CN103458983A - 通过使用含棉的固定相的色谱法纯化聚糖和/或糖缀合物的方法 - Google Patents

通过使用含棉的固定相的色谱法纯化聚糖和/或糖缀合物的方法 Download PDF

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Abstract

一种纯化聚糖和/或糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：（a）提供包含棉的固定相；（b）将含有聚糖和/或糖缀合物的样品施加到固定相；（c）使用第一溶剂洗涤固定相；和（d）使用第二溶剂将聚糖和/或糖缀合物从固定相中洗脱。一种用于纯化聚糖和/或糖缀合物的试剂盒，所述试剂盒包括：含有棉的固定相；和根据公开的方法纯化聚糖和/或糖缀合物的使用说明。

Description

通过使用含棉的固定相的色谱法纯化聚糖和/或糖缀合物的方法
本发明涉及一种纯化方法。特别地，本发明涉及一种纯化聚糖或糖缀合物的方法。
由于现代质谱法的速度、分辨率和灵敏度，它为蛋白质糖基化的详细结构表征提供了巨大的机会，所述结构表征包括蛋白质鉴定、位点特异性糖基化图谱的测定和在糖肽水平的聚糖或释放的聚糖的结构表征。
对糖肽和聚糖的有效电离和检测，往往需要富集或纯化步骤。已经发现的是，亲水作用液相色谱法（HILIC）特别适合于该目的，仅次于石墨化碳固相萃取（SPE）、肼耦合和凝集素或抗体亲和层析（如Mechref等人在Chem.Rev.2002,102,321-369中所描述的）。
虽然凝集素和抗体的特异性通常仅允许从库中分离聚糖或糖肽的亚单元，但是可以采用HILIC和石墨化碳SPE来分离广泛的糖缀合物，使得这些吸附色谱方法可以应用于广泛的糖组学和糖蛋白组学研究。
已经发现的是，HILIC SPE对胰蛋白酶N-糖肽的富集特别有用。出于这个目的，已经使用离子配对模式的ZIC-HILIC固定相，使用三氟乙酸作为流动相添加剂（如Mysling等人在Anal.Chem.2010,82,5598-5609中所描述的）。
可选择地，基于碳水化合物的固定相如琼脂糖和微晶纤维素已经应用于N-糖肽的分离（如Wada,Y等人在Anal.Chem.2004,76,6560-6565中所描述的）。
这些基于碳水化合物的固定相的一个重要特征是它们是非离子型的。因此，HILIC吸附被聚糖部分与固定相的氢键支配，而非糖基化的肽类、脂质、盐和清洁剂往往表现为低保留或无保留（如Wuhrer等人在MassSpectrom.Rev.2009,28,192-206中所描述的）。
当对糖缀合物使用高水含量进行洗脱时，糖缀合物的保留通常使用80％浓度的乙腈来实现。所需的洗脱条件使HILIC与质谱法无论脱机模式还是联机模式兼容性都非常好。
已知的是，IgG Fc N-糖基化图谱可以在HILIC SPE后通过MALDI-MS，以可重现的和稳健的方式进行分析，所述HILIC SPE使用琼脂糖以及微晶纤维素以批处理模式或96-孔板高通量的格式执行（Selman etal.;Anal.Chem.2010,82,1073-1081）。
仍然需要用于纯化分子如聚糖和糖缀合物的高效和有效的方法。
本申请人已经发现的是，可以使用脱脂棉（cotton wool）来制备允许简单快速的纯化分子如聚糖和糖缀合物的设备。本发明允许使用脱脂棉微尖端作为简单、快速和稳健的纯化程序的关键部分，如用于IgG FC N-糖基化图谱和用于在由N-糖苷酶F（PNG酶F）处理糖蛋白后提取N-聚糖时，成功地除去清洁剂和盐。
根据本发明，提供了一种纯化聚糖和/或糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
（a）提供包含棉的固定相；
（b）将含有聚糖和/或糖缀合物的样品施加到固定相；
（c）使用第一溶剂洗涤固定相；和
（d）使用第二溶剂将聚糖和/或糖缀合物从固定相中洗脱。
优选地，在步骤（b）中，所述含有聚糖和/或糖缀合物的样品包含有机溶剂，其中所述有机溶剂包括乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或四氢呋喃。
优选地，其中所述有机溶剂是70％至88％v/v的乙腈的水溶液；更优选地，其中所述有机溶剂是75％至85％v/v的乙腈的水溶液；更优选地，其中所述有机溶剂是83％v/v的乙腈的水溶液。
优选地，在步骤（c）中，所述第一溶剂为溶剂混合物，所述溶剂混合物含有水、有机溶剂和酸。更优选地，所述有机溶剂是乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或四氢呋喃；且所述酸为三氟乙酸、甲酸、乙酸、五氟丙酸或七氟丁酸。
合适地，上述溶剂混合物含有75％至90％v/v的有机溶剂和0.1％至1％v/v的酸的水溶液。可选择地，所述溶剂混合物含有70％至95％v/v的有机溶剂和0.1％至3％v/v的酸的水溶液。优选地，所述溶剂混合物含有83％v/v的乙腈和0.1％v/v的三氟乙酸的水溶液。
优选地，在步骤（d）中，所述第二溶剂包括极性溶剂。更优选地，所述极性溶剂是水、二甲亚砜或二甲基甲酰胺。
任选地，所述第二溶剂包含比所述第一溶剂极性更大的溶剂。
优选地，在步骤（c）中的清洗将盐、非糖基化的肽、脂质、去垢剂、过量的还原末端标记、还原剂、变性剂和变性的蛋白质从固定相中去除。
任选地，所述糖缀合物为糖蛋白、糖肽或糖脂。优选地，所述方法用于纯化聚糖或糖肽。
合适地，所述糖肽是IgG糖肽。
优选地，所述IgG糖肽是胰蛋白酶的IgG Fc N-糖肽。
任选地，所述聚糖为N-聚糖。
合适地，所述固定相是可重复使用的。
优选地，所述固定相包含脱脂棉。
任选地，所述固定相由脱脂棉组成。
合适地，所述固定相含有约500μg的脱脂棉。所述固定相可以含有约250μg至约750μg的脱脂棉。
优选地，所述方法还包括对洗脱的聚糖和/或糖缀合物进行质谱分析或荧光检测的步骤。
任选地，所述质谱分析是MALDI-TOF-MS检测。
优选地，使用荧光染料通过还原胺化进行标记的聚糖使用HPLC荧光检测，或毛细管凝胶电泳激光-诱导荧光检测（CGE-LIF）分析。
合适地，所述方法还包括将洗脱的糖肽在糖肽水平进行糖基化图谱的步骤。
优选地，所述固定相被保留在末端开口的容器（open-ended vessel）中。所述容器可以是一端开放的，或两端开放的。优选地，所述容器是两端开放的。
任选地，所述末端开口的容器是移液管、多通道的移液管或微量移液管（pipette tip）。
合适地，所述纯化步骤可以用于在PNG酶F处理糖蛋白后提取聚糖、在通过还原性胺化反应进行荧光标记后提取聚糖，或从蛋白水解液中富集N-糖肽。
根据本发明的再一个方面，提供了一种纯化聚糖和/或糖缀合物的试剂盒，所述试剂盒包括：含有棉的固定相；和根据本发明所述的方法纯化聚糖和/或糖缀合物的使用说明。所述试剂盒还包括用于保留所述固定相的容器。优选地，所述试剂盒包括放置在末端开口的容器中的固定相。
任选地，所述试剂盒包括保留棉固定相的微量移液管。
本发明现将以实例的方式，参照附图描述，其中：
图1包括示出棉HILIC SPE微尖端（microtip）的制备的四张照片。从脱脂棉垫（A）中取出约500微克（B）并用钝的金属针（C）推入10微升微量移液管中。棉被向下推入到所述微量移液管的端部（D）；
图2示出使用棉HILIC SPE微尖端制备的IgG糖肽的两个MALDI-TOF-质谱图谱。质谱使用CHCA矩阵（A）在正反射模式中记录，和使用DHB矩阵（B）在正线性模式中记录。IgG1糖肽和IgG2糖肽分别以实线箭头和虚线箭头表示：方形，N-乙酰葡糖胺；三角形，海藻糖；黑圆圈，甘露糖；浅圆圈，半乳糖；钻石形，N-乙酰神经氨酸；pep，肽部分；
图3示出了使用棉HILIC SPE微尖端通过IgG1糖肽图谱的MALDI-TOF-MS重复性记录的IgG1Fc N-糖基化图谱。IgG1糖肽使用CHCA矩阵（A，C）通过在反射模式中的MALDI-TOF-MS检测，并且使用DHB矩阵（B，D）通过在线性模式中的MALDI-TOF-MS检测。样品在使用中和法消化，随后使用棉HILIC SPE微尖端脱盐后制备，所述棉HILIC SPE微尖端由三种不同品牌的脱脂棉垫（A，B）制备。将所得的图谱与在通过真空离心干燥，并且使用测序级胰蛋白酶（C，D）消化后，通过琼脂糖珠或棉HILIC SPE微尖端纯化得到的糖型的图案进行比较。对于每个独立的实验，使用8个重复来计算相对强度和RSD；
图4示出了用于IgG糖肽的脱盐和纯化的棉HILIC SPE微尖端的可重复性。通过使用CHCA矩阵的反射模式MALDI-TOF-MS进行分析。使用一种棉HILIC微尖端（A和B）或使用八种不同的棉HILIC微尖端（C和D）对胰蛋白酶IgG消化池脱盐。在不同的四天重复该实验；
图5示出了使用棉HILIC SPE微尖端的IgG2糖肽图谱的可重复性。IgG2糖肽使用CHCA矩阵（A，C）通过在反射模式中的MALDI-TOF-MS检测，并且使用DHB矩阵（B，D）通过在线性模式中的MALDI-TOF-MS检测。样品在使用中和法消化，随后使用棉HILIC SPE微尖端脱盐后制备，所述棉HILIC SPE微尖端由三种不同品牌的脱脂棉垫（A，B）制备。将所得的图谱与在通过真空离心干燥，并且使用测序级胰蛋白酶（C，D）消化后，通过琼脂糖珠或棉HILIC SPE微尖端纯化得到的糖型的图案进行比较。对于每个独立的实验，使用8个重复来计算相对强度和RSD;
图6示出了在棉HILIC（A）之前和在棉HILIC（B）纯化之后，从蛋白A捕获的IgG中释放的N-聚糖的RP-MALDI-TOF-MS；
图7示出了在棉HILIC（A）之前和在棉HILIC（B）纯化之后，从蛋白A捕获的IgG中释放的N-聚糖的LP-MALDI-TOF-MS；
图8示出了在棉HILIC（A）之前和在棉HILIC（B）纯化之后，从蛋白A捕获的IgG中释放的N-聚糖的线性负模式-MALDI-TOF-MS;
图9示出了在棉HILIC（A）之前和在棉（B）之后，从转铁蛋白释放的N-聚糖的线性负模式-MALDI-TOF-MS；
图10示出了来自使用2-氨基苯甲酸（AA）通过还原性胺化标记后，使用棉HILIC SPE微尖端纯化的人血浆蛋白质，经PNG酶F释放的N-聚糖的线性负离子模式MALDI-TOF-MS谱；
图11示出了胰蛋白酶糖肽（A）和来自牛胎球蛋白的经PNG酶F释放的N-聚糖（B）在使用棉HILIC SPE微尖端纯化后的线性负离子模式MALDI-TOF-MS谱；和
图12示出了胰蛋白酶糖肽（A）和来自人类脱铁运铁蛋白糖肽的经PNG酶F释放的N-聚糖（B）在使用棉HILIC SPE微尖端纯化后的线性负离子模式下的MALDI-TOF-MS谱。
根据本发明，提供了用于提取糖缀合物和/或聚糖的脱脂棉HILIC SPE微尖端程序。糖缀合物是包含共价地连接到另一部分的碳水化合物的部分。糖缀合物包括糖蛋白、糖肽、肽聚糖、糖脂和脂多糖。优选地，糖缀合物为糖蛋白、糖肽和肽聚糖。优选地，糖缀合物为糖肽。优选地，糖缀合物为糖蛋白。
此程序显示了良好的可重复性并且似乎并不依赖于特定的品牌或批次的脱脂棉垫。脱脂棉微尖端便宜并且可以简单和快速地在实验室中制备。
可以用于各种固定相引入的微尖端包括ZIC-HILIC微尖端。与其他一些微尖端先比，棉固定相停留在适当的位置，使用液体抽吸和分散。此外，固定相似乎与酸条件和高乙腈条件相容（如Craft等人在J.Proteome Res.2002,1,537-547所描述的）。
建立HILIC SPE微尖端之后，针对IgG FC N-糖基化图谱方案引入两个额外的修改（如之前Craft等人在J.Proteome Res.2002,1,537-547所描述的）。首先，使用TPCK处理过的胰蛋白酶，而不是更昂贵的测序级胰蛋白酶进行胰蛋白酶裂解。第二，用于从蛋白A洗脱液中除去甲酸的相当费力的真空离心步骤，已经被简单的中和代替，使得该方案更容易和更适合自动化。
原棉主要由纤维素（超过90％）组成（Fan Qinguo,Editor,2005,Chemical testing of textiles,336pp;Woodhead Publishing ISBN:1855739178）。棉花用于各种商业产品，例如服装，棉花棒（棉签）和脱脂棉垫。用了制造用于垫和棉签的脱脂棉，对梳理纤维后的原棉进行广泛的漂白，随机排列和在高压下用水处理以使纤维交叉并打结。在制造过程中的，将蜡和蛋白质的痕迹从棉中除去，并且作为结果，脱脂棉垫几乎由纯纤维素组成。
与聚HEA和碳水化合物HILIC固定相如琼脂糖和微晶纤维素类似，脱脂棉是非离子型的，中性的固定相，并且预期的是仅通过氢键引起HILIC的保留。与此相反，离子相互作用可能有助于在ZIC-HILIC中的HILIC保留以及具有基于胺的固定相的HILIC保留，这可以通过加入盐和/或离子对试剂调制（如Wuhrer等人在Mass Spectrom.Rev.2009,28,192-206所描述的）。
琼脂糖和微晶纤维素已被成功地用于可重现性的IgG Fc N-糖基化图谱，并且脱脂棉HILIC微尖端可用于同样的目的，并且具有易用性、适合用于微量样品和可以在MALDI靶板上直接洗脱样品的特定优势。
值得注意的是，本发明人发现，脱脂棉HILIC微尖端不仅适合于除去盐和大部分非糖基化的肽，而且还从胰蛋白酶消化液中除去洗涤剂如SDS。因此，脱脂棉微尖端可以在糖组学和蛋白质组学的应用中作为样品净化设备，在糖组学和蛋白质组学的应用中往往添加变性剂和表面活性剂以改善蛋白质溶解度和蛋白质水解裂解。
基于碳水化合物的HILIC固定相可以额外地用于通过质谱法的血浆总N-糖组分析（如Ruhaak等人在Anal.Bioanal.Chem.2010,397,3457-3481所描述）。将AA标记的N-聚糖从标记混合液纯化，所述标记混合物含有过量的标记、还原剂、各种盐、血浆脂质和连同变性蛋白质的大量的洗涤剂，然后使用MS检测聚糖。脱脂棉微尖端同样适用于连同有利的SPE洗脱条件，在酶的N-聚糖释放后去除盐和洗涤剂，这导致N-聚糖的有效的质谱检测（图6、7、8和9）。
本发明的脱脂棉微尖端是用于简单、快速的制备胰蛋白酶IgG的消化液的便利设备，并允许通过MALDI MS分析测定IgG FC N-糖基化的特征，如半乳糖基化、唾液酸化、海藻糖基化以及平分型N-乙酰葡糖胺的发生率。
IgG的生物活性通过Fc的N-糖基化调节，这将影响抗体依赖性细胞的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性。因此，为了最大限度地提高例如在抗癌治疗（下一代治疗性抗体）中的疗效，正在设计由生物技术产生的IgG的IgG Fc N-糖基化。
脱脂棉HILIC微尖端是制备用于质谱分析的低量样品的特别方便的工具，并且可以应用于（1）临床样本的IgG Fc N-糖基化图谱，所述临床样本通常表现出疾病相关的IgG糖基化变化，以及（2）重组表达的IgG的分析。
与其他HILIC固定相类似，脱脂棉微尖端也用于其他典型的HILICSPE应用，如从复杂的蛋白水解消化液中富集N-糖肽，在PNG酶F处理糖蛋白或糖肽后提取N-聚糖，或在通过还原胺化荧光标记后清洁聚糖。脱脂棉尖端通过手工制备。作为这样的尖端需要考虑到尖端容量的变化。容量的要求随样品而变化，并可以很容易地被建立以用于使用者自己的应用。
虽然脱脂棉HILIC微尖端是少量样品加工的良好的选择，通过使用多通道移液器或通过将SPE方法转移到自动平台，它们也适用于大量样品。
实验
IgG纯化
通过使用固定化蛋白的亲和层析从血浆中纯化人的多克隆IgG（根据Wuhrer等人在Proteomics2007,7,4070-4081公开的技术并稍加修改）。
使用磷酸盐缓冲液（PBS）将rProtein A-SepharoseTM珠(GE Healthcare,Eindhoven,The Netherlands)洗涤3次。向96孔的OF1100过滤板（OrochemTechnologies Inc.,Lombard,IL）的每个孔中加入50微升PBS、50微升含有约5微升珠和2微升的人血浆的悬浮液。使用盖将板盖上，并在室温下温和搅拌孵育1小时。
孵育后，用3×200微升PBS和3×200微升的水在真空多支管上洗涤珠。通过分别使用40微升的100mM甲酸（Fluka,Steinheim,Germany）孵育5分钟并离心（在18g下，1分钟）后，将捕获的人的多克隆IgG从蛋白A中释放并洗脱到96孔V形底的聚丙烯板（V96microwell;NUNC,Roskilde,Denmark）。离心后，使用20微升的300mM的碳酸氢铵将洗脱液中和（最终的pH>7）。可供选择地，将洗脱液经真空离心干燥2小时。
胰蛋白酶消化
将甲苯磺酰基苯丙氨酰基氯甲酮（TPCK）处理过的胰蛋白酶（Sigma-Aldrich,Steinheim,Germany）溶解在冰冷却的20mM乙酸（Merck,Darmstadt,Germany）中，以使最终浓度为0.05微克胰蛋白酶每微升，并在-80℃分装存储直至使用。对每一个中和的IgG样品加入8微升胰蛋白酶原液（总计400微克）和12微升水。对样品振荡3分钟，在37℃下孵育过夜。将IgG胰蛋白酶消化液在-20℃下储存直到HILIC SPE微尖端脱盐和纯化。
将1毫克的胎球蛋白（Sigma-Aldrich）溶解在200微升含有10mM二硫苏糖醇（DTT）的50mM碳酸氢铵中，并在60℃下还原40分钟。通过将30微升的100mM碘乙酰胺溶于50mM的碳酸氢铵中，然后在室温下避光孵育30分钟，实现半胱氨酸的烷基化反应。通过将样品在荧光灯（气体放电灯）下放置30分钟使烷基化反应停止。使用20微克测序级改性胰蛋白酶（Promega,Madison,WI）在37℃过夜得到胰蛋白酶消化液。
N-聚糖释放
N-聚糖从蛋白A纯化的IgG释放（如Ruhaak等人在Anal.Chem.2008,80,6119-6126所描述）。简言之，使用2微升十二烷基硫酸钠（SDS）（2％），在60℃下将干燥的IgG样品变性10分钟。随后，加入2微升含有2％Tergitol-型NP-40（NP-40）、2.5×PBS和0.05mU PNG酶F（Roche,Mannheim,Germany）的释放混合物。样品在37℃下孵育过夜，以释放N-聚糖。
将人的脱铁运铁蛋白（0.1毫克，Sigma-Aldrich）溶解于21微升含有10mM DTT的50mM碳酸氢铵中，并在60℃下还原40分钟。通过将4微升200mM的碘乙酰胺溶于50mM的碳酸氢铵，然后在在室温下避光孵育30分钟，实现半胱氨酸的烷基化反应。将样品在荧光灯（气体放电灯）下放置30分钟，停止烷基化。将6mU PNG酶F加入到样品，并在37℃孵育过夜，以释放N-聚糖。
制备棉HILIC SPE微尖端
在当地商店购买三种不同品牌的脱脂棉垫（Da,Dynaretail,Leusden,The Netherlands;Etos,Etos bv,Beverwijk,the Netherlands;Bella,GroupeLemoine;Paris,France），并用于制备HILIC SPE微尖端。根据生产商，所述脱脂棉垫由100％纯棉制造。从脱脂棉垫取一小块平均重量为500微克的脱脂棉，并使用钝的针推入到10微升微量移液管（Rainin,Tiel,TheNetherlands）的端部。将微尖端存储在封闭的盒子，直到使用。
N-聚糖和胰蛋白酶IgG糖肽的棉HILIC SPE
通过溶液的吸引和分散，将棉HILIC SPE微尖端使用10微升水洗涤五次，并且使用83％的乙腈（Biosolve BV,Valkenswaard,The Netherlands）适用三次。对于小于10％的制备的微尖端，发现溶剂吸入时的流缓慢并且不充分，因此，将这样的微尖端丢弃。对于施加到棉HILIC SPE微尖端的样品，将39微升乙腈添加到8微升的胰蛋白酶IgG消化液或N-聚糖释放样品，并且将混合物上下抽吸20次，以使糖肽吸附。将吸附的聚糖或糖肽使用10微升的含0.1％TFA的83％乙腈洗涤3次，并使用2微升的水直接洗脱到MALDI板上。
MALDI-TOF-MS
对于使用正反射模式的MALDI-TOF-MS的IgG Fc N-糖肽图谱，使用2微升的水将糖肽从棉HILIC SPE微尖端直接洗脱到抛光的不锈钢MALDI板（Bruker Daltonics,Bremen,Germany）上，并允许在空气中干燥。使用2微升的α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA，5毫克/毫升50％乙腈;BrukerDaltonics）将样品覆盖，并允许在空气中干燥。
对于在正线性模式中的糖基化图谱，将IgG糖肽直接洗脱到AnchorChip600/384MALDI板（Bruker Daltonics）上，并允许在空气中干燥。使用1微升的羟基苯甲酸（DHB，5毫克/毫升50％含0.1％TFA的乙腈;Bruker Daltonics）将样品覆盖。使用含有5个约5毫米（内径）孔的穿孔盖将AnchorChip板覆盖，以允许DHB矩阵在室温下以受控的方式在空气中干燥。
样品在Ultraflex II MALDI-TOF/TOF-MS（Bruker Daltonics）上进行分析，并且使用flexAnalysis软件（Bruker Daltonics）处理质谱。同样地，将聚糖从棉HILIC微-SEP直接洗脱到AnchorChip MALDI板上，允许在空气中干燥，并使用1微升DHB覆盖。
结果
IgG纯化和胰蛋白酶裂解
从含有5微升的蛋白质A-琼脂糖珠的96孔过滤板中的2微升人的血浆中将IgG亲和捕获（约20μg IgG），然后用40微升的100mM甲酸将IgG洗脱。虽然该方案先前描述的版本涉及通过真空离心将样品干燥（Wuhrer等人，Proteomics2007,7,4070-4081），此方案被当前方案中使用碳酸氢铵中和的步骤代替。
通过使用200微克测序级改性的胰蛋白酶或400微克TPCK处理过的胰蛋白酶，在37℃下孵育过夜进行IgG的胰蛋白酶裂解。IgG的糖肽在96孔板格式中通过琼脂糖HILIC SPE纯化，并通过在正反射模式中的MALDI-TOF-MS分析。中和方案得到的IgG Fc N-糖肽图谱与前面描述的独立于所用的胰蛋白酶的真空离心方案（数据未示出）所观察到的那些非常相似。
使用棉HILIC SPE微尖端的糖肽纯化
评估棉作为在IgG糖肽的HILIC SPE中的固定相的潜力。为此，将一小片脱脂棉垫（约500微克）装入微量移液管的端部（图1）。从脱脂棉垫（A）中取出约500微克（B）并用钝的金属针（C）推入10微升微量移液管中。棉被向下推入到移液器的端部（D）。
得到的SEP微尖端用于测试IgG糖肽的HILIC模式的富集。具体而言，将乙腈加入到人血浆IgG的胰蛋白酶消化液的等分试样中，并将糖肽吸附到HILIC SPE固定相。使用10微升的含0.1％TFA的83％乙腈洗涤三次后，使用2微升的水将保留的糖肽直接洗脱到MALDI板，然后通过MALDI-TOF-MS分析IgG Fc N-糖肽的图谱。
通过反射模式和线性模式的MALDI-TOF-MS记录的糖肽图谱的实例如图2所示。获得的IgG1和IgG2的N-糖基化图谱与先前获得的那些在IgG糖肽96孔板样品制备后，使用反相SPE脱盐或琼脂糖HILIC SPE纯化（图3）非常相似。
图2示出使用棉HILIC SPE微尖端制备的IgG糖肽的MALDI-TOF-质谱图谱。质谱使用CHCA矩阵（A）在正反射模式中记录，和使用DHB矩阵（B）在正线性模式中记录。IgG1糖肽和IgG2糖肽分别以实线箭头和虚线箭头表示：方形，N-乙酰葡糖胺；三角形，海藻糖；黑圆圈，甘露糖；浅圆圈，半乳糖；钻石形，N-乙酰神经氨酸；pep，肽部分。
发现的是，从使用棉HILIC SPE微尖端空白洗脱液得到的MALDI-TOF-MS图谱与MALDI矩阵对照组（只有矩阵，没有发现样品）几乎是相同的，并且在MALDI-TOF-MS图谱中没有检测到与脱脂棉相关的污染物的峰（数据未示出）。
棉HILIC SPE的验证
一种棉HILIC SPE微尖端使用八次，用于从胰蛋白酶IgG消化池纯化糖肽，然后将洗脱的糖肽通过反射模式进行MALDI-TOF-MS（如在图4A和4B所示）。
在不同的四天重复该实验，每个实验使用新的棉HILIC SPE尖端。在另一组实验中，8种不同的尖端，用于来自上述的胰蛋白酶IgG消化池的（如在图4C和4D中所示）IgG Fc的N-糖基化图谱。在不同的四天重复该实验，每个实验使用新的棉HILIC SPE尖端。在棉HILIC SPE后，得到高度重复性的IgG Fc N-糖基化图谱，与微观尺度的纯化和富集是重复使用相同的尖端还是使用不同的尖端无关。
图4示出了用于IgG糖肽的脱盐和纯化的棉HILIC SPE微尖端的可重复性。通过使用CHCA矩阵的反射模式MALDI-TOF-MS进行分析。使用一种棉HILIC微尖端（A和B）或使用八种不同的棉HILIC微尖端（C和D）对胰蛋白酶IgG消化池脱盐。在不同的四天重复该实验。
完整方法的验证
在一个对照个体的8个血浆等分中平行进行IgG Fc的N-糖基化图谱。这涉及到蛋白质捕获、洗脱液的中和、使用TPCK-胰蛋白酶裂解、棉HILICSPE和MALDI-TOF-MS分析。在不同的三天重复该程序。在反射模式和线性模式中进行质谱分析，证明IgG1（如图3A和3B所示）和IgG2（如图5A、5B、6A和6B所示）的Fc N-糖基化图谱的记录均具有低日内变异和低日间变异。
在上面提到的棉材料后，使用另外两种品牌的脱脂棉垫制备HILICSPE微尖端和IgG FC N-糖基化图谱。对于IgG1（图3A和3B）和IgG2（如图5A、5B、6A和图6B所示）两者，所有三种品牌的脱脂棉垫提供了非常相似的结果。
此外，将该方法与先前由Selman等人在Anal.Chem.2010,82,1073-1081描述的方法相比较。与以前的方法相比，主要区别是：（1）通过真空离心干燥蛋白A洗脱液被中和步骤取代，（2）测序级胰蛋白酶被TPCK处理过的胰蛋白酶取代，和（3）使用棉HILIC微尖端进行SPE取代了使用琼脂糖珠进行96-孔板HILIC SPE。
第三种方法将先前由Selman等人描述的样品制备（即蛋白A捕获、真空离心干燥和使用测序级胰蛋白酶消化IgG）与棉HILIC SPE纯化和反射模式MALDI-TOF-MS分析结合。使用所有不同的方案，通过反射模式MALDI-TOF-MS和线性模式MALDI-TOF-MS得到非常相似的IgG1（图3C和3D）和IgG2（如图5A、5B、7A和7B所示）Fc的N-糖基化图谱。
图3示出使用棉HILIC SPE微尖端的IgG1糖肽图谱可重复性。IgG1糖肽使用CHCA矩阵（A，C）通过在反射模式中的MALDI-TOF-MS检测，并且使用DHB矩阵（B，D）通过在线性模式中的MALDI-TOF-MS检测。样品在使用中和法消化，随后使用棉HILIC SPE微尖端脱盐后制备，所述棉HILIC SPE微尖端由三种不同品牌的脱脂棉垫（A，B）制备。
图5示出了使用棉HILIC SPE微尖端的IgG2糖肽图谱的可重复性。IgG2糖肽使用CHCA矩阵（A，C）通过在反射模式中的MALDI-TOF-MS检测，并且使用DHB矩阵（B，D）通过在线性模式中的MALDI-TOF-MS检测。样品在使用中和法消化，随后使用棉HILIC SPE微尖端脱盐后制备，所述棉HILIC SPE微尖端由三种不同品牌的脱脂棉垫（A，B）制备。将所得的图谱与在通过真空离心干燥，并且使用测序级胰蛋白酶（C，D）消化后，通过琼脂糖珠或棉HILIC SPE微尖端纯化得到的糖型的图案进行比较。对于每个独立的实验，使用8个重复来计算相对强度和RSD。
将所得的图谱与在通过真空离心干燥，并且使用测序级胰蛋白酶（C，D）消化后，通过琼脂糖珠或棉HILIC SPE微尖端纯化得到的糖型的图案进行比较。对于每个独立的实验，使用8个重复来计算相对强度和RSD。
使用棉HILIC SPE微尖端纯化聚糖
至于其他领域的应用，使用PNG酶F释放后聚糖的MALDI-TOF-MS样品制备测试棉HILIC SPE微尖端。N-聚糖在酶学上从含有清洁剂（SDS，NP-40）和盐（PBS）的人IgG样品和人脱铁运铁蛋白样品中释放。在棉HILIC微-SPE纯化后，通过MALDI-TOF-MS检测中性和酸性（唾液酸）N-聚糖，同时对没有SPE纯化的聚糖释放样品的直接的MALDI-TOF-MS分析没有记录到N-聚糖，而是被清洁剂的簇占主导（图6、7，8和9）。
图6、图7、图8和9示出在棉HILIC微-SPE纯化后的N-聚糖的MALDI-TOF-MS谱。从IgG（图6、图7和8，谱A-F）和人脱铁运铁蛋白（图9，谱G，H）在酶学上释放的N-聚糖酶在正反射模式（图6，谱A、B），正线性模式（图7，谱C，D）和负线性模式（图8和9，谱E-H），不具有使用棉HILIC微-SPE的预先纯化（左图：谱A、C、E、G）和具有使用棉HILIC微-SPE的预先纯化（右图：谱B、D、F、H）通过MALDI-TOF-MS进行分析。在正离子模式，聚糖被记录为钠加合物并且在负离子模式聚糖被记录为去质子化的物种：*，钾加合物；方形，N-乙酰葡糖胺；三角形，海藻糖；黑圆圈，甘露糖；浅圆圈，半乳糖；紫色钻石形，N-乙酰神经氨酸。
图10示出了从使用AA标记的人血浆蛋白质的PNG酶F释放的N-聚糖的线性负离子模式MALDI-TOF-MS谱。如之前描述（Ruhaak等人,2008,Anal Chem.,80,6119-6126），N-聚糖使用PNG酶F从人血浆蛋白（2微升血浆）释放，通过棉HILIC微-SPE纯化，并在AnchorChip靶板上使用DHB测量；方形，N-乙酰葡糖胺；三角形，海藻糖；黑圆圈，甘露糖；浅圆圈，半乳糖；钻石形，N-乙酰神经氨酸；*，源后衰变产物。
图11（谱A和B）示出了胰蛋白酶糖肽（A）和来自牛胎球蛋白（SwissProt entry number:P12763）的PNG酶F释放的N-聚糖（B）在线性负离子模式下的MALDI-TOF-MS谱。糖肽和聚糖通过棉HILIC微-SPE纯化，并在AnchorChip靶板上使用DHB测量。（A）实线箭头，小分子量糖肽（L145CPDCPLLAPLNDSR159）；虚线箭头，中间分子量糖肽（V160VHAVEVALATFNAESNGSYLQLVEISR187）；点箭头，大分子量糖肽（R72PTGEVYDIEIDTLETTCHVLDPTPL ANCSVR103）；（B）～，胎球蛋白肽H313TFSGVASVESSSGEAFHVG K333；*，钠加合物；￥，钾加合物；方形，N-乙酰葡糖胺；三角形，海藻糖；黑圆圈，甘露糖；浅圆圈，半乳糖；钻石形，N-乙酰神经氨酸。
图12（谱A和B）示出了胰蛋白酶糖肽（A）和来自人类脱铁运铁蛋白糖肽（SwissProt entry number:P02787）的PNG酶F释放的N-聚糖（B）在线性负离子模式下的MALDI-TOF-MS谱。糖肽和聚糖通过棉HILIC微-SPE纯化，并在AnchorChip靶板上使用DHB测量。（A）实线箭头，小分子量糖肽（C421GLVPVLAENYNK433）；虚线箭头，大分子量糖肽（V160VHAVEVALATFNAESNGSYLQLVEISR187）；点箭头，大分子量糖肽（Q622QQHLFGSNVTDCSGNFCLFR642）；￥，源后衰变产物；*，在蛋白水解消化过程中由N端多肽降解引起的氨损失；（B）*，钠加合物；￥，钾加合物；方形，N-乙酰葡糖胺；三角形，海藻糖；黑圆圈，甘露糖；浅圆圈，半乳糖；钻石形，N-乙酰神经氨酸。
因此，这些实验表明通过棉HILIC SPE成功地清理N-聚糖的释放样品，使这些样品除去清洁剂和盐，用于MALDI-TOF-MS分析。
在本说明书中列出或讨论的明显是之前出版的文献并非必需地被认为确认该文献是本领域的部分或者是公知常识。

Claims (15)

1.一种纯化聚糖和/或糖缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
（a）提供包含棉的固定相；
（b）将含有聚糖和/或糖缀合物的样品施加到固定相；
（c）使用第一溶剂洗涤固定相；和
（d）使用第二溶剂将聚糖和/或糖缀合物从固定相中洗脱。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（b）中，所述含有聚糖和/或糖缀合物的样品包含有机溶剂；其中所述有机溶剂包括乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或四氢呋喃；优选地，其中所述有机溶剂是70％至88％v/v的乙腈的水溶液；更优选地，其中所述有机溶剂是75％至85％v/v的乙腈的水溶液；更优选地，其中所述有机溶剂是83％v/v的乙腈的水溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（c）中，所述第一溶剂为溶剂混合物，所述溶剂混合物含有水、有机溶剂和酸；优选地，其中所述有机溶剂是乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或四氢呋喃；且所述酸为三氟乙酸、甲酸、乙酸、五氟丙酸或七氟丁酸；更优选地，其中所述溶剂混合物含有75％至90％v/v的有机溶剂和0.1％至1％v/v的酸的水溶液；或70％至95％v/v的有机溶剂和0.1％至3％v/v的酸的水溶液，更优选地，所述溶剂混合物含有83％v/v的乙腈和0.1％v/v的三氟乙酸的水溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（d）中，所述第二溶剂包括极性溶剂；优选地所述极性溶剂是水、二甲亚砜或二甲基甲酰胺。
5.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述第二溶剂包含比所述第一溶剂极性更大的溶剂。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述糖缀合物是糖蛋白、糖肽或糖脂；优选地，其中所述糖肽是IgG糖肽；更优选地，其中所述IgG糖肽是胰蛋白酶的IgG Fc N-糖肽。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述聚糖为N-聚糖。
8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述固定相是可重复使用的。
9.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述固定相包含脱脂棉；优选地，其中所述固定相由脱脂棉组成。
10.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述固定相含有约500μg的脱脂棉。
11.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述方法还包括对洗脱的聚糖和/或糖缀合物进行质谱分析的步骤；优选地，其中所述质谱分析是MALDI-TOF-MS检测。
12.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述方法还包括将洗脱的糖肽在糖肽水平进行糖基化图谱的步骤。
13.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述固定相被保留在末端开口的容器中；优选地其中所述末端开口的容器是移液管、多通道的移液管或微量移液管。
14.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述纯化步骤可以用于：在PNG酶F处理糖蛋白后提取聚糖、在通过还原性胺化反应进行荧光标记后提取聚糖，或从蛋白水解液中富集N-糖肽。
15.一种用于纯化聚糖和/或糖缀合物的试剂盒，所述试剂盒包括：
含有棉的固定相；和
根据权利要求1-14中任一项所述的方法纯化聚糖和/或糖缀合物的使用说明。
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