CN112326773B - 一种高通量分析IgG糖肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高通量分析IgG糖肽的方法，包括：将IgG进行变性处理，得到变性IgG；将变性IgG进行酶切处理，得到IgG糖肽混合物；将IgG糖肽混合物进行固相萃取，分离富集IgG糖肽，得到IgG糖肽；采用基质辅助激光解析电离‑飞行时间‑质谱分析IgG糖肽，得到质谱数据；所述将变性IgG进行酶切处理，包括：将变性IgG和胰蛋白酶trypsin以质量比例为(48～53):1进行混合，后于温度为37℃下孵育10～15h。本发明提供的高通量分析IgG糖肽的方法，具有通量高、速度快和稳定性高的特点，适合于批量IgG糖肽样品的分析。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高通量分析IgG糖肽的方法。
背景技术
IgG糖肽分析的步骤通常包括蛋白酶切、糖肽富集、糖肽检测、数据处理与统计分析。其中，针对IgG蛋白的糖肽酶切步骤，目前尚没有确定的酶与蛋白的比例标准。一些研究者所采用的酶与IgG蛋白的比例通常为1：10至1：400不等，易导致糖肽酶切步骤中的不完全酶切或酶量过剩。此外，现有技术中有很多糖肽富集的方法，但是大多数方法都是依赖于新型材料与专业实验操作步骤，从而限制了相应方法的广泛应用。糖肽检测则主要基于质谱的分析方法，其中包括液相色谱-质谱联用(LC-MS)与基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱(MALDI-MS)。但是由于质谱数据本身的复杂性以及独特的数据格式，目前缺少能够高通量地处理质谱数据的应用程序。
因此，亟需一种高通量分析IgG糖肽的方法，以克服蛋白酶切中的不完全酶切或酶量过剩、无法高通量地处理质谱数据等缺陷。
发明内容
鉴于上述问题，本发明提供一种高通量分析IgG糖肽的方法，以克服蛋白酶切中的不完全酶切或酶量过剩、无法高通量地处理质谱数据等缺陷。本发明提供的高通量分析IgG糖肽的方法，具有通量高、速度快和稳定性高的特点，适合于批量IgG糖肽样品的分析。
本发明用于实现上述目的的技术方案如下：
在本发明的一个方面，提供了一种高通量分析IgG糖肽的方法，所述方法包括以下步骤：
将IgG进行变性处理，得到变性IgG；
将所述变性IgG进行酶切处理，得到IgG糖肽混合物；
将所述IgG糖肽混合物进行固相萃取，分离富集IgG糖肽，得到IgG糖肽；
采用基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱(MALDI-MS)分析所述IgG糖肽，得到质谱数据；
其中，所述将所述变性IgG进行酶切处理，得到IgG糖肽混合物，包括：
将所述变性IgG和胰蛋白酶trypsin(可以为测序级胰蛋白酶)以质量比例为(48～53):1进行混合，后于温度为37℃下孵育10～15h，得到IgG糖肽混合物。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述对IgG进行变性处理，得到变性IgG，包括：
将IgG与碳酸氢铵溶液混合，至碳酸氢铵溶液的摩尔浓度为45～55mM，后采用96孔PCR仪在温度为95～105℃下变性9～11min，后冷却至温度为18～31℃。
在本发明的一些优选实施方式中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述对IgG进行变性处理，得到变性IgG，包括：
将IgG与摩尔浓度为50mM的碳酸氢铵溶液混合，后采用96孔PCR仪在温度为100℃下变性10min，后冷却至温度为18～31℃。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述将所述IgG糖肽混合物进行固相萃取，分离富集IgG糖肽，得到IgG糖肽，包括：
将所述IgG糖肽混合物在温度为95～105℃下变性4～6min，后冷却至温度为18～31℃，得到变性IgG糖肽混合物；
将所述变性IgG糖肽混合物进行固相萃取，分离富集IgG糖肽，得到IgG糖肽；
其中：所述固相萃取中，采用乙腈三氟乙酸混合溶液作为平衡液，采用超纯水作为洗脱液，并且采用微晶纤维素作为富集材料；其中所述IgG糖肽混合物与所述平衡液的质量比例为1:5。
在本发明的一些优选实施方式中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述将所述IgG糖肽混合物进行固相萃取，分离富集IgG糖肽，得到IgG糖肽，包括：
将所述IgG糖肽混合物在温度为100℃下变性5min，后冷却至温度为18～31℃，得到变性IgG糖肽混合物；
将所述变性IgG糖肽混合物进行固相萃取，分离富集IgG糖肽，得到IgG糖肽；
其中：所述固相萃取中，采用乙腈三氟乙酸混合溶液作为平衡液，采用超纯水作为洗脱液，并且采用微晶纤维素作为富集材料；其中所述IgG糖肽混合物与所述平衡液的质量比例为1:5。
在本发明的一些优选实施方式中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述固相萃取在常温下进行，其中平衡与洗脱的步骤中流速为每秒钟1～2滴，活化与除杂的步骤中流速为每秒钟2-4滴，上样后流速为每2秒钟1滴。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述乙腈三氟乙酸混合溶液的使用量可以为450～510uL；所述乙腈三氟乙酸混合溶液中，乙腈的体积浓度可以为75～85％，三氟乙酸的体积浓度可以为0.08～0.12％。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述采用基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱分析所述IgG糖肽，得到质谱数据，包括：
将所述IgG糖肽进行浓缩处理(浓缩至蒸干)，得到浓缩IgG糖肽；
将所述浓缩IgG糖肽与体积浓度为45～55％的乙腈溶液混合，得到IgG糖肽样品溶液；
将所述IgG糖肽样品溶液0.5～1uL点样于靶板(不锈钢MALDI-MS金属板)上，干燥后得到IgG糖肽样品层；
将所述IgG糖肽样品层与DHB基质溶液以等体积比例进行混合，后于温度为18～31℃下结晶，得到结晶样品；
采用基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱分析所述结晶样品，得到质谱数据。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，采用真空旋转蒸发仪进行所述浓缩处理。
在本发明的一些优选实施方式中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述采用基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱分析所述IgG糖肽，得到质谱数据，包括：
将所述IgG糖肽进行浓缩处理(浓缩至蒸干)，得到浓缩IgG糖肽；
将所述浓缩IgG糖肽与体积浓度为50％的乙腈溶液混合，得到IgG糖肽样品溶液；
将所述IgG糖肽样品溶液0.5uL点样于靶板上，干燥后得到IgG糖肽样品层；
将所述IgG糖肽样品层与DHB基质溶液以等体积比例进行混合，后于温度为18～31℃下结晶，得到结晶样品；
采用基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱分析所述结晶样品，得到质谱数据。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述DHB基质溶液包含：质量浓度为9～12mg/mL的DHB和摩尔浓度为8～12mM的醋酸钠。
在本发明的一些优选实施方式中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述DHB基质溶液包含：质量浓度为10mg/mL的DHB和摩尔浓度为10mM的醋酸钠。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱分析的参数为：
模式：阳离子反射模式；
分子量范围：1000～4500Da；
激光强度：5500kW/cm2。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述将所述变性IgG和胰蛋白酶trypsin以质量比例为(48～53):1进行混合，后于温度为37℃下孵育10～15h，得到IgG糖肽混合物，包括：
将所述变性IgG和所述胰蛋白酶trypsin以质量比例为50:1进行混合，后于温度为37℃下孵育12h，得到IgG糖肽混合物。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述高通量分析IgG糖肽的方法还包括：
将所述质谱数据采用Mass Master软件进行预处理，得到预处理数据；
将所述预处理数据经MATLAB软件进行处理。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述Mass Master软件的编程方法包括以下步骤：
(a)打开MATLAB软件，指定所述质谱数据的文件所在的文件路径，设置所有目标峰的阈值；
(b)初始化计数器；
(c)开始读取所述质谱数据的文件的第一个样本中第一次试验所包含的所有峰值；其中，若所述峰值处于所述阈值的范围内，则选择所述峰值对应的丰度；若所述峰值并处于所述阈值的范围内，则继续筛选更大的峰值；重复进行所述读取的步骤，直至读取完所述阈值的范围内的所有目标峰；
(d)检验是否读取完所述阈值的范围内的所有目标峰；若读取完所述阈值的范围内的所有目标峰，则根据归一化原则将所有目标峰对应的丰度求和，然后计算每个所述目标峰对应的相对丰度；
(e)检验样本包含的所有试验数据是否完成；若已完成，则求取不同试验次数所包含峰值的平均相对丰度；若未完成，则继续循环所述(d)步骤直到获得第一个样本中的所有试验所包含的所有峰值的平均丰度；
(f)重复所述(d)～(e)步骤，依次读取其他样本对应的试验数据，并检验是否遍历所有样本；若没有完成所有样本试验中各个峰值对应的平均丰度，则重复所述(d)～(e)步骤；若已完成，则导出所有样本结果到txt或excel文档中，结束程序。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述Mass Master软件的编程方法可以如图4所示。
在本发明的另一个方面，提供了根据本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法在分析血清中IgG糖肽中的应用。
本发明所述的一个或多个技术实施方式，至少具有如下技术效果或优点：
(1)本发明所提供的高通量分析IgG糖肽的方法中，将IgG进行变性处理、酶切处理、IgG糖肽富集以及采用基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱分析进行数据分析，因此具有速度快和稳定性高的特点，适合于批量IgG糖肽样品的分析。
(2)本发明所提供的高通量分析IgG糖肽的方法中，将所述变性IgG进行酶切处理的过程中，限定了变性IgG和胰蛋白酶trypsin的质量比例为(48～53):1，并进一步优选为50:1，以克服蛋白酶切中的不完全酶切或酶量过剩、无法高通量地处理质谱数据等缺陷，从而使得IgG糖肽的分析具有更高的稳定性。
(3)本发明所提供的高通量分析IgG糖肽的方法中，采用发明人设计的特定MassMaster软件进行预处理质谱数据，可实现大批量样品数据的高通量快速处理与整合，例如一个数据集(样品数量为30，糖峰个数为28)的质谱数据可以在10秒之内处理完成。
(4)本发明所提供的高通量分析IgG糖肽的方法简单易行、高效稳定，并具有通量高、速度快与稳定性高的特点，适合于IgG糖肽样品的高通量分析。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1示出了依据本发明一些实施例的高通量分析IgG糖肽的方法的示意图。
图2示出了依据本发明一些实施例的基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱分析的参数所实现的检测效果。
图3示出了依据本发明一些实施例的高通量分析IgG糖肽的方法，针对IgG糖肽定性与定量分析的效果。
图4示出了依据本发明一些实施例的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述MassMaster软件的编程方法流程图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
在本发明的一个方面，提供了一种高通量分析IgG糖肽的方法，所述方法包括以下步骤：
将IgG进行变性处理，得到变性IgG；
将所述变性IgG进行酶切处理，得到IgG糖肽混合物；
将所述IgG糖肽混合物进行固相萃取，分离富集IgG糖肽，得到IgG糖肽；
采用基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱(MALDI-MS)分析所述IgG糖肽，得到质谱数据；
其中，所述将所述变性IgG进行酶切处理，得到IgG糖肽混合物，包括：
将所述变性IgG和胰蛋白酶trypsin(测序级胰蛋白酶)以质量比例为(48～53):1进行混合，后于温度为37℃下孵育10～15h，得到IgG糖肽混合物。
本发明所提供的高通量分析IgG糖肽的方法中，发明人通过优化设计一系列步骤，即将IgG进行变性处理、酶切处理、IgG糖肽富集以及采用基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱分析进行数据分析，因此具有速度快和稳定性高的特点，适合于批量IgG糖肽样品的分析。
在本发明的一些实施例中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述对IgG进行变性处理，得到变性IgG，包括：
将IgG与碳酸氢铵溶液混合，至碳酸氢铵溶液的摩尔浓度为45～55mM，后采用96孔PCR仪在温度为95～105℃下变性9～11min，后冷却至温度为18～31℃。本发明中，变性所需要的试剂简单，采用的变性方式通量高速度快，温度可控，操作方便。
在本发明的一些优选实施方式中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述对IgG进行变性处理，得到变性IgG，包括：
将IgG与摩尔浓度为50mM的碳酸氢铵溶液混合，后采用96孔PCR仪在温度为100℃下变性10min，后冷却至温度为18～31℃。
在本发明的一些优选实施方式中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述采用基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱分析所述IgG糖肽，得到质谱数据，包括：
将所述IgG糖肽进行浓缩处理，得到浓缩IgG糖肽；
将所述浓缩IgG糖肽与体积浓度为50％的乙腈溶液混合，得到IgG糖肽样品溶液；
将所述IgG糖肽样品溶液0.5uL点样于靶板上，干燥后得到IgG糖肽样品层；
将所述IgG糖肽样品层与DHB基质溶液以等体积比例进行混合，后于温度为18～31℃下结晶，得到结晶样品；
采用基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱分析所述结晶样品，得到质谱数据。
本发明采用的基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱分析所述IgG糖肽的步骤，使得整个分析过程简单、高通量、速度快、操作便携，尤其适合于临床样品的检测分析。
在本发明的一些实施例中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱分析的参数为：
模式：阳离子反射模式；
分子量范围：1000～4500Da；
激光强度：5500kW/cm2。
发明人经过大量筛选，选择了如上所述基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱分析的参数，从而能够最大范围地检测目标糖肽，能监测到32种糖肽，如图2所示。
在本发明的一些实施例中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述将所述变性IgG和胰蛋白酶trypsin以质量比例为(48～53):1进行混合，后于温度为37℃下孵育10～15h，得到IgG糖肽混合物，包括：
将所述变性IgG和所述胰蛋白酶trypsin以质量比例为50:1进行混合，后于温度为37℃下孵育12h，得到IgG糖肽混合物。
发明人经过大量优化试验，最终限定将所述变性IgG和所述胰蛋白酶trypsin以质量比例为50:1进行混合，以克服蛋白酶切中的不完全酶切或酶量过剩、无法高通量地处理质谱数据等缺陷，从而使得IgG糖肽的分析具有更高的稳定性。
在本发明的一些实施例中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述高通量分析IgG糖肽的方法还包括：
将所述质谱数据采用Mass Master软件进行预处理，得到预处理数据；
将所述预处理数据经MATLAB软件进行处理。
发明人通过大量研究实验，设计了特定Mass Master软件进行预处理质谱数据，可实现大批量样品数据的高通量快速处理与整合，例如一个数据集(样品数量为30，糖峰个数为28)的质谱数据可以在10秒之内处理完成。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的高通量分析IgG糖肽的方法中，所述Mass Master软件的编程方法包括以下步骤：
(a)打开MATLAB软件，指定所述质谱数据的文件所在的文件路径，设置所有目标峰的阈值；
(b)初始化计数器；
(c)开始读取所述质谱数据的文件的第一个样本中第一次试验所包含的所有峰值；其中，若所述峰值处于所述阈值的范围内，则选择所述峰值对应的丰度；若所述峰值并处于所述阈值的范围内，则继续筛选更大的峰值；重复进行所述读取的步骤，直至读取完所述阈值的范围内的所有目标峰；
(d)检验是否读取完所述阈值的范围内的所有目标峰；若读取完所述阈值的范围内的所有目标峰，则根据归一化原则将所有目标峰对应的丰度求和，然后计算每个所述目标峰对应的相对丰度；
(e)检验样本包含的所有试验数据是否完成；若已完成，则求取不同试验次数所包含峰值的平均相对丰度；若未完成，则继续循环所述(d)步骤直到获得第一个样本中的所有试验所包含的所有峰值的平均丰度；
(f)重复所述(d)～(e)步骤，依次读取其他样本对应的试验数据，并检验是否遍历所有样本；若没有完成所有样本试验中各个峰值对应的平均丰度，则重复所述(d)～(e)步骤；若已完成，则导出所有样本结果到txt或excel文档中，结束程序。
发明人设计了特定Mass Master软件进行预处理质谱数据，可实现大批量样品数据的高通量快速处理与整合，例如一个数据集(样品数量为30，糖峰个数为28)的质谱数据可以在10秒之内处理完成。
下面将结合实施例、对照例及实验数据对本申请所述高通量分析IgG糖肽的方法进行详细说明。
实施例1：本发明所述高通量分析IgG糖肽的方法
本发明所述高通量分析IgG糖肽的方法：
(1)人血清中提取IgG，将IgG与碳酸氢铵溶液混合，至碳酸氢铵溶液的摩尔浓度为55mM，然后采用96孔PCR仪，在温度为95℃下变性11min，变性结束后冷却至室温(可以为18～31℃)，得到变性IgG。
(2)将步骤(1)得到的变性IgG和胰蛋白酶trypsin(测序级胰蛋白酶)以质量比例为48:1进行混合，然后将混合物于温度为37℃下孵育10h，得到IgG糖肽混合物。
(3)将步骤(2)得到的IgG糖肽混合物，置于温度为95℃下，变性6min，然后冷却至室温(可以为18～31℃)，得到变性IgG糖肽混合物；将该变性IgG糖肽混合物进行固相萃取，分离富集IgG糖肽，得到IgG糖肽；
其中：所述固相萃取中，采用510uL的乙腈三氟乙酸混合溶液(其中乙腈的体积浓度为85％，三氟乙酸的体积浓度为0.08％)作为平衡液，采用超纯水作为洗脱液，并且采用微晶纤维素作为富集材料；其中所述IgG糖肽混合物与所述平衡液的质量比例为1:5；
所述固相萃取在常温下进行，其中平衡与洗脱的步骤中流速为每秒钟1～2滴，活化与除杂的步骤中流速为每秒钟2-4滴，上样后流速为每2秒钟1滴。
(4)将步骤(3)得到的IgG糖肽进行浓缩处理(浓缩至蒸干)，得到浓缩IgG糖肽；将浓缩IgG糖肽与体积浓度为55％的乙腈溶液混合，得到IgG糖肽样品溶液；将该IgG糖肽样品溶液0.5uL点样于不锈钢MALDI-MS金属板上，干燥后得到IgG糖肽样品层；将该IgG糖肽样品层与DHB基质溶液(包含质量浓度为12mg/mL的DHB和摩尔浓度为8mM的醋酸钠)以等体积比例进行混合，后于室温(可以为18～31℃)下结晶，得到结晶样品；将载有该结晶样品的不锈钢MALDI-MS金属板置入MALDI-MS中，采用MALDI-MS分析上述结晶样品，得到质谱数据。
其中，所述基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱分析的参数为：
模式：阳离子反射模式；分子量范围：4500Da；
激光强度：5500kW/cm2。
(5)将步骤(4)得到的质谱数据采用Mass Master软件进行预处理，导出为txt文件，得到预处理数据；然后将该预处理数据直接导入MATLAB软件进行批量处理，并对所述IgG糖肽进行定量分析和统计。
实施例2：本发明所述高通量分析IgG糖肽的方法
本发明所述高通量分析IgG糖肽的方法：
(1)人血清中提取IgG，将IgG与摩尔浓度为45mM的碳酸氢铵溶液混合，然后采用96孔PCR仪，在温度为105℃下变性9min，变性结束后冷却至温度为18～31℃，得到变性IgG。
(2)将步骤(1)得到的变性IgG和胰蛋白酶trypsin(测序级胰蛋白酶)以质量比例为53:1进行混合，然后将混合物于温度为37℃下孵育15h，得到IgG糖肽混合物。
(3)将步骤(2)得到的IgG糖肽混合物，置于温度为105℃下，变性4min，然后冷却至温度为18～31℃，得到变性IgG糖肽混合物；将该变性IgG糖肽混合物进行固相萃取，分离富集IgG糖肽，得到IgG糖肽；
其中：所述固相萃取中，采用450uL的乙腈三氟乙酸混合溶液(其中乙腈的体积浓度为75％，三氟乙酸的体积浓度为0.12％)作为平衡液，采用超纯水作为洗脱液，并且采用微晶纤维素作为富集材料；其中所述IgG糖肽混合物与所述平衡液的质量比例为1:5。
所述固相萃取在常温下进行，其中平衡与洗脱的步骤中流速为每秒钟1～2滴，活化与除杂的步骤中流速为每秒钟2-4滴，上样后流速为每2秒钟1滴。
(4)将步骤(3)得到的IgG糖肽进行浓缩处理，得到浓缩IgG糖肽；将浓缩IgG糖肽与体积浓度为45％的乙腈溶液混合，得到IgG糖肽样品溶液；将该IgG糖肽样品溶液1uL点样于不锈钢MALDI-MS金属板上，干燥后得到IgG糖肽样品层；将该IgG糖肽样品层与DHB基质溶液(包含质量浓度为9mg/mL的DHB和摩尔浓度为55mM的醋酸钠)以等体积比例进行混合，后于温度为18～31℃下结晶，得到结晶样品；将载有该结晶样品的不锈钢MALDI-MS金属板置入MALDI-MS中，采用MALDI-MS分析上述结晶样品，得到质谱数据。
其中，所述基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱分析的参数为：
模式：阳离子反射模式；分子量范围：1000Da；
激光强度：5500kW/cm2。
(5)将步骤(4)得到的质谱数据采用Mass Master软件进行预处理，导出为txt文件，得到预处理数据；然后将该预处理数据直接导入MATLAB软件进行批量处理，并对所述IgG糖肽进行定量分析和统计。
实施例3：本发明所述高通量分析IgG糖肽的方法
本发明所述高通量分析IgG糖肽的方法：
(1)人血清中提取IgG，将IgG与摩尔浓度为50mM的碳酸氢铵溶液混合，然后采用96孔PCR仪，在温度为100℃下变性10min，变性结束后冷却至温度为18～31℃，得到变性IgG。
(2)将步骤(1)得到的变性IgG和胰蛋白酶trypsin(测序级胰蛋白酶)以质量比例为50:1进行混合，然后将混合物于温度为37℃下孵育12h，得到IgG糖肽混合物。
(3)将步骤(2)得到的IgG糖肽混合物，置于温度为100℃下，变性5min，然后冷却至温度为18～31℃，得到变性IgG糖肽混合物；将该变性IgG糖肽混合物进行固相萃取，分离富集IgG糖肽，得到IgG糖肽；
其中：所述固相萃取中，采用500uL的乙腈三氟乙酸混合溶液(其中乙腈的体积浓度为80％，三氟乙酸的体积浓度为0.1％)作为平衡液，采用超纯水作为洗脱液，并且采用微晶纤维素作为富集材料；其中所述IgG糖肽混合物与所述平衡液的质量比例为1:5。
所述固相萃取在常温下进行，其中平衡与洗脱的步骤中流速为每秒钟1～2滴，活化与除杂的步骤中流速为每秒钟2-4滴，上样后流速为每2秒钟1滴。
(4)将步骤(3)得到的IgG糖肽进行浓缩处理，得到浓缩IgG糖肽；将浓缩IgG糖肽与体积浓度为50％的乙腈溶液混合，得到IgG糖肽样品溶液；将该IgG糖肽样品溶液0.5uL点样于不锈钢MALDI-MS金属板上，干燥后得到IgG糖肽样品层；将该IgG糖肽样品层与DHB基质溶液(包含质量浓度为10mg/mL的DHB和摩尔浓度为10mM的醋酸钠)以等体积比例进行混合，后于温度为18～31℃下结晶，得到结晶样品；将载有该结晶样品的不锈钢MALDI-MS金属板置入MALDI-MS中，采用MALDI-MS分析上述结晶样品，得到质谱数据。
其中，所述基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱分析的参数为：
模式：阳离子反射模式；分子量范围：4500Da；
激光强度：5500kW/cm2。
(5)将步骤(4)得到的质谱数据采用Mass Master软件进行预处理，导出为txt文件，得到预处理数据；然后将该预处理数据直接导入MATLAB软件进行批量处理，并对所述IgG糖肽进行定量分析和统计。
本发明实施例1至3中，所述高通量分析IgG糖肽的分析结果显示，相比于现有技术，本发明能够实现高通量分析IgG糖肽，实验步骤与操作规程简单，质谱数据处理的速度快。此外，通过本发明所述的Mass Master软件，使得分析过程简单高效。通过质量控制评估，本发明实施例1至3例所采用的方法针对IgG糖肽定性与定量分析的稳定性好，批次处理之间的CV值小于5％，如图3所示。
对比例1：
分析IgG糖肽的方法：
(1)人血清中提取IgG，将IgG与摩尔浓度为50mM的碳酸氢铵溶液混合，然后采用96孔PCR仪，在温度为100℃下变性10min，变性结束后冷却至温度为18～31℃，得到变性IgG。
(2)将步骤(1)得到的变性IgG和胰蛋白酶trypsin(测序级胰蛋白酶)以质量比例为45:1进行混合，然后将混合物于温度为37℃下孵育12h，得到IgG糖肽混合物。
(3)将步骤(2)得到的IgG糖肽混合物，置于温度为100℃下，变性5min，然后冷却至温度为18～31℃，得到变性IgG糖肽混合物；将该变性IgG糖肽混合物进行固相萃取，分离富集IgG糖肽，得到IgG糖肽；
其中：所述固相萃取中，采用500uL的乙腈三氟乙酸混合溶液(其中乙腈的体积浓度为80％，三氟乙酸的体积浓度为0.1％)作为平衡液，采用超纯水作为洗脱液，并且采用微晶纤维素作为富集材料；其中所述IgG糖肽混合物与所述平衡液的质量比例为1:5。
(4)将步骤(3)得到的IgG糖肽进行浓缩处理，得到浓缩IgG糖肽；将浓缩IgG糖肽与体积浓度为50％的乙腈溶液混合，得到IgG糖肽样品溶液；将该IgG糖肽样品溶液0.5uL点样于不锈钢MALDI-MS金属板上，干燥后得到IgG糖肽样品层；将该IgG糖肽样品层与DHB基质溶液(包含质量浓度为10mg/mL的DHB和摩尔浓度为10mM的醋酸钠)以等体积比例进行混合，后于温度为18～31℃下结晶，得到结晶样品；将载有该结晶样品的不锈钢MALDI-MS金属板置入MALDI-MS中，采用MALDI-MS分析上述结晶样品，得到质谱数据。
其中，所述基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱分析的参数为：
模式：阳离子反射模式；分子量范围：4500Da；
激光强度：5500kW/cm2。
(5)将步骤(4)得到的质谱数据采用Mass Master软件进行预处理，导出为txt文件，得到预处理数据；然后将该预处理数据直接导入MATLAB软件进行批量处理，并对所述IgG糖肽进行定量分析和统计。
对比例2：
分析IgG糖肽的方法：
(1)人血清中提取IgG，将IgG与摩尔浓度为50mM的碳酸氢铵溶液混合，然后采用96孔PCR仪，在温度为100℃下变性10min，变性结束后冷却至温度为18～31℃，得到变性IgG。
(2)将步骤(1)得到的变性IgG和胰蛋白酶trypsin(测序级胰蛋白酶)以质量比例为55:1进行混合，然后将混合物于温度为37℃下孵育12h，得到IgG糖肽混合物。
(3)将步骤(2)得到的IgG糖肽混合物，置于温度为100℃下，变性5min，然后冷却至温度为18～31℃，得到变性IgG糖肽混合物；将该变性IgG糖肽混合物进行固相萃取，分离富集IgG糖肽，得到IgG糖肽；
其中：所述固相萃取中，采用500uL的乙腈三氟乙酸混合溶液(其中乙腈的体积浓度为80％，三氟乙酸的体积浓度为0.1％)作为平衡液，采用超纯水作为洗脱液，并且采用微晶纤维素作为富集材料；其中所述IgG糖肽混合物与所述平衡液的质量比例为1:5。
(4)将步骤(3)得到的IgG糖肽进行浓缩处理，得到浓缩IgG糖肽；将浓缩IgG糖肽与体积浓度为50％的乙腈溶液混合，得到IgG糖肽样品溶液；将该IgG糖肽样品溶液0.5uL点样于不锈钢MALDI-MS金属板上，干燥后得到IgG糖肽样品层；将该IgG糖肽样品层与DHB基质溶液(包含质量浓度为10mg/mL的DHB和摩尔浓度为10mM的醋酸钠)以等体积比例进行混合，后于温度为18～31℃下结晶，得到结晶样品；将载有该结晶样品的不锈钢MALDI-MS金属板置入MALDI-MS中，采用MALDI-MS分析上述结晶样品，得到质谱数据。
其中，所述基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱分析的参数为：
模式：阳离子反射模式；分子量范围：4500Da；
激光强度：5500kW/cm2。
(5)将步骤(4)得到的质谱数据采用Mass Master软件进行预处理，导出为txt文件，得到预处理数据；然后将该预处理数据直接导入MATLAB软件进行批量处理，并对所述IgG糖肽进行定量分析和统计。
上述比对例中，所限定的变性IgG和胰蛋白酶trypsin的质量比例与本发明显著不同，容易导致不完全酶切或酶量过剩、无法高通量地处理质谱数据等缺陷，使得IgG糖肽的分析的稳定性差。
从以上本发明实施例1～3以及对比例1～2可以看出，本发明所述高通量分析IgG糖肽的方法至少具有以下有益效果：
(1)本发明所提供的高通量分析IgG糖肽的方法中，将所述变性IgG进行酶切处理的过程中，限定了变性IgG和胰蛋白酶trypsin的质量比例为(48～53):1，并进一步优选为50:1，以克服蛋白酶切中的不完全酶切或酶量过剩、无法高通量地处理质谱数据等缺陷，从而使得IgG糖肽的分析具有更高的稳定性。
(2)本发明所提供的高通量分析IgG糖肽的方法中，采用发明人设计的特定MassMaster软件进行预处理质谱数据，可实现大批量样品数据的高通量快速处理与整合，例如一个数据集(样品数量为30，糖峰个数为28)的质谱数据可以在10秒之内处理完成。
(3)本发明所提供的高通量分析IgG糖肽的方法简单易行、高效稳定，并具有通量高、速度快与稳定性高的特点，适合于IgG糖肽样品的高通量分析。
本发明上述实施例中，所述Mass Master软件的编程方法包括以下步骤：
(a)打开MATLAB软件，指定所述质谱数据的文件所在的文件路径，设置所有目标峰的阈值；
(b)初始化计数器；
(c)开始读取所述质谱数据的文件的第一个样本中第一次试验所包含的所有峰值；其中，若所述峰值处于所述阈值的范围内，则选择所述峰值对应的丰度；若所述峰值并处于所述阈值的范围内，则继续筛选更大的峰值；重复进行所述读取的步骤，直至读取完所述阈值的范围内的所有目标峰；
(d)检验是否读取完所述阈值的范围内的所有目标峰；若读取完所述阈值的范围内的所有目标峰，则根据归一化原则将所有目标峰对应的丰度求和，然后计算每个所述目标峰对应的相对丰度；
(e)检验样本包含的所有试验数据是否完成；若已完成，则求取不同试验次数所包含峰值的平均相对丰度；若未完成，则继续循环所述(d)步骤直到获得第一个样本中的所有试验所包含的所有峰值的平均丰度；
(f)重复所述(d)～(e)步骤，依次读取其他样本对应的试验数据，并检验是否遍历所有样本；若没有完成所有样本试验中各个峰值对应的平均丰度，则重复所述(d)～(e)步骤；若已完成，则导出所有样本结果到txt或excel文档中，结束程序。
本发明上述实施例中，本发明所述Mass Master软件的程序为：
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (9)
1.一种高通量分析IgG糖肽的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将IgG进行变性处理，得到变性IgG；
将所述变性IgG进行酶切处理，得到IgG糖肽混合物；
将所述IgG糖肽混合物进行固相萃取，分离富集IgG糖肽，得到IgG糖肽；
采用基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱分析所述IgG糖肽，得到质谱数据；
将所述质谱数据采用Mass Master软件进行预处理，得到预处理数据；
将所述预处理数据经MATLAB软件进行处理；
其中，所述将所述变性IgG进行酶切处理，得到IgG糖肽混合物，包括：
将所述变性IgG和胰蛋白酶trypsin以质量比例为（48~53）: 1进行混合，后于温度为37℃下孵育10~15 h，得到IgG糖肽混合物；
所述Mass Master软件的编程方法包括以下步骤：
（a）打开MATLAB软件，指定所述质谱数据的文件所在的文件路径，设置所有目标峰的阈值；
（b）初始化计数器；
（c）开始读取所述质谱数据的文件的第一个样本中第一次试验所包含的所有峰值；其中，若所述峰值处于所述阈值的范围内，则选择所述峰值对应的丰度；若所述峰值不处于所述阈值的范围内，则继续筛选更大的峰值；重复进行所述读取的步骤，直至读取完所述阈值的范围内的所有目标峰；
（d）检验是否读取完所述阈值的范围内的所有目标峰；若读取完所述阈值的范围内的所有目标峰，则根据归一化原则将所有目标峰对应的丰度求和，然后计算每个所述目标峰对应的相对丰度；
（e）检验样本包含的所有试验数据是否完成；若已完成，则求取不同试验次数所包含峰值的平均相对丰度；若未完成，则继续循环所述（d）步骤直到获得第一个样本中的所有试验所包含的所有峰值的平均丰度；
（f）重复所述（d）~（e）步骤，依次读取其他样本对应的试验数据，并检验是否遍历所有样本；若没有完成所有样本试验中各个峰值对应的平均丰度，则重复所述（d）~（e）步骤；若已完成，则导出所有样本结果到txt或excel文档中，结束程序。
2.根据权利要求1所述的高通量分析IgG糖肽的方法，其特征在于，所述将IgG进行变性处理，得到变性IgG，包括：
将IgG与碳酸氢铵溶液混合，至碳酸氢铵溶液的摩尔浓度为45~55 mM，后采用96孔PCR仪在温度为95~105℃下变性9~11 min，后冷却至温度为18~31℃。
3.根据权利要求1或2所述的高通量分析IgG糖肽的方法，其特征在于，所述将所述IgG糖肽混合物进行固相萃取，分离富集IgG糖肽，得到IgG糖肽，包括：
将所述IgG糖肽混合物在温度为95~105℃下变性4~6 min，后冷却至温度为18~31℃，得到变性IgG糖肽混合物；
将所述变性IgG糖肽混合物进行固相萃取，分离富集IgG糖肽，得到IgG糖肽；
其中：所述固相萃取中，采用乙腈三氟乙酸混合溶液作为平衡液，采用超纯水作为洗脱液，并且采用微晶纤维素作为富集材料；其中所述IgG糖肽混合物与所述平衡液的质量比例为1:5。
4.根据权利要求3所述的高通量分析IgG糖肽的方法，其特征在于，所述乙腈三氟乙酸混合溶液的使用量为450~510 uL；
所述乙腈三氟乙酸混合溶液中，乙腈的体积浓度为75~85%，三氟乙酸的体积浓度为0.08~0.12%。
5.根据权利要求1或2所述的高通量分析IgG糖肽的方法，其特征在于，所述采用基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱分析所述IgG糖肽，得到质谱数据，包括：
将所述IgG糖肽进行浓缩处理，得到浓缩IgG糖肽；
将所述浓缩IgG糖肽与体积浓度为45~55%的乙腈溶液混合，得到IgG糖肽样品溶液；
将所述IgG糖肽样品溶液0.5~1 uL点样于靶板上，干燥后得到IgG糖肽样品层；
将所述IgG糖肽样品层与DHB基质溶液以等体积比例进行混合，后于温度为18~31℃下结晶，得到结晶样品；
采用基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱分析所述结晶样品，得到质谱数据。
6.根据权利要求5所述的高通量分析IgG糖肽的方法，其特征在于，所述DHB基质溶液包含：质量浓度为9~12 mg/mL的DHB和摩尔浓度为8~12 mM的醋酸钠。
7.根据权利要求5所述的高通量分析IgG糖肽的方法，其特征在于，所述基质辅助激光解析电离-飞行时间-质谱分析的参数为：
模式：阳离子反射模式；
分子量范围：1000~4500 Da；
激光强度：5500 kW/cm2。
8.根据权利要求1或2所述的高通量分析IgG糖肽的方法，其特征在于，所述将所述变性IgG和胰蛋白酶trypsin以质量比例为（48~53）:1进行混合，后于温度为37℃下孵育10~15h，得到IgG糖肽混合物，包括：
将所述变性IgG和所述胰蛋白酶trypsin以质量比例为50:1进行混合，后于温度为37℃下孵育12 h，得到IgG糖肽混合物。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的高通量分析IgG糖肽的方法在分析血清中IgG糖肽中的应用。
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