CN115184110A - 全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法。本发明将全类型生物样本与蛋白裂解液按照100μL～500μL的体系进行充分混合，裂解提取蛋白，蛋白裂解液为0.1～10％脱氧胆酸钠；加入终浓度为10‑1000mM的还原烷基化试剂；根据样品蛋白量与蛋白酶质量比1：5～10的比例加入蛋白酶；将酶解后的肽段‑酸性终止液溶液，转移至填充有具有阳离子交换作用的固相萃取板，加入质量分数为1％的三氟乙酸异丙醇溶液、质量分数为0.2％的三氟乙酸溶液进行脱盐洗涤，加入碱性乙腈溶液洗脱，收集含有肽段的洗脱液；滤液冻干复溶后，待质谱检测分析；本发明的蛋白酶切方法适用于多种生物样品，具有较广泛的适用性。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质组学技术领域，具体涉及一种全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法。
背景技术
蛋白质组学(proteomics)，是以蛋白质组为研究对象，研究血清、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。蛋白质组学指在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，血清代谢等过程的整体而全面的认识。在过去的二十年中，质谱(MS)已成为高可信度和深度覆盖地定量生物样品中蛋白质的首选方法，它极大地促进了对血清信号转导网络的理解，阐明了蛋白质在不同生理病理状态下的相互作用，改善了对疾病机理的诊断和分子理解。随着蛋白质组学技术的研究发展，蛋白质组学已广泛地应用于分子系统生物学，临床研究和个性化医学等领域。
高通量蛋白质组学是大规模蛋白质表征的核心技术。随着生物医学研究领域对大型队列蛋白质组分析需求的增加，高通量蛋白质组分析已成为亟待解决的关键问题。因此如何快速提高检测通量成了目前组学的重点研究方向之一。
CN 114354333 A公开了一种尿液样本的前处理方法、保存方法、自动化处理系统及检测方法，一方面，每孔PVDF膜只可以吸附20-25μg蛋白，因此该方法的处理对象为微量样本，一般限于尿液，另一方面，由于该方法采用PVDF膜来结合蛋白，前处理流程中使用到的裂解液会对PVDF膜吸附蛋白的效率会产生不同的抑制作用，因此需要探索最佳的裂解液，因此，上述现有方法具有一定的局限性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法，以解决现有技术具有一定的局限性的问题。
本发明提供一种全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法，该方法包括以下步骤：
步骤一，蛋白裂解：基于自动化处理工作站，将全类型生物样本与蛋白裂解液按照100μL～500μL的体系进行充分混合，裂解提取蛋白，其中，所述蛋白裂解液为0.1～10％脱氧胆酸钠；
步骤二，还原烷基化：加入终浓度为10-1000mM的还原烷基化试剂，打开蛋白结构中二硫键并与蛋白游离巯基结合，暴露出尽可能多的酶切位点；
步骤三，蛋白酶解：根据样品蛋白量与蛋白酶质量比1：5～10的比例混合，将蛋白酶解成多个小的肽段；
步骤四，肽段脱盐：将酶解后的肽段-酸性终止液溶液，转移至填充有具有阳离子交换作用的固相萃取板，加入质量分数为1％的三氟乙酸异丙醇溶液和加入质量分数为0.2％的三氟乙酸溶液进行脱盐洗涤，最后加入碱性乙腈溶液洗脱，收集含有肽段的洗脱液，以得到进行质谱检测进样的样品；
步骤五，冻干复溶：滤液冻干复溶后，待质谱检测分析。
进一步地，所述步骤二中，所述还原烷基化试剂为三(2-羧乙基)膦盐酸盐、氯乙酰胺。
进一步地，所述步骤三中，所述蛋白酶为胰蛋白酶和赖氨酸酶。
进一步地，所述步骤一中，蛋白裂解的时间为5分钟；所述步骤二中，还原烷基化的时间为30分钟；所述步骤三中，蛋白酶解的时间为120分钟；所述步骤四中，肽段脱盐的时间为30分钟；所述步骤五中，冻干复溶的时间为40分钟。
进一步地，所述步骤一包括：
自动移取生物样本10μL置于0.5mL 96孔板中并放置在1号位的恒温混匀摇床上，再从7号位的12道槽第1列(A1)中吸取90μL 0.1％脱氧胆酸钠分别加入1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中，1000rpm转速涡旋混匀，提取蛋白。
进一步地，所述步骤二包括：从6号位的低温盘第1列(A1)中吸取10μL 0.5M氯乙酰胺和三(2-羧乙基)膦盐酸盐的混合物，分别加入1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中，氯乙酰胺和三(2-羧乙基)膦盐酸盐的终浓度分别为10mM和40mM，1000rpm转速涡旋混匀，37℃反应30min。
进一步地，所述步骤三包括：从6号位的低温盘中第2列吸取10μL 2μg混合的胰蛋白酶(Trypsin)和赖氨酸酶(LysC)，分别加入1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中，进行37℃、1000rpm转速震荡孵育2h，孵育结束后，再从7号位的12道槽第2列(A2)中吸取100μL 1％三氟乙酸/异丙醇溶剂，加入1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中，1000rpm转速震荡孵育2min。
进一步地，所述步骤四包括：从7号位的12道槽第3列(A3)中吸取400甲醇溶剂，分别加入9号位的96孔脱盐板中，1000g离心1min，弃滤液；再从7号位的12道槽第4列(A4)中吸取400μL 0.2％三氟乙酸溶剂，分别加入9号位的96孔脱盐板中，1000g离心1min，弃滤液；再将1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中的酶切肽段分别加入9号位的96孔脱盐板中，1000g离心1min，取滤液再上样一次，弃滤液；再从7号位的12道槽第2列(A2)中吸取400μL1％三氟乙酸/异丙醇溶剂，分别加入9号位的96孔脱盐板中，1000g离心1min，弃滤液；再从7号位的12道槽第4列(A4)中吸取400μL 0.2％三氟乙酸溶剂，分别加入9号位的96孔脱盐板中，1000g离心1min，弃滤液；再从7号位的12道槽第5列(A5)中吸取200μL 1％氨水/80％乙腈溶剂，分别加入9号位的96孔脱盐板中，1000g离心1min，收集肽段滤液。
进一步地，所述步骤五包括：将收集得到的肽段滤液置于真空离心浓缩仪中进行浓缩旋干，然后再将冻干的肽段样本置于工作站的1号位的恒温混匀摇床上，从7号位的12道槽第6列(A6)中吸取20μL 0.1％甲酸水溶剂，1000rpm转速涡旋混匀1min，进行肽段复溶，复溶完成后，从1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中分别移取15μL上清液进入3号位的PCR板中，等待质谱检测分析。
进一步地，质谱检测分析中，质谱检测参数如下：
上机检测液相参数：流动相A为含0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的80％乙腈。梯度洗脱，0-4min，1％-8％B，4-83min，32％B，87-90min，100％B；流速为400nl/min。柱温为55℃；
上机检测质谱参数：DIA方式采集数据，每次质谱扫描包括一次全扫和60个DIA扫描窗口。循环时间为约4.8s。质谱全扫分辨率为60,000@m/z 200，AGC为3E6，最大离子进样时间为20ms，扫描范围为m/z 350-1500，标准化碰撞能量为28％，二级质谱扫描范围为m/z200-2000。DIA扫描分辨率为30,000@m/z 200，AGC为1E6，最大离子进样时间为45ms。
本发明的有益效果如下：本发明提供的全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法，基于自动化处理工作站，将全类型生物样本与蛋白裂解液按照100μL～500μL的体系进行充分混合，裂解提取蛋白，其中，所述蛋白裂解液为0.1～10％脱氧胆酸钠；加入终浓度为10-1000mM的还原烷基化试剂，打开蛋白结构中二硫键并与蛋白游离巯基结合，暴露出尽可能多的酶切位点；根据样品蛋白量与蛋白酶质量比1：5～10的比例混合，将蛋白酶解成多个小的肽段；将酶解后的肽段-酸性终止液溶液，转移至填充有具有阳离子交换作用的固相萃取板，加入质量分数为1％的三氟乙酸异丙醇溶液和加入质量分数为0.2％的三氟乙酸溶液进行脱盐洗涤，最后加入碱性乙腈溶液洗脱，收集含有肽段的洗脱液，以得到进行质谱检测进样的样品；滤液冻干复溶后，待质谱检测分析；本发明的蛋白酶切方法适用于多种生物样品，如细胞、细菌、组织、体液等样品类型，具有较广泛的适用性；本发明的蛋白质酶切方法只需要4个小时的处理时间，大大提高了前处理的效率；使用本发明的蛋白质酶切方法，获得的蛋白质组数据具有酶切完全、覆盖深度广、化学修饰少的优点；引入自动化处理工作站，能够同时进行96份或更多通量样本，从而提高了通量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法流程图；
图2为不同裂解液作用下样本蛋白及肽段鉴定数目标图；
图3为不同时间下蛋白检测统计结果图；
图4为自动化处理工作站结构示意图；
图5为全部样本酶切漏点比例图；
图6为样本肽段修饰比例图；
图7为全部样本蛋白分布排序图；
图8样本蛋白鉴定结果统计图。
具体实施方式
请参阅图1，本发明提供一种全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法，该方法包括以下步骤：
步骤一，蛋白裂解：基于自动化处理工作站，将全类型生物样本与蛋白裂解液按照100μL～500μL的体系进行充分混合，裂解提取蛋白，其中，所述蛋白裂解液为0.1～10％脱氧胆酸钠。
在本实施例中，蛋白裂解的时间为5分钟。
本发明优化了蛋白裂解步骤中蛋白裂解液的浓度，因过高的蛋白裂解液浓度会对还原烷基化产生影响，本发明通过实验验证，蛋白裂解液浓度过高，还原烷基化过程会产生沉淀，影响酶切的效率和质谱检测的灵敏度。
实验流程如下：
A样本：取同一293t样本10μg，加入90μL 0.1％SDC，涡旋混匀，提取蛋白；
B样本：取同一293t样本10μg，加入90μL 0.5％SDC，涡旋混匀，提取蛋白；
C样本：取同一293t样本10μg，加入90μL 1％SDC，涡旋混匀，提取蛋白；
随后向ABC三份样本中分别加入三(2-羧乙基)膦盐酸盐至终浓度10mM，加入氯乙酰胺至终浓度40mM，37℃反应30min；加入2μg混合的胰蛋白酶(Trypsin)和赖氨酸酶(LysC)，37℃震荡孵育2h，孵育结束后，再加入100μL 1％的三氟乙酸异丙醇溶液终止酶切反应；随后进行肽段脱盐操作：先加入400μL甲醇到脱盐孔板中，1000g，离心1min活化；加入0.2％三氟乙酸/水400μL，1000g，离心1min平衡；加入样品，1000g，离心1min，重复一次；加入1％的三氟乙酸/异丙醇400μL，1000g，离心1min淋洗；加入0.2％三氟乙酸/水400μL，1000g，离心1min淋洗；加入1％氨水/80％乙腈200μL，1000g，离心1min洗脱；收集滤液进行冻干；
D样本(尿素法结合传统前处理操作流程)：取10μg 293t样本，加入200μl 8M
尿素，涡旋混匀；加入DTT溶液至终浓度10mM，37℃反应30min；加入IAM溶液至终浓度20mM，室温，避光反应30min；加入200μl 50mMNH4HCO3，12,000g，离心10min；每个样品中加入200μl 50mM NH4HCO3，1μg LysC，37℃，震荡，孵育2h；再加入1μg Trypsin,37℃震荡，孵育过夜；往反应体系中加入10μl 10％TFA，终止反应；随后进行脱盐操作：先加入100μL甲醇到脱盐孔板中，1000g，离心1min；加入0.2％三氟乙酸/80％乙腈100μL，1000g，离心1min；加入0.2％三氟乙酸/水200μL，600g，离心1min；加入样品，1000g，离心1min，重复一次；加入0.2％三氟乙酸/水200μL，1000g，离心1min冲洗；加入0.2％三氟乙酸/80％乙腈100μL，1000g，离心1min洗脱；收集滤液进行冻干；用0.1％甲酸水溶液将以上ABCD样本全部复溶到同样的0.5μg/μL浓度，待质谱检测分析。
上机检测液相参数：流动相A为含0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的80％乙腈。梯度洗脱，0-4min，1％-8％B，4-83min，32％B，87-90min，100％B；流速为400nl/min。柱温为55℃；上机检测质谱参数：数据非依赖的采集(data-independentacquisition，DIA)方式采集数据，每次质谱扫描包括一次全扫和60个DIA扫描窗口。循环时间为约4.8s。质谱全扫分辨率为60,000@m/z 200，AGC为3E6，最大离子进样时间为20ms，扫描范围为m/z 350-1500，标准化碰撞能量为28％，二级质谱扫描范围为m/z 200-2000。DIA扫描分辨率为30,000@m/z 200，AGC为1E6，最大离子进样时间为45ms。
如图2所示，与D样本(尿素法结合传统前处理操作流程)相比，A样本(0.1％SDC)的质谱图已经明显有较多肽段峰被检测出；B样本(0.5％SDC)的质谱谱图比A样本又稍微少点肽段信息；C样本(1％SDC)比B样本又稍微少点肽段峰被检测到，且检测趋势与传统的前处理方法(D样本)趋于一致；将谱图进行查库，对检测到的肽段信息进行蛋白鉴定，鉴定统计结果如下，因此，选择用0.1％SDC对293t样本进行蛋白质组学前处理，克服了传统尿素法无法充分裂解蛋白的特性，提升293t样本中蛋白检测结果。
SDS是一种离子型的去垢剂，能够相当有效地溶解和变性蛋白，但是它的最大缺点是明显影响酶活性和干扰肽段的色谱分离及质谱鉴定；尿素是一种离液剂，也能很好的溶解和变性蛋白，但它的缺点是会导致一些蛋白的修饰如N-末端和赖氨酸的氨甲基化，从而影响蛋白的鉴定；而脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate，SDC)不仅可以增强蛋白质的溶解性，而且即使在较高的浓度下使用，对胰蛋白酶活性影响也很小，同时可以酸化后离心除去，从而可以促进蛋白质的酶解和鉴定。
本发明通过实验验证，将293t蛋白以液体的形式保存在0.1％SDC中，可以在1年内保持较稳定的蛋白数量和质量，采用基于质谱的数据非依赖性扫描模式(Data-independent acquisition,DIA)对不同保存时间的293t样本进行60分钟的定性分析；
实验流程如下：
取10μg 293t样本，加入90μL 0.1％SDC，涡旋混匀，提取蛋白，将293t蛋白样本置于-80℃条件下储存1个月、3个月、5个月、7个月、9个月及12个月；保存期满后，向0(即蛋白裂解后立即进行后续前处理操作)、1个月(即蛋白裂解完，293t蛋白保1个月后)、3个月(即蛋白裂解完，293t蛋白保存3个月后)、5个月(即蛋白裂解完，293t蛋白保存5个月后)、7个月(即蛋白裂解完，293t蛋白保存7个月后)、9个月(即蛋白裂解完，293t蛋白保存9个月后)、12个月(即蛋白裂解完，293t蛋白保存12个月后)的样本中加入三(2-羧乙基)膦盐酸至终浓度10mM，氯乙酰胺至终浓度40mM，37℃反应30min；1000g离心1min；加入2μg混合的胰蛋白酶(Trypsin)和赖氨酸酶(LysC)，37℃震荡孵育2h，孵育结束后，再加入100μL 1％的三氟乙酸异丙醇溶液终止酶切反应；随后进行肽段脱盐操作：先加入400μL甲醇到脱盐孔板中，1000g，离心1min活化；加入0.2％三氟乙酸/水400μL，1000g，离心1min平衡；加入样品，1000g，离心1min，重复一次；加入1％的三氟乙酸/异丙醇400μL，1000g，离心1min淋洗；加入0.2％三氟乙酸/水400μL，1000g，离心1min淋洗；加入1％氨水/80％乙腈200μL，1000g，离心1min洗脱；收集滤液进行冻干；用0.1％甲酸水溶液复溶到0.5μg/μL浓度，待质谱检测分析。
上机检测液相参数：流动相A为含0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的80％乙腈。梯度洗脱，0-4min，1％-8％B，4-83min，32％B，87-90min，100％B；流速为400nl/min。柱温为55℃；上机检测质谱参数：数据非依赖的采集(data-independentacquisition,DIA)方式采集数据，每次质谱扫描包括一次全扫和60个DIA扫描窗口。循环时间为约4.8s。质谱全扫分辨率为60,000@m/z 200，AGC为3E6，最大离子进样时间为20ms，扫描范围为m/z350-1500，标准化碰撞能量为28％，二级质谱扫描范围为m/z 200-2000。DIA扫描分辨率为30,000@m/z 200，AGC为1E6，最大离子进样时间为45ms。
蛋白检测统计结果如图3所示，从蛋白检测统计结果图发现，293t蛋白保存于0.1％SDC中12个月内，上机检测出的蛋白数量和肽段数量较稳定，一直维持在6800个蛋白和92000个肽段范围内，波动并不明显。因此，选择0.1％SDC进行293t蛋白保存，该方法较为可靠且在1年内能够保证稳定的蛋白数量和质量。其他裂解液如尿素对蛋白的降解没有影响，但是蛋白长期保存在尿素中尿素会与蛋白的某些氨基酸残基反应，如N-末端和赖氨酸的氨甲基化，可能会影响蛋白的一些性质。
步骤二，还原烷基化：加入终浓度为10-1000mM的还原烷基化试剂，打开蛋白结构中二硫键并与蛋白游离巯基结合，暴露出尽可能多的酶切位点。
在本实施例中，所述还原烷基化试剂为三(2-羧乙基)膦盐酸盐、氯乙酰胺；还原烷基化的时间为30分钟。
步骤三，蛋白酶解：根据样品蛋白量与蛋白酶质量比1：5～10的比例混合，将蛋白酶解成多个小的肽段。
在本实施例中，所述蛋白酶为胰蛋白酶和赖氨酸酶；蛋白酶解的时间为120分钟。
步骤四，肽段脱盐：将酶解后的肽段-酸性终止液溶液，转移至填充有具有阳离子交换作用的固相萃取板，加入质量分数为1％的三氟乙酸异丙醇溶液和加入质量分数为0.2％的三氟乙酸溶液进行脱盐洗涤，最后加入碱性乙腈溶液洗脱，收集含有肽段的洗脱液，以得到进行质谱检测进样的样品。
在本实施例中，肽段脱盐的时间为30分钟。
步骤五，冻干复溶：滤液冻干复溶后，待质谱检测分析。
在本实施例中，冻干复溶的时间为40分钟。
本发明将优化后的全类型生物样本蛋白质组学前处理流程整合进入自动化处理工作站中，整个自动化流程可以分为5个部分：蛋白裂解、还原烷基化、蛋白酶解、肽段脱盐和肽段复溶。自动化处理工作站内部结构如图4，包括1号位恒温混匀摇床、2号位50uL枪头、3号位PCR板、4号位200uL枪头、5号位0.5mL96孔板、6号位低温盘、7号位12道槽、8号位0.5mL96孔板以及9号位96孔脱盐板。操作流程如下：
第一步-蛋白裂解：自动移取生物样本10μL置于0.5mL 96孔板中并放置在1号位的恒温混匀摇床上，再从7号位的12道槽第1列(A1)中吸取90μL 0.1％脱氧胆酸钠分别加入1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中，1000rpm转速涡旋混匀，提取蛋白。
第二步-还原烷基化：从6号位的低温盘第1列(A1)中吸取10μL 0.5M氯乙酰胺和三(2-羧乙基)膦盐酸盐的混合物，分别加入1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中，氯乙酰胺和三(2-羧乙基)膦盐酸盐的终浓度分别为10mM和40mM，1000rpm转速涡旋混匀，37℃反应30min。
第三步-蛋白酶解：从6号位的低温盘中第2列吸取10μL 2μg混合的胰蛋白酶(Trypsin)和赖氨酸酶(LysC)，分别加入1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中，进行37℃、1000rpm转速震荡孵育2h，孵育结束后，再从7号位的12道槽第2列(A2)中吸取100μL1％三氟乙酸/异丙醇溶剂，加入1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL96孔板中，1000rpm转速震荡孵育2min。
第四步-肽段脱盐：从7号位的12道槽第3列(A3)中吸取400甲醇溶剂，分别加入9号位的96孔脱盐板中，1000g离心1min，弃滤液；再从7号位的12道槽第4列(A4)中吸取400μL0.2％三氟乙酸溶剂，分别加入9号位的96孔脱盐板中，1000g离心1min，弃滤液；再将1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中的酶切肽段分别加入9号位的96孔脱盐板中，1000g离心1min，取滤液再上样一次，弃滤液；再从7号位的12道槽第2列(A2)中吸取400μL 1％三氟乙酸/异丙醇溶剂，分别加入9号位的96孔脱盐板中，1000g离心1min，弃滤液；再从7号位的12道槽第4列(A4)中吸取400μL 0.2％三氟乙酸溶剂，分别加入9号位的96孔脱盐板中，1000g离心1min，弃滤液；再从7号位的12道槽第5列(A5)中吸取200μL 1％氨水/80％乙腈溶剂，分别加入9号位的96孔脱盐板中，1000g离心1min，收集肽段滤液。
第五步-肽段复溶：将收集得到的肽段滤液置于真空离心浓缩仪中进行浓缩旋干，然后再将冻干的肽段样本置于工作站的1号位的恒温混匀摇床上，从7号位的12道槽第6列(A6)中吸取20μL 0.1％甲酸水溶剂，1000rpm转速涡旋混匀1min，进行肽段复溶，复溶完成后，从1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中分别移取15μL上清液进入3号位的PCR板中，等待质谱检测分析。
质谱检测分析中，优化后的质谱检测参数如下：
上机检测液相参数：流动相A为含0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的80％乙腈。梯度洗脱，0-4min，1％-8％B，4-83min，32％B，87-90min，100％B；流速为400nl/min。柱温为55℃；
上机检测质谱参数：DIA方式采集数据，每次质谱扫描包括一次全扫和60个DIA扫描窗口。循环时间为约4.8s。质谱全扫分辨率为60,000@m/z 200，AGC为3E6，最大离子进样时间为20ms，扫描范围为m/z 350-1500，标准化碰撞能量为28％，二级质谱扫描范围为m/z200-2000。DIA扫描分辨率为30,000@m/z 200，AGC为1E6，最大离子进样时间为45ms。
请参阅图5至图8，针对整个分析流程和得到的分析结果，建立了多套质控标准，样本检测完成后，首先对全部样本的酶漏切比例和肽段修饰比例进行统计，请参阅图5，结果显示，全部样本的全酶切肽段比例大于90％，请参阅图6，样本的半胱氨酸还原烷基化比例大于12％，表明样本前处理操作很好；再对定量强度(intensity)进行统计分析请参阅图7，结果显示所有样本定量结果跨越4个数量级，intensity(Log 10)从较低的4到较高的8都能够检测到肽段强度，且intensity分布稳定，表明数据覆盖深度较广，可用于后期分析；样本的蛋白鉴定数量统计请参阅图8，样品鉴定到的蛋白绝大部分分布在8210和8815区间，鉴定数量相对稳定。
由以上实施例可知，本发明的蛋白酶切方法适用于多种生物样品，如细胞、细菌、组织、体液等样品类型，具有较广泛的适用性；本发明的蛋白质酶切方法只需要4个小时的处理时间，大大提高了前处理的效率；使用本发明的蛋白质酶切方法，获得的蛋白质组数据具有酶切完全、覆盖深度广、化学修饰少的优点；引入自动化处理工作站，能够同时进行96份或更多通量样本，从而提高了通量；引入自动化处理工作站，节省了整个实验的人力同时提升了实验结果的稳定性；相比较单个孔板加样，提高了重现性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一，蛋白裂解：基于自动化处理工作站，将全类型生物样本与蛋白裂解液按照100μL～500μL的体系进行充分混合，裂解提取蛋白，其中，所述蛋白裂解液为0.1～10％脱氧胆酸钠；
步骤二，还原烷基化：加入终浓度为10-1000mM的还原烷基化试剂，打开蛋白结构中二硫键并与蛋白游离巯基结合，暴露出尽可能多的酶切位点；
步骤三，蛋白酶解：根据样品蛋白量与蛋白酶质量比1：5～10的比例混合，将蛋白酶解成多个小的肽段；
步骤四，肽段脱盐：将酶解后的肽段-酸性终止液溶液，转移至填充有具有阳离子交换作用的固相萃取板，加入质量分数为1％的三氟乙酸异丙醇溶液和加入质量分数为0.2％的三氟乙酸溶液进行脱盐洗涤，最后加入碱性乙腈溶液洗脱，收集含有肽段的洗脱液，以得到进行质谱检测进样的样品；
步骤五，冻干复溶：滤液冻干复溶后，待质谱检测分析。
2.根据权利要求1所述的全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法，其特征在于，所述步骤二中，所述还原烷基化试剂为三(2-羧乙基)膦盐酸盐、氯乙酰胺。
3.根据权利要求1所述的全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法，其特征在于，所述步骤三中，所述蛋白酶为胰蛋白酶和赖氨酸酶。
4.根据权利要求1所述的全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法，其特征在于，所述步骤一中，蛋白裂解的时间为5分钟；所述步骤二中，还原烷基化的时间为30分钟；所述步骤三中，蛋白酶解的时间为120分钟；所述步骤四中，肽段脱盐的时间为30分钟；所述步骤五中，冻干复溶的时间为40分钟。
5.根据权利要求1所述的全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法，其特征在于，所述步骤一包括：
自动移取生物样本10μL置于0.5mL 96孔板中并放置在1号位的恒温混匀摇床上，再从7号位的12道槽第1列中吸取90μL 0.1％脱氧胆酸钠分别加入1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中，1000rpm转速涡旋混匀，提取蛋白。
6.根据权利要求1所述的全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法，其特征在于，所述步骤二包括：从6号位的低温盘第1列中吸取10μL 0.5M氯乙酰胺和三(2-羧乙基)膦盐酸盐的混合物，分别加入1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中，氯乙酰胺和三(2-羧乙基)膦盐酸盐的终浓度分别为10mM和40mM，1000rpm转速涡旋混匀，37℃反应30min。
7.根据权利要求1所述的全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法，其特征在于，所述步骤三包括：从6号位的低温盘中第2列吸取10μL 2μg混合的胰蛋白酶和赖氨酸酶，分别加入1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中，进行37℃、1000rpm转速震荡孵育2h，孵育结束后，再从7号位的12道槽第2列中吸取100μL 1％三氟乙酸/异丙醇溶剂，加入1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中，1000rpm转速震荡孵育2min。
8.根据权利要求1所述的全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法，其特征在于，所述步骤四包括：从7号位的12道槽第3列中吸取400甲醇溶剂，分别加入9号位的96孔脱盐板中，1000g离心1min，弃滤液；再从7号位的12道槽第4列中吸取400μL 0.2％三氟乙酸溶剂，分别加入9号位的96孔脱盐板中，1000g离心1min，弃滤液；再将1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中的酶切肽段分别加入9号位的96孔脱盐板中，1000g离心1min，取滤液再上样一次，弃滤液；再从7号位的12道槽第2列中吸取400μL 1％三氟乙酸/异丙醇溶剂，分别加入9号位的96孔脱盐板中，1000g离心1min，弃滤液；再从7号位的12道槽第4列中吸取400μL 0.2％三氟乙酸溶剂，分别加入9号位的96孔脱盐板中，1000g离心1min，弃滤液；再从7号位的12道槽第5列中吸取200μL 1％氨水/80％乙腈溶剂，分别加入9号位的96孔脱盐板中，1000g离心1min，收集肽段滤液。
9.根据权利要求1所述的全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法，其特征在于，所述步骤五包括：将收集得到的肽段滤液置于真空离心浓缩仪中进行浓缩旋干，然后再将冻干的肽段样本置于工作站的1号位的恒温混匀摇床上，从7号位的12道槽第6列中吸取20μL 0.1％甲酸水溶剂，1000rpm转速涡旋混匀1min，进行肽段复溶，复溶完成后，从1号位的恒温混匀摇床上的0.5mL 96孔板中分别移取15μL上清液进入3号位的PCR板中，等待质谱检测分析。
10.根据权利要求1所述的全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法，其特征在于，质谱检测分析中，质谱检测参数如下：
上机检测液相参数：流动相A为含0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的80％乙腈；梯度洗脱，0-4min，1％-8％B，4-83min，32％B，87-90min，100％B；流速为400nl/min；柱温为55℃；
上机检测质谱参数：DIA方式采集数据，每次质谱扫描包括一次全扫和60个DIA扫描窗口；循环时间为约4.8s；质谱全扫分辨率为60,000@m/z 200，AGC为3E6，最大离子进样时间为20ms，扫描范围为m/z 350-1500，标准化碰撞能量为28％，二级质谱扫描范围为m/z 200-2000；DIA扫描分辨率为30,000@m/z 200，AGC为1E6，最大离子进样时间为45ms。
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