CN106568875B - 一种富集唾液酸化糖肽的材料及其应用 - Google Patents
一种富集唾液酸化糖肽的材料及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种唾液酸化糖肽富集分离材料及其应用。该唾液酸化糖肽富集材料,为木棉纤维。本发明要求保护木棉纤维在富集唾液酸化糖肽中的应用。本发明还要求保护一种富集分离唾液酸化糖肽的方法,包括如下步骤:(1)将木棉纤维填充至柱容器内,得到Kapfib‑tip柱;(2)采用所述Kapfib‑tip柱从唾液酸化糖蛋白的酶解产物中富集分离唾液酸化糖肽。本发明提供的方法环境友好、柱填料成本低廉、条件温和、特异性高。本发明的方法,可有效防止唾液酸的脱落,从而最大程度上保持唾液酸化糖链和或聚糖的结构信息,能真实反映蛋白质天然的糖基化状态,对于寻找临床诊断标志物和研究发病机制具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种富集分离唾液酸化糖肽的材料及其应用。
背景技术
唾液酸是一类九碳多糖,通常位于糖链的末端。由于唾液酸有强的负电性,它有助于大脑突触的可塑性,唾液酸的负电荷使红细胞与其他细胞相互排斥。它也是许多病原体和毒素的结合位点。唾液酸可以作为内源性受体的配体,参与细胞识别和粘附。在病理状态下,体内唾液酸的表达变化与疾病发生密切相关,如自身免疫疾病、心血管疾病、肿瘤发生进展、细菌病毒感染、神经性疾病以及内分泌异常。唾液酸化是一类重要的蛋白翻译后修饰。唾液酸化蛋白可作为疾病标志物。但是,由于它在体内丰度低且不稳定,对其进行定性、定量分析是蛋白糖基化分析面临的挑战。
已有多种富集唾液酸化糖肽的方法,如凝集素法、血清素法、肼酰法、亲水性色谱法以及离子交换色谱法。凝集素亲和色谱法是目前应用于唾液酸化糖蛋白富集的主要方法。凝集素可以富集特定的唾液酸化糖蛋白,但价格昂贵,结合力弱,不适合高通量分析。血清素富集结合力弱,特异性差。肼酰法可以富集唾液酸化糖肽,但其操作复杂,且要与聚糖发生共价化学反应,破坏了聚糖的结构。亲水性色谱法以及离子交换色谱法特异性差,容易造成唾液酸信息丢失。
发明内容
本发明的目的是提供一种经济、高效、环保的唾液酸化糖肽富集分离材料。
本发明还要求保护的糖肽富集分离材料,为木棉纤维。
本发明还要求保护以木棉纤维为填料的层析柱。
本发明还要求保护木棉纤维作为富集分离唾液酸化糖肽的柱填料的应用。
本发明还保护一种唾液酸化糖肽富集分离方法,包括如下步骤:
(1)将木棉纤维填充至柱容器内,得到kapfib-tip柱;
(2)采用所述kapfib-tip柱从唾液酸化糖蛋白的酶切产物中富集唾液酸化糖肽。
所述酶切产物是将唾液酸化糖蛋白进行双酶切得到的产物。所述双酶切具体为胰蛋白酶酶切和碱性磷酸酶酶切。
在进行所述方法前,可按如下方法预处理木棉纤维:洗涤。所述洗涤的具体方法为:分别用超纯水、100%乙腈和80%乙腈水溶液超声洗涤(超声参数具体可为20KHz,2min)。木棉纤维保存在超纯水里。
所述步骤(1)和所述步骤(2)之间,还包括如下步骤:依次用超纯水、100%乙腈和80%乙腈水溶液洗涤所述Kapfib-tip柱。
所述步骤(2)具体如下:①将所述唾液酸化糖蛋白的酶切产物用20μL 80%乙腈水溶液重溶,上样;②用0.25%氨水溶液洗脱并收集流出液,即为富含唾液酸化糖肽的溶液。
所述柱容器具体可为上样体积为200μL的Tip。
当采用最大上样体积为200μL的Tip作为柱容器时,木棉纤维的填充量可为10mg,可依次用50μL超纯水、50μL 100%乙腈和50μL 80%乙腈水溶液洗涤所述Kapfib-tip柱,加酶切产物后,用30μL 0.25%氨水溶液洗脱,所获洗脱液即为富含唾液酸化糖肽的溶液。
所述唾液酸化糖蛋白具体可为牛胎球蛋白、转铁蛋白、以及牛胎球蛋白、转铁蛋白及白蛋白的混合物。
本发明发现木棉纤维对唾液酸化糖肽具有很好的富集效果,富集产物纯度大于95%,回收率大于95%。本发明提供的方法中,采用温和的洗脱液洗脱目标物,与其它洗脱液(0.1%三氟乙酸、0.2%甲酸、超纯水、5mM碳酸氢铵)相比,以及与其他富集方法(石墨碳/活性炭富集,二氧化钛富集和固相C18片富集)相比,本发明提供的方法中条件温和(防止了唾液酸脱落)、柱填料成本低廉、特异性高,富集效果显著,并且环保。采用本发明提供的方法进行所述富集,可以保持唾液酸化糖链和或聚糖的结构信息,保留完整的特定肽段信息,有利于后续的质谱分析,反映了蛋白质天然的糖基化状态,对临床诊断标志物和疾病机制的研究具有重要意义。
附图说明
图1.为胎球蛋白(A)、转铁蛋白(B)及蛋白混合物(C)的唾液酸化糖肽的质谱图。质/荷是指分子质量与电荷数之比,☆为噪音峰。
图2.为木棉纤维对胎球蛋白的唾液酸化糖肽的富集特异性考察的质谱图。酶解原液的质谱图(A),从酶解原液富集到的唾液酸化糖肽的质谱图(B),穿透液的质谱图(C),唾液酸苷酶处理酶解原液后,再富集的质谱图(D)和糖苷酶F处理酶解原液后,再富集的质谱图(E)。质/荷是指分子质量与电荷数之比,☆为噪音峰。
图3.为木棉纤维对不同量的胎球蛋白唾液酸化糖肽的富集效果质谱图。质/荷是指分子质量与电荷数之比。
图4.为不同洗脱条件对于木棉纤维富集胎球蛋白唾液酸化糖肽的影响。质/荷是指分子质量与电荷数之比。
图5.为石墨碳/活性炭富集、二氧化钛富集和固相C18片富集与Kapfib-tip柱富集对比的质谱图。
图6.为脱脂棉(A)与木棉纤维(B)在表面扫描电子显微镜下的形态图。红外吸收光谱对比图(C):木棉纤维的红外吸收光谱图(K);从木棉纤维萃取得到的木质素的红外吸收光谱图(L);从木棉纤维萃取得到的纤维素的红外吸收光谱图(C)。
图7.为二恶烷分步萃取法萃取提纯木棉纤维的木质素和纤维素成分的试验流程。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为常规生化试剂。以下实施例中的实验结果,均设置三次重复实验,结果取平均值。唾液酸化糖肽即唾液酸化糖蛋白酶切后得到的具有唾液酸化糖链的多肽片段。以下实施例中的“%”,如无特殊说明,均代表体积百分含量。
本发明的发明人在长期试验过程中,发现以木棉纤维作为固定相制备的Kapfib-tip层析柱可以高效、特异、温和地富集分离唾液酸化糖肽。
移液器吸头(Tip)(最大上样体积为200μL):购自Axygen Scientific公司,产品目录号:T-200-Y。牛胎球蛋白、转铁蛋白、牛白蛋白、碳酸氢铵、碘乙酰胺、甲酸、2,5-二甲基苯甲酸、二氧化钛、固相C18片、石墨碳、活性炭均购自Sigma-Aldrich公司,产品目录号依次为F3004、T3309、A5503、09830、V900355、14265、85707、798517、66883-U、496596、C2889。二硫苏糖醇:购自Merck公司,产品目录号:8011。乙腈:购自Thermo Fisher公司,产品目录号:A998。三氟乙酸:购自Tedia公司,产品目录号:TS 4295。胰蛋白酶:购自Roche公司,产品目录号:11418025001。碱性磷酸酶:购自Promega公司,产品目录号:M182A。唾液酸苷酶、糖苷酶F:购自New Englan Biolabs公司,产品目录号分别是:P0720S、P0704S。超纯水来自MerckMillipore Synergy超纯水机。
实施例1、木棉纤维富集分离唾液酸化糖肽的应用
一、样本酶解溶液的制备
取20μL 1μg/μL牛胎球蛋白,转铁蛋白或者牛胎球蛋白、转铁蛋白和牛白蛋白混合蛋白,加入2.2μL 250mM碳酸氢铵和0.6μL 1M二硫苏糖醇(25mM碳酸氢铵配制)中,56℃孵育60min(还原反应,目的是打开二硫键),然后加入5.6μL含500mM碘乙酰胺(25mM碳酸氢铵配制),充分混匀后,25℃避光反应45min(封闭还原反应中打开的二硫键),加入1.5μL 100mM二硫苏糖醇(25mM碳酸氢铵配制)终止该反应,再加入12μL 50ng/μL胰蛋白酶在37℃下酶切12h,之后再加入1.5单位的碱性磷酸酶在37℃下酶切4h。将体系冷冻干燥,存储于-80℃备用。
二、从样本酶解溶液中富集唾液酸化糖肽
1、取木棉纤维,分别用超纯水、100%乙腈和80%乙腈水溶液超声洗涤(超声参数具体可为20KHz,2min)。
2、取约10mg步骤1得到的木棉纤维,填充至Tip内,得到Kapfib-tip柱。
3、完成步骤2后,取Kapfib-tip柱,依次加入50μL超纯水(550g,离心2min,弃除流出液)、50μL 100%乙腈(550g,离心5min,弃除流出液)和50μL 80%乙腈水溶液(550g,离心2min,弃除流出液)。
4、取2μg蛋白酶解物,用20μL 80%乙腈水溶液重溶,加入完成步骤3的Kapfib-tip柱中,550g,离心2min,收集流出液,即为穿透液。
5、完成步骤4后,取Kapfib-tip柱,加入50μL 80%乙腈水溶液(550g,离心2min),收集流出液,即为穿透液。
6、完成步骤5后,取Kapfib-tip柱,加入30μL 0.25%氨水溶液洗脱(1500g,离心5min),收集流出液,即为富含唾液酸化糖肽的溶液。
7、完成步骤6后,溶液冷冻抽干,以备进行质谱分析。
三、对比试验
1、步骤一中得到牛胎球蛋白酶解原液,用C18柱除盐。
2、合并步骤二中4和5得到的穿透液,用C18柱除盐。
3、步骤二中6得到的富含唾液酸化糖肽的溶液。
4、步骤一得到的牛胎球蛋白酶解原液,2μg蛋白,用16μL水重溶,2μL唾液酸苷酶,37℃,酶解16h。酶解完后,按照步骤二中1至6进行富集。
5、步骤一得到的牛胎球蛋白酶解原液,2μg蛋白,用16μL水重溶,0.5μL糖苷酶F,37℃,酶解4h。酶解完后,按照步骤二中1至6进行富集。
四、检测限试验(不同上样量)
步骤1至3同步骤二的1至3。
4、按步骤一获得牛胎球蛋白酶解原液,分别取0.2μg、0.5μg、1μg、2μg、4μg和8μg酶解物,用20μL 80%乙腈水溶液重溶,加入完成步骤3的Kapfib-tip柱中,550g,离心2min。
步骤5至7同步骤二的5至7。
五、对照试验(洗脱条件选择)
步骤1至5同步骤二的1至5。
6、完成步骤5后,取Kapfib-tip柱,分别用0.1%三氟乙酸、0.2%甲酸、超纯水、25mM碳酸氢铵、0.25%氨水溶液洗脱,分别得到五个不同的富集液,进行质谱分析。
六、对照试验(不同富集材料)
石墨碳/活性炭富集
1、装柱:将石墨碳与活性碳等质量混合,填充至Tip内,使其填充高度约为4-5mm,即为石墨碳/活性炭Tip柱,用80%乙腈水溶液冲洗备用。
2、平衡(重复3次):加入30μL 0.2%甲酸水溶液,然后1500g离心10min。
3、上样:取2μg牛胎球蛋白酶解样本,用20μL 0.2%甲酸水溶液重溶,上样(1000g离心10min,弃流出液)。
4、冲洗(重复2次):加入20μL超纯水,1500g离心10min。
5、完成步骤4后,加入30μL含0.2%甲酸和30%乙腈的水溶液,1500g离心10min,收集流出液。
6、冷冻抽干,质谱分析。
二氧化钛富集
1、装柱:将二氧化钛重悬于100%乙腈中,填充至Tip内,使其填充高度约为4-5mm,即为二氧化钛Tip柱。
2、平衡:加入50μL100%乙腈,2500g离心10min;加入50μL超纯水,2500g离心10min;加入20μL 100mg/mL 2,5-二甲基苯甲酸(80%乙腈/15%超纯水/5%三氟乙酸),2500g离心10min。
3、上样:取2μg牛胎球蛋白酶解样本,用20μL 2,5-二甲基苯甲酸水溶液重溶,然后上样(1500g离心10min),流出液再重新上样,重复三次。
4、冲洗(重复2次):加入80μL含80%乙腈和2%三氟乙酸的水溶液(2500g离心20min,弃流出液),加入80μL含20%乙腈和0.1%三氟乙酸的水溶液(2500g离心20min,弃流出液)。
5、完成步骤4后,加入80μL 0.8%磷酸缓冲液,2500g离心20min,收集流出液。
6、冷冻抽干,质谱分析。
固相C18片富集
1、将C18片剪成2mm×2mm小块,保存在20%乙腈水溶液中。
2、上样:取2μg牛胎球蛋白酶解样本,用20μL 20%乙腈水溶液重溶,放入C18小块,旋转孵育3h。
3、冲洗(重复3次):用200μL超纯水冲洗C18小块。
4、完成步骤3后,加入5μL含20%乙腈和0.1%三氟乙酸,旋转孵育1.5h.
5、冷冻抽干,质谱分析。
七、富集效果比较
质谱图见图1。图1A是牛胎球蛋白酶解液Kapfib-tip柱富集;图1B是转铁蛋白酶解液Kapfib-tip柱富集;图1C是牛胎球蛋白、转铁蛋白和牛白蛋白混合蛋白酶解液Kapfib-tip柱富集。(质谱峰之间相差一个唾液酸化残基,291Da,☆表示噪音峰)。在牛胎球蛋白中,发现了45个唾液酸化糖肽质谱峰;在转铁蛋白中,发现了25个唾液酸化糖肽质谱峰;在混合蛋白中发现了46个唾液酸化糖肽质谱峰。表明Kapfib-tip柱不仅可以富集单个蛋白和不同蛋白,同时对于混合的复杂蛋白体系也具有良好的富集效果。
对比Kapfib-tip柱富集前(图2A)、Kapfib-tip柱富集后(图2B)以及酶解液上样后穿过kapfib-tip柱的穿透液(图2C)的质谱图,可以发现图2A中有少量唾液酸化糖肽峰,主要为非唾液酸化糖肽峰;在图2B中,可以看到大量的唾液酸化糖肽峰,而非唾液酸化糖肽峰强度较低。对比图2A、图2B和图2C,发现唾液酸化糖肽被Kapfib-tip柱完全富集,在穿透液中是非唾液酸化糖肽。
图2D是牛胎球蛋白酶解后,再用唾液酸苷酶处理,进行Kapfib-tip柱富集。图2E是牛胎球蛋白酶解后,再用糖苷酶F处理,进行Kapfib-tip柱富集。对比图2D和图2E发现,它们具有较多一样荷质比(m/z)的峰,这些峰是非糖肽峰。而图2D中比图2E多出来的峰,是一些非唾液化糖肽峰。比较图2B、图2D和图2E,发现Kapfib-tip柱可以富集非唾液化糖肽和非糖肽。但当唾液酸化糖肽、非唾液酸化糖肽和非糖肽同时存在时,优先富集唾液酸化糖肽,表明Kapfib-tip柱对唾液酸化糖肽具有高的特异性。
对比不同量的牛胎球蛋白酶解液的Kapfib-tip柱富集质谱(图3,0.2μg、0.5μg、1μg、2μg、4μg和8μg),发现0.2μg时没有检测到唾液酸化糖肽的信息。0.5μg和1μg量时出现唾液酸化糖肽的信息,但其强度不高;2μg和4μg时出现较强的唾液酸化糖肽峰,且强度相近;8μg与2μg和4μg相同,这表明Kapfib-tip柱富集的最低检出限可达到0.5μg。
对比利用不同洗脱溶液洗脱Kapfib-tip柱上的唾液酸化糖肽的质谱图(图4),可以发现强酸洗脱液容易引起唾液酸化糖肽的解离,温和洗脱液,如水和低浓度的氨水溶液,可以获得大量唾液酸化糖肽的信息。在低浓度氨水条件下,得到的唾液酸化糖肽信息比用超纯水洗脱更多,说明碱性环境对唾液酸可能具有保护作用。
对比利用不同富集方法(如石墨碳/活性炭富集、二氧化钛富集、固相C18片富集和Kapfib-tip柱富集)富集唾液酸化糖肽的质谱图(图5A、5B、5C和5D),可以发现石墨碳/活性炭富集、二氧化钛富集和固相C18片富集的唾液酸化糖肽,主要分布于m/z<5000,可以明显观察到牛胎球蛋白非糖基化肽段信号如m/z 1692及m/z 2285信号峰。在用二氧化钛富集时,发现了脱水信号峰,比如m/z 4439对应的脱一个水分子的信号峰m/z 4421,脱两个水分子的信号峰m/z 4694,说明利用二氧化钛富集糖肽的条件不够温和,发生了脱水反应。Kapfib-tip柱结合温和洗脱条件对于唾液酸化糖肽的富集效果显著优于上述三种常规方法,不仅可以富集大量的唾液酸化糖肽(主要分布m/z范围为3000-7000),而且无脱水峰的出现。
实施例2、木棉纤维结构考察及其有效成分
本实施例中对Kapfib-tip的填充介质-木棉纤维进行结构表征,并进一步分析木棉纤维富集唾液酸化糖肽的有效成分。
图6A和图6B分别是脱脂棉和木棉纤维的扫描电镜图。脱脂棉的形态偏平,木棉纤维为光滑的圆柱状形态,木棉纤维是中空,表明两者具有不同的表面结构特征。
为了进一步证实木棉纤维表面成分,采用二恶烷分步萃取法结合红外吸收光谱法来验证。二恶烷分步萃取法实验步骤如图7所示,该方法可以分别获得木质素L和纤维素C,没有得到半纤维素,K为未经二恶烷处理的木棉纤维。红外光谱法检测得到相应的红外吸收光谱(图6C)。脱脂棉主要成分是纤维素。木棉纤维表面主要成分为木质素。因此,可以推测木棉纤维对唾液酸化糖肽高效富集分离的有效成分为木质素。
木棉纤维亲/疏水性试验及组织学染色观察(图8A)。将木棉纤维置于水中后明显蜷缩成球状,有水泡出现,且附着在表面,表明木棉纤维具有极强的疏水性;染色后呈现深红色,说明含有紫丁香基木质素;Wiesner染色后呈现紫红色,说明含有愈创木基木质素,表明木棉纤维表面含有木质素成分。在水中,脱脂棉具有极强的亲水性,同时两种染色实验均呈阴性结果,表明脱脂棉表面不含木质素。
Claims (4)
1.一种唾液酸化糖肽富集分离材料在富集分离唾液酸化糖肽中的应用,其特征在于:所述唾液酸化糖肽富集分离材料为木棉纤维;所述应用是利用唾液酸化糖肽富集分离材料作为层析柱的填料,富集分离唾液酸化糖肽;富集分离包括下述步骤:
1)将木棉纤维填充至柱容器内,得到Kapfib-tip柱;填充后,依次用超纯水、100%乙腈和80%乙腈水溶液洗涤所述Kapfib-tip柱;
2)采用所述Kapfib-tip柱从唾液酸化蛋白的酶解产物中富集唾液酸化糖肽;蛋白酶解液上样之后,使用0.25%氨水溶液洗脱,得到富含唾液酸化糖肽的溶液。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于:所述酶解产物是将唾液酸化糖蛋白进行双酶切的产物。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于:所述双酶切为胰蛋白酶酶切和碱性磷酸酶酶切。
4.一种用于富集分离唾液酸化糖肽的试剂盒,包括木棉纤维、超纯水、100%乙腈、80%乙腈水溶液和0.25%氨水溶液。
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木棉纤维性能测试与研究;张倩倩 等;《山东纺织科技》;20131231(第5期);第35-37页 * |
木棉纤维表面吸附特性;孙向玲 等;《东华大学学报(自然科学版)》;20111031;第37卷(第5期);第586-589页 * |
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