(1)获得的多肽滤液的方法是下述方法A或方法B：
方法A：采用AB SCIEX
Figure FDA0003849159780000011
5600质谱检测多肽滤液中是否含有权利要求1所述的肽段的质谱峰，
上机参数为：
流动相A：0.05～0.2％甲酸-乙腈溶液，流动相B：0.05～0.2％甲酸-水，
流速：0.1～0.5mL/min，
TOF扫描范围：100-3000Da，
正离子反应模式，GS1：35，GS2：45，Curtain Gas：35，ISVF：5500，TEM：500，DP：100，CE：10；
方法B：采用AB SCIEX三重四级杆质谱检测多肽滤液中是否含有权利要求1所述肽段的质谱峰，
上机参数为：
流动相A：0.05～0.2％甲酸-乙腈，流动相B：0.05～0.2％甲酸-水，
流速：0.1～0.5mL/min，
电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式：MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管温度：475℃；鞘气压力：40；辅助气压力：6。
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