CN104807927B

CN104807927B - 一种富集唾液酸化糖肽的方法

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Publication number: CN104807927B
Application number: CN201410035250.9A
Authority: CN
Inventors: 李智立; 王晓东
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Priority date: 2014-01-24
Filing date: 2014-01-24
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2034-01-24
Also published as: CN104807927A

Abstract

本发明公开了一种富集唾液酸化糖肽、唾液酸化聚糖或唾液酸化糖苷的方法。本发明要求保护毛白杨杨絮在富集唾液酸化糖肽和/或唾液酸化聚糖和/或唾液酸化糖苷中的应用。本发明还保护一种富集唾液酸化糖肽的方法，包括如下步骤：（1）将毛白杨杨絮填充至柱容器内，得到Popcat柱；（2）采用所述Popcat柱从唾液酸化糖蛋白的酶切产物中富集唾液酸化糖肽。本发明提供的方法中条件温和、柱填料成本低廉、特异性高，富集效果显著。采用本发明提供的方法进行所述富集，可以保持唾液酸化糖链和或聚糖的结构信息，保留完整的特定肽段信息，有利于后续的质谱分析，反映了蛋白质天然的糖基化状态，对临床诊断标志物和疾病机制研究具有重要意义。

Description

一种富集唾液酸化糖肽的方法

技术领域

本发明涉及一种富集唾液酸化糖肽、唾液酸化聚糖或唾液酸化糖苷的方法。

背景技术

唾液酸是一类极其重要的神经氨酸衍生物，它通常连接在聚糖的末端，是聚糖结构和功能多样化的重要物质基础之一，广泛参与信号分子的靶向传递，如配体/受体、抗原/抗体、以及酶/底物的靶向识别与黏附，异常的唾液酸化聚糖会导致疾病的发生、发展。研究表明，异常生理状态（如脑部发育异常、癌症发生转移、病毒感染、心律失常等）与体内一些分子的唾液酸化聚糖水平异常密切相关。唾液酸化糖蛋白是目前研究较为普遍的一类生物分子，精确地表征此类分子中唾液酸化糖肽水平的变化对于发现预测疾病进展标志物以及对疾病的预后评估具有重要意义。但是，由于此类分子普遍具有高度的结构复杂性、低丰度、且不稳定的特点，使得对其进行精确的结构表征仍是一项尚未解决的技术难题。目前，对唾液酸化糖肽和/或唾液酸化聚糖和/或唾液酸化糖苷进行富集分离是进行其含有水平及其结构研究的关键一步。

凝集素亲和色谱法是目前应用于唾液酸化糖肽富集的主要方法。利用特定凝集素（如接骨木凝集素、怀槐凝集素等）可对带有特异性唾液酸化糖链的唾液酸化糖肽或蛋白进行富集分离。但是，每种凝集素只针对一种特定类型的唾液酸化糖链，且该方法所用材料价格昂贵，并不适用高通量的唾液酸化糖蛋白的结构研究。血清素耦合硅胶材料可被用于固相萃取从而对唾液酸化糖肽有一定的富集作用，但该方法伴随着对非唾液酸化糖肽和/或非唾液酸化聚糖的富集。强阳离子色谱及两性离子型亲水相互作用液相色谱被证明可被广泛用于多种唾液酸化糖肽和/或唾液酸化聚糖的富集分离，但其繁琐的操作过程会造成唾液酸化糖肽和/或唾液酸化聚糖的水解，且引入了大量无机盐离子，增加了后续糖链分析的难度，此外该方法的特异性差。

发明内容

本发明的目的是提供一种富集唾液酸化糖肽、唾液酸化聚糖或唾液酸化糖苷的方法。

本发明要求保护毛白杨杨絮在富集唾液酸化糖肽和/或唾液酸化聚糖和/或唾液酸化糖苷中的应用。

本发明还要求保护毛白杨杨絮在制备用于富集唾液酸化糖肽和/或唾液酸化聚糖和/或唾液酸化糖苷的柱填料中的应用。

本发明还要求保护毛白杨杨絮作为富集唾液酸化糖肽和/或唾液酸化聚糖和/或唾液酸化糖苷的柱填料的应用。

本发明还保护一种富集唾液酸化糖肽的方法，包括如下步骤：

（1）将毛白杨杨絮填充至柱容器内，得到Popcat柱；

（2）采用所述Popcat柱从唾液酸化糖蛋白的酶切产物中富集唾液酸化糖肽。

所述酶切产物是将唾液酸化糖蛋白进行单酶切或双酶切得到的产物。所述酶切产物优选为将唾液酸化糖蛋白进行单酶切得到的产物。所述单酶切具体可为胰酶酶切，所述双酶切具体可为胰酶和蛋白酶K酶切。

在进行所述方法前，可按如下方法预处理毛白杨杨絮：洗涤并烘干。所述洗涤的具体方法为：用40%-70%（优选50%）乙腈水溶液超声洗涤（超声参数具体可为20KHz，10-20s）。

所述步骤（1）和所述步骤（2）之间还可包括如下步骤甲：用70%-90%（优选80%）乙腈水溶液洗涤所述Popcat柱。

所述步骤（1）和所述步骤（2）之间，所述步骤甲之后，还可包括如下步骤乙：依次用去离子水、乙腈和80%乙腈水溶液洗涤所述Popcat柱。

所述步骤（2）具体如下：①将所述唾液酸化糖蛋白的酶切产物上样；②完成步骤①后，依次用水和5mM碳酸氢铵水溶液洗脱并收集流出液，即为富含唾液酸化糖肽的溶液。

所述步骤①和所述步骤②之间还可包括如下步骤丙：用70%-90%（优选80%）乙腈水溶液洗涤。

所述柱容器具体可为最大上样体积为200μL的Tip。

当采用最大上样体积为200μL的Tip作为柱容器时，毛白杨杨絮的填充量可为3mg，步骤乙中可依次用50μL去离子水、50μL乙腈和50μL80%乙腈水溶液洗涤所述Popcat柱，步骤丙中可依次用80μL80%乙腈水溶液和80μL80%乙腈水溶液洗涤，步骤②中，可依次用30μL去离子水和50μL5mM碳酸氢铵水溶液洗脱并将流出液合并，即为富含唾液酸化糖肽的溶液。

本发明还保护一种用于富集唾液酸化糖肽的试剂盒，包括毛白杨杨絮和5mM碳酸氢铵水溶液。所述试剂盒还可包括胰酶和/或蛋白酶K。所述试剂盒还可包括70%-90%（优选80%）乙腈水溶液。所述试剂盒还可包括40%-70%（优选50%）乙腈水溶液。所述试剂盒还可包括柱容器，如Tip。

所述毛白杨杨絮的直径范围为6-8μm。

所述唾液酸化糖蛋白具体可为牛胎球蛋白。

本发明发现毛白杨杨絮对唾液酸化糖肽和/或唾液酸化聚糖和/或唾液酸化糖苷具有很好的富集效果，富集产物纯度接近100%，回收率100%。本发明提供的方法中，采用温和的洗脱液洗脱目标物，与其它洗脱液（25%NH₃·H₂O水溶液或0.2%甲酸水溶液）相比，以及与其他富集方法（二氧化钛富集，石墨碳/活性炭富集）相比，本发明提供的方法中条件温和（降低了唾液酸化糖肽结构中唾液酸的解离风险）、柱填料成本低廉、特异性高，富集效果显著。采用本发明提供的方法进行所述富集，可以保持唾液酸化糖链和或聚糖的结构信息，保留完整的特定肽段信息，有利于后续的质谱分析，反映了蛋白质天然的糖基化状态，对临床诊断标志物和疾病机制研究具有重要意义。

附图说明

图1为实施例1中的质谱图谱，其中质/荷是指分子质量与电荷数之比。

图2为代表性唾液酸化糖肽的串联质谱图，其中质/荷是指分子质量与电荷数之比。

图3为杨絮与脱脂棉在表面扫描电子显微镜下的形态的对比图。

图4为杨絮与脱脂棉表面成分傅立叶变换红外吸收光谱的对比图。

图5为杨絮与脱脂棉疏水性考察及/Wiesner组织学染色对比；“+”代表阳性结果，“-”代表阴性结果。

图6为二氧杂环乙烷分步萃取法萃取提纯杨絮木质素、半纤维素、及纤维素成分的实验流程。

图7为傅里叶变换红外吸收光谱对比图；A:萃取木质素与杨絮表面成分傅里叶变换红外吸收光谱对比图；B；分步萃取半纤维素傅立叶变换红外吸收光谱对比图；C：萃取纤维素与脱脂棉表面成分傅立叶变换红外吸收光谱对比图。

图8为杨絮结构成分示意图。

图9为杨絮唾液酸化糖肽特异性富集有效成分的考察；a：去木质素杨絮的/Wiesner组织学染色对比；b：杨絮去木质素处理不同时间后对唾液酸化糖肽特异性富集效能；菱形表示两质谱峰之间相差一个唾液酸化残基（291Da）；其中质/荷是指分子质量与电荷数之比。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的试验结果，均设置三次重复实验，结果取平均值。唾液酸化糖肽即唾液酸化糖蛋白酶切后得到的具有唾液酸化糖链的多肽片段。以下实施例中的“%”，如无特殊说明，均代表体积百分含量。

本发明的发明人在长期试验过程中，发现以毛白杨杨絮（简称杨絮）作为分离固定相制备的Popcat-tip层析柱可以高效、特异、温和地分离富集唾液酸化糖肽。

牛胎球蛋白(高唾液酸化糖蛋白质)：购自Sigma-Aldrich公司，产品目录号：F3004。移液器吸头（Tip）（最大上样体积为200μL）：购自Axygen Scientific公司，产品目录号：T-200-Y。碳酸氢铵、二硫苏糖醇、碘乙酰胺、乙腈、甲酸、三氟乙酸均购自Sigma-Aldrich公司，产品目录号依次为A6141、150460、I6125、14261、14265、302031。石墨碳（粒度范围为5-8μm）、活性碳（粒度范围为3-5μm）均购自Sigma-Aldrich公司，产品目录号依次为332461和C2889。胰酶：购自Roche公司，产品目录号：11418025001。蛋白酶K：购自Promega公司，产品目录号：V302B224258。

实施例1、应用毛白杨杨絮富集唾液酸化糖肽

一、样本溶液的制备

1、样本溶液甲的制备

称取20μg牛胎球蛋白，溶于100μL含25mM碳酸氢铵和50mM二硫苏糖醇的水溶液中，56℃孵育45分钟（还原反应，目的是打开二硫键），然后加入100μL含200mM碘乙酰胺和25mM碳酸氢铵的水溶液，充分混匀后，25℃（室温即可）避光反应45分钟（封闭还原反应中打开的二硫键），然后加入10μL10mM二硫苏糖醇水溶液以终止反应，然后加入0.4μg胰酶并37℃酶切12小时，然后将体系冷冻干燥，然后将干物质溶于30μL80%乙腈水溶液，得到样本溶液甲。

2、样本溶液乙的制备

取15μL样本溶液甲，加入90μL25mM碳酸氢铵水溶液，然后加入0.1μg蛋白酶K并37℃酶切15小时，然后将体系冷冻干燥，然后将干物质溶于15μL80%乙腈水溶液，得到样本溶液乙。

二、从样本溶液中富集唾液酸化糖肽

1、取毛白杨杨絮，用50%（实际应用中40%-70%均可）乙腈水溶液超声洗涤（超声参数：20KHz，10-20s），烘干（即质量不再变化）。

2、取3mg步骤1得到的杨絮，填充至Tip内，使其填充高度约为3mm，得到Popcat-tip柱，用80%（实际应用中70%-90%均可）乙腈水溶液充分洗涤。

3、完成步骤2后，取Popcat-tip柱，依次加入50μL去离子水（200g离心5min，弃除流出液）、50μL100%乙腈（200g离心5min，弃除流出液）和50μL80%乙腈水溶液（200g离心5min，弃除流出液）。

4、吸取5μL样本溶液（样本溶液甲或样本溶液乙），用80%乙腈水溶液稀释至30μL，加入完成步骤3的Popcat-tip柱中，100g离心5min，收集流出液（即流出液A）；将流出液A再次加入该柱子中，100g离心5min，收集流出液（即流出液B）；将流出液B再次加入该柱子中，100g离心5min，收集流出液（即流出液C）；将流出液C再次加入该柱子中，100g离心5min，收集流出液（即流出液D）。

5、完成步骤4后，取Popcat-tip柱，加入80μL80%（实际应用中70%-90%均可）乙腈水溶液（100g离心10min，弃流出液），然后再次加入80μL80%（实际应用中70%-90%均可）乙腈水溶液（100g离心10min，弃流出液）。

6、完成步骤5后，取Popcat-tip柱，加入30μL去离子水（100g离心5min，收集流出液，即流出液E），然后加入50μL5mM碳酸氢铵水溶液（100g离心5min，收集流出液，即流出液F），将流出液E和流出液F合并，即为富含唾液酸化糖肽的溶液（简称产物溶液，样本溶液甲得到产物溶液甲，样本溶液乙得到产物溶液乙）。

7、完成步骤6后，取Popcat-tip柱，加入50μL0.1%甲酸水溶液，100g离心5min，收集流出液，即流出液G。

三、对比试验

步骤1至5同步骤二的1至5。

6、完成步骤5后，取Popcat-tip柱，加入80μL25%NH₃·H₂O水溶液，然后100g离心5min，收集流出液，即对照溶液（样本溶液甲得到对照溶液甲-Ⅰ，样本溶液乙得到对照溶液乙-Ⅰ）。

四、对照试验

步骤1至5同步骤二的1至5。

6、完成步骤5后，取Popcat-tip柱，加入80μL0.2%甲酸水溶液，然后100g离心5min，收集流出液，即对照溶液（样本溶液甲得到对照溶液甲-Ⅱ，样本溶液乙得到对照溶液乙-Ⅱ）。

五、对照试验（二氧化钛富集）

1、装柱：将二氧化钛重悬于100%乙腈中，填充至Tip内，使其填充高度约为3mm，即为二氧化钛Tip柱，用80%乙腈水溶液冲洗备用。

2、平衡（重复3次）：加入30μL含80%乙腈和2%三氟乙酸的水溶液，然后30g离心10min。

3、上样：吸取5μL样本溶液（样本溶液甲或样本溶液乙），用含80%乙腈、2%三氟乙酸和100mg/mL2,5-二羟基苯甲酸的水溶液稀释至30μL，然后上样（60g离心20min，弃流出液）。

4、冲洗（重复2次）：加入40μL含80%乙腈和2%三氟乙酸的水溶液（100g离心10min，弃流出液），然后加入10μL去离子水（100g离心5min，弃流出液）。

5、加入40μL25%NH₃·H₂O水溶液，然后80g离心15min，收集流出液。

6、加入40μL25%NH₃·H₂O水溶液，然后80g离心15min，收集流出液。

7、将步骤5得到的流出液和步骤6得到的流出液合并，即为对照溶液（样本溶液甲得到对照溶液甲-Ⅲ，样本溶液乙得到对照溶液乙-Ⅲ）。

六、对照试验（石墨碳/活性炭富集）

1、装柱：将石墨碳与活性碳等质量混合，然后填充至Tip内，使其填充高度约为6mm，即为石墨碳/活性炭Tip柱，用80%乙腈水溶液冲洗备用。

2、平衡（重复3次）：加入30μL0.2%甲酸水溶液，然后30g离心10min。

3、上样：取5μL样本溶液（样本溶液甲或样本溶液乙），用0.2%甲酸水溶液稀释至30μL，然后上样（30g离心10min，弃流出液）。

4、冲洗（重复2次）：加入20μL去离子水，然后30g离心10min。

5、完成步骤4后，加入30μL含0.2%甲酸和30%乙腈的水溶液，然后30g离心10min，收集流出液。

6、完成步骤5后，加入30μL含0.2%甲酸和30%乙腈的水溶液，然后30g离心10min，收集流出液。

7、完成步骤6后，加入20μL含0.2%甲酸和30%乙腈的水溶液，然后30g离心8min，收集流出液。

8、将步骤5得到的流出液、步骤6得到的流出液和步骤7得到的流出液合并，即为对照溶液（样本溶液甲得到对照溶液甲-Ⅳ，样本溶液乙得到对照溶液乙-Ⅳ）。

七、富集效果比较

将样本溶液甲、样本溶液乙、样本溶液甲进行步骤二得到的穿透液D、样本溶液乙进行步骤二得到的穿透液D、产物溶液甲、产物溶液乙、样本溶液甲进行步骤二得到的流出液G、样本溶液乙进行步骤二得到的流出液G、对照溶液甲-Ⅰ、对照溶液甲 -Ⅱ、对照溶液甲-Ⅲ、对照溶液甲-Ⅳ、对照溶液乙-Ⅰ、对照溶液乙-Ⅱ、对照溶液乙-Ⅲ和对照溶液乙-Ⅳ分别冷冻干燥，然后进行质谱分析。

质谱图谱见图1（菱形表示两质谱峰之间相差一个唾液酸化残基，291Da），aⅠ为样本溶液乙，bⅠ为样本溶液甲，aⅡ为样本溶液乙进行步骤二得到的穿透液D，bⅡ为样本溶液甲进行步骤二得到的穿透液D，aⅢ为产物溶液乙，bⅢ为产物溶液甲，aⅣ为对照溶液乙-Ⅰ，bⅣ为对照溶液甲-Ⅰ，aⅤ为对照溶液乙-Ⅱ，bⅤ为对照溶液甲-Ⅱ，aⅥ为样本溶液乙进行步骤二得到的流出液G，bⅥ为样本溶液甲进行步骤二得到的流出液G，aⅦ为对照溶液乙-Ⅲ，bⅦ为对照溶液甲-Ⅲ，aⅧ为对照溶液乙-Ⅳ，bⅧ为对照溶液甲-Ⅳ。

对比Popcat-tip柱富集前（图1a I和图1b I）、穿透液D（图1a II和图1b II）、以及Popcat-tip柱富集后（图1a III和图1b III）的质谱图可以发现：图1a III和1b III中有大量的质荷比（m/z）之差与单唾液酸残基质量数一致（291Da）的糖肽信号峰，且唾液酸化糖肽成簇出现，表明糖蛋白的唾液酸化具有与普通糖基化相似的微观不均一特性，且表象更加复杂；此外，对比图1a I和图1b I，图1a II和图1b II，图1a III和图1b III，可以发现除唾液酸化糖肽外，非唾液酸化糖肽及非糖基化肽段在Popcat-tip柱上不保留，表明Popcat-tip柱对含唾液酸化糖肽具有高度特异性。

对比利用不同洗脱溶液洗脱Popcat-tip柱上的唾液酸化糖肽的质谱图（图1a和图1b的III、IV和V）可以发现：强酸、强碱洗脱液容易引起唾液酸化糖肽的解离，高唾液酸化糖肽明显减少，大量唾液酸化糖肽信号移向低分子量区，导致低唾液酸化糖肽信号明显增强；温和洗脱溶液充分利用Popcat-tip柱结合唾液酸化糖肽后易被温和极性溶液所洗脱的特性，避免了高唾液酸化糖肽的解离，有利于获得糖蛋白质天然的糖基化状态，这对临床诊断及标志物的发现具有重要意义。

通过对流出液G进行质谱分析发现（如图1a VI和图1b VI所示），基本没有糖肽信号被检测（m/z2000-7000），表明经Popcat-tip柱富集的唾液酸化糖肽可被温和洗脱溶液完全洗脱，回收率接近100%。

对比二氧化钛富集或石墨碳/活性炭富集对唾液酸化糖肽的富集效果可以发现：如图1a III/VII/VIII和图1bIII/VII/VIII所示，Popcat-tip柱结合温和洗脱策略对于唾液酸化糖肽的富集效果显著优于这两种常规方法，不仅可以检测到N（天冬氨酸残基）连接的唾液酸化糖肽（主要分布区域位于m/z=3000-7000），而且也可以检测得到O连接的唾液酸化糖肽（主要分布区域位于m/z<3000），表明Popcat-tip 柱可以用于唾液酸化糖肽的全面表征（图2为图1中的分子量为4196.98Da的N连接的唾液酸化糖肽串联质谱图(图2a)和分子量为2120.05Da的O连接的唾液酸化糖肽的串联质谱图(图2b)，根据该图可以确定相差一个和/或多个菱形(291Da)代表的物质确实为唾液酸化糖肽）；在二氧化钛或石墨碳/活性炭混合富集法质谱图中可以明显观察到牛胎球蛋白非糖基化肽段信号，如m/z2349及m/z2462信号峰，其对应肽段分别为E₂₉PACDDPDTEQAALAAVDYINK₅₀和A₁₈₈QFVPLPVSVSVEFAVAATDCIAK₂₁₁。

通过对双酶切与单酶切肽段混合溶液中唾液酸化肽段的富集效果对比可以发现（如图1a和1b），对单酶切肽段混合溶液直接进行Popcat-tip富集分离可以大大减低质谱分析复杂性（可检测了唾液酸化肽段信号m/z范围更宽），降低高唾液酸化糖肽唾液酸解离的风险。

实施例2、杨絮的结构表征及其用于富集唾液酸化糖肽的有效成分考察

本实施例中对Popcat-tip的填充介质-杨絮进行结构表征，并进一步分析杨絮中富集唾液酸化糖肽的有效成分。

杨絮和脱脂棉的扫描电镜分析结果如图3所示。杨絮的直径范围为6-8μm，明显小于脱脂棉的直径范围（20-25μm），表明单位体积内杨絮具有相对较大的比表面积，从而增加了与被分析物的单位接触面积，有利于杨絮与靶标识别并结合。此外，杨絮表面相对光滑而脱脂棉表面相对粗糙，可以推测杨絮表面成分不同于脱脂棉表面的纤维素单一成分（脱脂棉纤维素含量接近100%）。

杨絮与脱脂棉表面结构的红外吸收对比谱见图4。杨絮表面成分红外吸收光谱与棉花表面纤维素的红外吸收谱存在明显差异，表明杨絮表面成分可能并不是纤维素单一组分，初步验证了上述扫描电镜的实验结果。

为了进一步分析杨絮的结构及其中用于富集唾液酸化糖肽的有效成分，开展亲/疏水性考察及/Wiesner组织学染色实验。结果如图5所示。将杨絮置于水中后明显蜷缩成球状，表面出现并附着有大量水泡，表现出极强的疏水性；染色后呈现深红色，Wiesner染色后呈现紫红色，表明杨絮表面含有木质素成分；另外根据两种不同染色方法所呈现的不同颜色可以得出，杨絮表面的木质素可进一步分为紫丁香基木质素与愈创木基木质素，这与毛白杨属于双子叶植物纲这一属性一致。脱脂棉在水溶液中表现出极强的亲水性，且两种染色实验均呈阴性结果，表明脱脂棉表面并不含木质素，这与棉花100%纤维素成分一致。

为了进一步证实杨絮表面成分及内部结构，采用二氧杂环乙烷分步萃取法结合傅立叶变换红外检测法来验证。二氧杂环乙烷分步萃取法实验步骤如图6所示，该方法可以分别获得木质素、半纤维素以及纤维素，结合傅立叶变换红外光谱法检测即可得到相应成分的红外吸收光谱（图7）。对比杨絮、脱脂棉花表面成分红外图谱（图7A、7C），可以证实杨絮表面主要成分为木质素，内部成分为纤维素，由内至外成分组成分别为纤维素—半纤维素—木质素（图8）。由此可以推测，杨絮对唾液酸化糖肽特异性高效分离富集的有效成分为木质素。

为了验证上述推测，随后进行去木质素及唾液酸化糖肽富集实验（去木质素方法见图6，唾液酸化糖肽富集实验中用去木质素化的毛白杨杨絮代替毛白杨杨絮，其它同实施例1的步骤二），结果如图9所示。杨絮去木质素后经及Wiesner染色发现所呈现颜色明显变淡；木质素分离上清液用盐酸调制pH2.0后可明显观察到有白色物质（即木质素）沉淀析出（见图9a，最右侧Eppendorf离心管），表明杨絮表面木质素可以被有效分离。杨絮经去木质素处理不同时间（0min、5min、15min、30min）后装柱，并对触珠蛋白胰酶酶切肽段混合溶液进行唾液酸化糖肽分离富集，富集溶液经冷冻干燥浓缩后进行质谱检测，如图9b所示，杨絮对唾液酸化糖肽的富集效果随着去木质素时间的增加而降低；去木质素处理30min后，杨絮基本失去对唾液酸化糖肽的富集能力，实验结果直接证明木质素是杨絮高效分离富集唾液酸化糖肽的主要有效成分。

Claims

1.毛白杨杨絮在富集唾液酸化糖肽中的应用。

2.毛白杨杨絮在制备用于富集唾液酸化糖肽的柱填料中的应用。

3.毛白杨杨絮作为富集唾液酸化糖肽的柱填料的应用。

4.一种富集唾液酸化糖肽的方法，包括如下步骤：

(1)将毛白杨杨絮填充至柱容器内，得到Popcat柱；

(2)采用所述Popcat柱从唾液酸化糖蛋白的酶切产物中富集唾液酸化糖肽。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述酶切产物是将唾液酸化糖蛋白进行单酶切或双酶切得到的产物。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述单酶切为胰酶酶切；所述双酶切为胰酶和蛋白酶K酶切。

7.如权利要求4至6中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)和所述步骤(2)之间还包括如下步骤甲：用70％-90％乙腈水溶液洗涤所述Popcat柱。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)和所述步骤(2)之间，所述步骤甲之后，还包括如下步骤乙：依次用去离子水、乙腈和80％乙腈水溶液洗涤所述Popcat柱。

9.如权利要求4至6中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)如下：①将所述唾液酸化糖蛋白的酶切产物上样；②完成步骤①后，依次用水和5mM碳酸氢铵水溶液洗脱并收集流出液，即为富含唾液酸化糖肽的溶液。

10.一种用于富集唾液酸化糖肽的试剂盒，包括毛白杨杨絮和5mM碳酸氢铵水溶液。