JP6849974B2 - 糖鎖濃縮カラム及び糖鎖濃縮方法 - Google Patents
糖鎖濃縮カラム及び糖鎖濃縮方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6849974B2 JP6849974B2 JP2018517094A JP2018517094A JP6849974B2 JP 6849974 B2 JP6849974 B2 JP 6849974B2 JP 2018517094 A JP2018517094 A JP 2018517094A JP 2018517094 A JP2018517094 A JP 2018517094A JP 6849974 B2 JP6849974 B2 JP 6849974B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- column
- concentration
- sugar chain
- solid
- phase extraction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 46
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 147
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 claims description 102
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 claims description 102
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 84
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 claims description 74
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 claims description 70
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 claims description 70
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 claims description 67
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 61
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 61
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 54
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 48
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 48
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 claims description 33
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 17
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 15
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 14
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 13
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 10
- 238000003825 pressing Methods 0.000 claims description 10
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 8
- 239000003575 carbonaceous material Substances 0.000 claims description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 7
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 7
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 5
- 229920003043 Cellulose fiber Polymers 0.000 claims description 4
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 4
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229920000191 poly(N-vinyl pyrrolidone) Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 84
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 62
- PXBFMLJZNCDSMP-UHFFFAOYSA-N 2-Aminobenzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1N PXBFMLJZNCDSMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 50
- 239000000047 product Substances 0.000 description 29
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 27
- 239000013081 microcrystal Substances 0.000 description 23
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 18
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 18
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 14
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 14
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 14
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 12
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 12
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 12
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 12
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 11
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 10
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 10
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 9
- -1 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 9
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 8
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 7
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 7
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 6
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 6
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 5
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- HFWWEMPLBCKNNM-UHFFFAOYSA-N n-[bis(hydroxyamino)methyl]hydroxylamine Chemical compound ONC(NO)NO HFWWEMPLBCKNNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 5
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 4
- 108010090665 Mannosyl-Glycoprotein Endo-beta-N-Acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 4
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 4
- 102000012404 Orosomucoid Human genes 0.000 description 4
- 108010061952 Orosomucoid Proteins 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 108010066476 ribonuclease B Proteins 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 3
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 3
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000010844 nanoflow liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-UHFFFAOYSA-N 2-(hydroxymethyl)-6-[4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane-3,4,5-triol Chemical compound OCC1OC(OC2C(O)C(O)C(O)OC2CO)C(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007630 basic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000005319 nano flow HPLC Methods 0.000 description 2
- 229920003053 polystyrene-divinylbenzene Polymers 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- PTHCMJGKKRQCBF-UHFFFAOYSA-N Cellulose, microcrystalline Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 PTHCMJGKKRQCBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- CTKINSOISVBQLD-UHFFFAOYSA-N Glycidol Chemical compound OCC1CO1 CTKINSOISVBQLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001018085 Lysobacter enzymogenes Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- LEKJTGQWLAUGQA-UHFFFAOYSA-N acetyl iodide Chemical compound CC(I)=O LEKJTGQWLAUGQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 102000012086 alpha-L-Fucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010061314 alpha-L-Fucosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/30—Partition chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/32—Bonded phase chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/02—Devices for withdrawing samples
- G01N1/10—Devices for withdrawing samples in the liquid or fluent state
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hydrology & Water Resources (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
カラム洗浄液をカラムに添加し、ポリマー性ポリオール層から固相抽出担体層に向かう方向の圧力をカラムに印加してカラムを洗浄することにより、夾雑物を除去してポリマー性ポリオール層内に糖ペプチド又は遊離糖鎖を濃縮保持させる、選択的濃縮工程;及び
溶出液をカラムに添加し、ポリマー性ポリオール層から固相抽出担体層に向かう方向の圧力をカラムに印加して糖ペプチドを溶出する、溶出工程
を含む、糖ペプチド又は遊離糖鎖の濃縮方法であって、試料溶解・希釈液、カラム洗浄液、及び溶出液として含水極性有機溶媒を用いる、方法を提供する。
I-1. 試料添加工程
まず、糖タンパク質を適当な酵素で消化して調製した糖ペプチド含有試料、及び試料溶解・希釈液を糖鎖濃縮カラムに添加する。試料溶解・希釈液のアセトニトリル濃度は上記した通りであり、N結合型糖鎖の濃縮ではアセトニトリル濃度が75%以上88%未満の溶液を、O結合型糖鎖の濃縮ではアセトニトリル濃度が88%以上95%以下の溶液を用いる。糖ペプチド含有試料を試料溶解・希釈液中に溶解させてからカラムに添加してもよいし、糖ペプチド含有試料と試料溶解・希釈液を別々にカラムに加え、カラム内で糖ペプチド含有試料を試料溶解・希釈液に溶解させてもよい。後者の場合、まず試料溶解・希釈液をカラムに加え、軽く遠心(フラッシュ)する等してカラム内のエアを取り除いた後、糖ペプチド含有試料をカラムに添加すればよい。
ついで、カラム洗浄液をカラムに添加し、上記と同様に圧力を印加してカラムを洗浄する。この工程により、目的とする糖ペプチド以外の夾雑物(糖鎖を有しないペプチドなど)が取り除かれ、ポリマー性ポリオール層内に糖ペプチドが選択的に濃縮保持される。カラム洗浄液のアセトニトリル濃度は上記した通りであり、N結合型糖鎖を有する糖ペプチドを濃縮する場合にはアセトニトリル濃度が75%以上88%未満の溶液を、O結合型糖鎖を有する糖ペプチドを濃縮する場合にはアセトニトリル濃度が88%以上95%以下の溶液を用いる。カラム洗浄液を添加後、一般的な200μLチップ専用の卓上遠心機を用いる場合には、20秒間程度遠心すればよい(この遠心処理も、アガロースのようにモノマー単位中のアルコール性ヒドロキシル基が少ないポリマー性ポリオールを用いた濃縮カラムの場合には、20〜30分程度など長く行う必要があり得る。)。この選択的濃縮工程は、複数回、例えば2〜5回程度実施することが望ましい。
夾雑物を除去した後、水性洗浄液をカラムに添加し、ポリマー性ポリオール層から固相抽出担体層に向かう方向の圧力をカラムに印加する。これにより、糖ペプチドが固相抽出担体層に濃縮される。この糖ペプチド再濃縮工程に用いる水性洗浄液は、使用前のカラム洗浄に用いる水性洗浄液と同様でよい。卓上遠心機を用いてカラムに圧力を加える場合、遠心時間はカラム洗浄工程と同程度か、やや長めに30〜40秒間程度としてもよい(この遠心処理も、アガロースのようにモノマー単位中のアルコール性ヒドロキシル基が少ないポリマー性ポリオールを用いた濃縮カラムの場合には、20〜30分程度など長く行う必要があり得る。)。この濃縮工程は1回行なえばよい。
次いで、固相抽出担体層に濃縮した糖ペプチドの溶出を行なう。この溶出工程では、溶出液をカラムに添加し、ポリマー性ポリオール層から固相抽出担体層に向かう方向の圧力をカラムに印加して糖ペプチドを溶出する。ここで用いる溶出液のアセトニトリル濃度は、選択的濃縮工程で用いるカラム洗浄液と同様である。当該溶出工程では、必要に応じ適当なアダプターを付けたシリンジにて、インレット側から圧力をかけて溶出させることが簡便であるが、試料添加工程、選択的濃縮工程及び再濃縮工程と同様に遠心して溶出液の回収を行なってもよい。この溶出工程は1回行えば十分であるが、2回ないし3回行なっても差し支えない。
基本的な手順は糖ペプチドの濃縮と同様である。相違点として、遊離糖鎖の濃縮の場合は再濃縮工程は省略される場合がある点、遊離糖鎖の溶出に用いる極性有機溶媒(ここで説明する例ではアセトニトリル)の濃度が糖ペプチドの溶出よりも低い点が挙げられる。以下、糖ペプチドの濃縮との相違点を中心に説明する。
まずは遊離糖鎖試料の調製について説明する。糖タンパク質を適当な酵素で消化して糖ペプチド含有試料を調製後、糖ペプチドから糖鎖を切断、遊離させる。糖鎖の切断には適当なグリコシダーゼを使用すればよく、必要に応じて2種以上のグリコシダーゼを組み合わせて用いてよい。N結合型糖鎖、O結合型糖鎖のいずれについても、それぞれ幅広く糖鎖を切断する技術が知られており、市販の試薬キット類も存在する。例えば、N結合型糖鎖の切断にはペプチドN-グリコシダーゼFを用いることができ、O結合型糖鎖の切断には、所望によりフコシダーゼやシアリダーゼ等と組み合わせてO-グリコシダーゼでの処理を行なえばよい。
カラム洗浄液のアセトニトリル濃度は試料溶解・希釈液と同様でよく、75〜95%程度、例えば75〜85%程度とすればよい。カラム洗浄液をカラムに添加して、上記と同様に圧力を印加してカラムを洗浄する。標識後の糖鎖試料には、未反応の標識物質、ペプチド消化断片が多量に含まれているが、この工程により目的とする糖鎖以外のこれらの夾雑物が取り除かれ、ポリマー性ポリオール層内に糖鎖が選択的に濃縮保持される。
遊離糖鎖の濃縮においては、この再濃縮工程は上記した通り省略されることがある。疎水性が2-ABと同程度である標識物質を用いた場合には、再濃縮工程は省略される。疎水性の強い標識物質を用いた標識方法(例えば、Waters社のGlycoWorks RapidFluor-MS N-Glycan kitなど)により遊離糖鎖を標識した場合には、I-3.と同様の手順で固相抽出担体層への遊離糖鎖の再濃縮を実施できる。この際に用いる水性洗浄液もI-3.と同様でよい。
遊離糖鎖の溶出に用いる溶出液は、先に記載した通り、アセトニトリル濃度を30〜80%程度、例えば40〜60%程度とすればよい。その他はI-4.と同様である。
1−1.セルロース微結晶−オクタデシル基結合シリカゲル重層カラムの作製
固相抽出担体としてオクタデシルシリル化シリカゲル(オクタデシル基結合シリカゲル)を、ポリマー性ポリオールとしてセルロース微結晶を用いて、以下の手順により糖ペプチド濃縮カラムを作製した。
セルロース微結晶(クロマトグラフィー用;Merck Millipore社、米国MA州Billerica)を50 mLのメディウム瓶に20mL入れ、蒸留水を50 mLとなるまで入れた。メディウム瓶を振り懸濁させた後、10分間静置し、上清を取り除いた。この操作を8回繰り返した。80%アセトニトリル/0.1% TFA溶液をメディウム瓶に50 mLとなるまで入れ、メディウム瓶を振り懸濁させた後、10分間静置し、上清を取り除いた。この操作を3回繰り返した。
GILSON社(米国WI州Middleton)の連続分注チップDISTRITIPS MINI 1250μLの先端を3mmほどカッターで切断し、80%アセトニトリル/0.1% TFA溶液に懸濁した洗浄済みセルロースを、連続分注器を用いてチップ内に吸入した。30秒ほど静置してセルロース微結晶を連続分注チップの下方に沈殿させた後、25μLずつSPE C-TIP(オクタデシル基結合シリカゲルがポリテトラフルオロエチレンにより先端部に固定化されたチップ、容量200μL)(日京テクノス株式会社、日本国東京)に分注した。セルロースを分注したSPE C-TIPを200μLチップ専用の卓上遠心機で遠心し、オクタデシル基結合シリカゲルの固相抽出ディスクの上にセルロース微結晶が重層されたチップを得た。このセルロース微結晶−オクタデシル基結合シリカゲル重層カラム(オクタデシル基結合シリカゲル層の体積0.000347 cm3、重量0.24 mg;セルロース微結晶層の体積0.025 cm3、重量13.0 mg)を糖ペプチド濃縮カラムとして糖ペプチドの濃縮に用いた。
固相抽出担体としてスチレンジビニルベンゼンポリマーを、ポリマー性ポリオールとしてセルロース微結晶を用いて、以下の手順により糖ペプチド濃縮カラムを作製した。
上記1−1.(1)と同じ手順でセルロース微結晶を洗浄した。
スチレンジビニルベンゼンポリマー(SDB)がポリテトラフルオロエチレンにより固定化された膜である3M社(米国MN州Maplewood)のエムポア(商品名) ディスク SDB-XCを平らな台に置き、18ゲージのシリンジ針(SIGMA-ALDRICH社、米国MS州St. Louis)を押し付けることでSDB膜を切り取った。このとき、切り取られたSDB膜はシリンジ針の内部にとどまる。シリンジ針を200 μLピペットチップ(深江化成、日本国東京)の先端まで挿入し、内径0.5 mmの棒をシリンジ針に挿入し、シリンジ針内部にとどまっていたSDB膜をシリンジ針から押し出すとともに、200 μLピペットチップの先端に押し付けることでSDB膜を200 μLピペットチップの先端に固定化した。
GILSON社(米国WI州Middleton)の連続分注チップDISTRITIPS MINI 1250μLの先端を3mmほどカッターで切断し、80%アセトニトリル/0.1% TFA溶液に懸濁した洗浄済みセルロースを、連続分注器を用いてチップ内に吸入した。30秒ほど静置してセルロース微結晶を連続分注チップの下方に沈殿させた後、25μLずつスチレンジビニルベンゼンチップに分注した。セルロースを分注したスチレンジビニルベンゼンチップを200μLチップ専用の卓上遠心機で遠心し、SDBの固相抽出ディスクの上にセルロース微結晶が重層されたチップを得た。このセルロース微結晶−スチレンジビニルベンゼン重層カラムを糖ペプチド濃縮カラムとして糖ペプチドの濃縮に用いた。
固相抽出担体として多孔性固体炭素材料の一例であるカーボン膜を、ポリマー性ポリオールとしてセルロース微結晶を用いて、以下の手順により糖ペプチド濃縮カラムを作製した。
上記1−1.(1)と同じ手順でセルロース微結晶を洗浄した。
カーボン(活性炭)がポリテトラフルオロエチレンにより固定化された膜である3M社(米国MN州Maplewood)のエムポア(商品名) カーボンを平らな台に置き、18ゲージのシリンジ針(SIGMA-ALDRICH社、米国MS州St. Louis)を押し付けることでカーボン膜を切り取った。このとき、切り取られたカーボン膜はシリンジ針の内部にとどまる。シリンジ針を200 μLピペットチップ(深江化成、日本国東京)の先端まで挿入し、内径0.5 mmの棒をシリンジ針に挿入し、シリンジ針内部にとどまっていたカーボン膜をシリンジ針から押し出すとともに、200 μLピペットチップの先端に押し付けることでカーボン膜を200 μLピペットチップの先端に固定化した。
GILSON社(米国WI州Middleton)の連続分注チップDISTRITIPS MINI 1250μLの先端を3mmほどカッターで切断し、80%アセトニトリル/0.1% TFA溶液に懸濁した洗浄済みセルロースを、連続分注器を用いてチップ内に吸入した。30秒ほど静置してセルロース微結晶を連続分注チップの下方に沈殿させた後、25μLずつカーボンチップに分注した。セルロースを分注したカーボンチップを200μLチップ専用の卓上遠心機で遠心し、カーボンの固相抽出ディスクの上にセルロース微結晶が重層されたチップを得た。このセルロース微結晶−カーボン重層カラムを糖ペプチド濃縮カラムとして糖ペプチドの濃縮に用いた。
固相抽出担体としてオクタデシル基結合シリカゲルを、ポリマー性ポリオールとしてアガロースビーズを用いて、以下の手順により糖ペプチド濃縮カラムを作製した。
GILSON社(米国WI州Middleton)の連続分注チップDISTRITIPS MINI 1250μLの先端を3mmほどカッターで切断し、GEヘルスケア社(英国、Little Chalfont)のアガロースビーズであるSepharose CL-4Bを、連続分注器を用いてチップ内に吸入した。30秒ほど静置してアガロースを連続分注チップの下方に沈殿させた後、25μLずつSPE C-TIP(逆相樹脂であるオクタデシル基結合シリカゲルがポリテトラフルオロエチレンにより先端部に固定化されたチップ、容量200μL)(日京テクノス株式会社、日本国東京)に分注した。アガロースを分注したSPE C-TIPを200μLチップ専用の卓上遠心機で遠心し、オクタデシル基結合シリカゲルの固相抽出ディスクの上にアガロースが重層されたチップを得た。このアガロース−オクタデシル基結合シリカゲル重層カラムを糖ペプチド濃縮カラムとして糖ペプチドの濃縮に用いた。
固相抽出担体としてオクタデシル基結合シリカゲルを、ポリマー性ポリオールとしてセルロース繊維の一例であるコットンを用いて、以下の手順により糖ペプチド濃縮カラムを作製した。
スズラン社(日本国、愛知県)のSカット綿をピンセットでつまみ、米粒大にしてSPE C-TIP(逆相樹脂であるオクタデシル基結合シリカゲルがポリテトラフルオロエチレンにより先端部に固定化されたチップ、容量200μL)(日京テクノス株式会社、日本国東京)に詰めた。得られたコットン−オクタデシル基結合シリカゲル重層カラムを糖ペプチド濃縮カラムとして糖ペプチドの濃縮に用いた。
2−1.N結合型糖鎖解析のための糖タンパク質酵素消化物の調製
N結合型糖鎖解析のための糖タンパク質酵素消化物を以下の手順により調製した。糖タンパク質として、α1アシドグリコプロテイン(ヒト血漿由来;SIGMA-ALDRICH、St. Louis、MI)、フェツイン(牛胎児血清由来;SIGMA-ALDRICH)、トランスフェリン(ヒト;SIGMA-ALDRICH)、IgG1(ヒトミエローマ由来;Wako、Osaka、Japan)、リボヌクレアーゼ B(SIGMA-ALDRICH、St. Louis、MI)を用いた。
O結合型糖鎖解析のための糖タンパク質酵素消化物を以下の手順により調製した。糖タンパク質としてフェツイン(牛胎児血清由来;SIGMA-ALDRICH)を用いた。
3−1.N結合型糖鎖解析のための糖ペプチドの濃縮
(1) 上記で製造した糖ペプチド濃縮カラム(セルロース微結晶−オクタデシル基結合シリカゲル重層カラム、セルロース微結晶−ポリスチレンジビニルベンゼン重層カラム、セルロース微結晶−多孔性グラファイト樹脂重層カラム、アガロース−オクタデシル基結合シリカゲル重層カラム、コットン−オクタデシル基結合シリカゲル重層カラム)に100μLの0.1% TFA溶液を入れ、200μLチップ専用の卓上遠心機にセットし、溶液をカラムに通過させ(30秒、アガロース−オクタデシル基結合シリカゲル重層カラムの場合だけ30分)、ポリマー性ポリオール(セルロース微結晶、アガロース、またはコットン)層を洗浄した。
(2) カラムに100μLの80%アセトニトリル/0.1% TFA溶液を入れ、200μLチップ専用の卓上遠心機にセットし、溶液をカラムに通過させ(20秒、アガロース−オクタデシル基結合シリカゲル重層カラムの場合だけ30分)、固相抽出担体層を洗浄した。
(3) カラムに100μLの80%アセトニトリル/0.1% TFA溶液を入れ、200μLチップ専用の卓上遠心機で2秒間遠心し、カラム内のエアを取り除いた。
(4) カラム内の80%アセトニトリル/0.1% TFA溶液に0.5μLの糖タンパク質消化物試料を加え溶解させ、20秒間(アガロース−オクタデシル基結合シリカゲル重層カラムの場合だけ30分)遠心した。
(5) カラムに100μLの80%アセトニトリル/0.1% TFA溶液を加え20秒間(アガロース−オクタデシル基結合シリカゲル重層カラムの場合だけ30分)遠心し、夾雑物を取り除いた。
(6) 上記(5)のステップをさらに2回繰り返した。
(7) カラムに100μLの0.1% TFAを加えて30秒間(アガロース−オクタデシル基結合シリカゲル重層カラムの場合だけ30分)遠心し、固相抽出担体層に糖ペプチドを濃縮させた。
(8) カラムに50μLの80%アセトニトリル/0.1% TFA溶液を加えて、アダプター付きのシリンジで1.5 mLチューブに糖ペプチドを溶出させ、遠心エバポレーターで乾燥した。アガロース−オクタデシル基結合シリカゲル重層カラムの場合は、カラムに50μLの80%アセトニトリル/0.1% TFA溶液を加えて、アダプターを介して1.5 mLチューブにカラムを固定し、30分遠心することで1.5 mLチューブに溶出液を集め、遠心エバポレーターで乾燥した。
(1) 上記で製造した糖ペプチド濃縮カラム(セルロース微結晶−オクタデシル基結合シリカゲル重層カラム)に100μLの0.1% TFA溶液を入れ、200μLチップ専用の卓上遠心機にセットし、溶液をチップに通過させ(30秒)、セルロース微結晶層を洗浄した。
(2) カラムに100μLの90%アセトニトリル/0.1% TFA溶液を入れ、200μLチップ専用の卓上遠心機にセットし、溶液をカラムに通過させ(20秒)、固相抽出担体層を洗浄した。
(3) カラムに100μLの90%アセトニトリル/0.1% TFA溶液を入れ、200μLチップ専用の卓上遠心機で2秒間遠心し、カラム内のエアを取り除いた。
(4) カラム内の90%アセトニトリル/0.1% TFA溶液に0.5μLの糖タンパク質消化物試料を加え溶解させ、20秒間遠心した。
(5) カラムに100μLの90%アセトニトリル/0.1% TFA溶液を加え20秒間遠心し、夾雑物を取り除いた。
(6) 上記(5)のステップをさらに2回繰り返した。
(7) カラムに100μLの0.1% TFAを加えて30秒間遠心し、固相抽出担体層に糖ペプチドを濃縮させた。
(8) カラムに50μLの90%アセトニトリル/0.1% TFAを加えて、アダプター付きのシリンジで1.5 mLチューブに試料を溶出させ、遠心エバポレーターで乾燥した。
(1) N結合型糖鎖ペプチド及びO結合型糖鎖ペプチドを濃縮し、乾燥させた試料を4μLの0.1% ギ酸水溶液に溶解させた。
5−1.遊離糖鎖試料の調製
50μgのIgG1(ヒトミエローマ由来;Wako、Osaka、Japan)、又はトランスフェリン(ヒト;SIGMA-ALDRICH)を、50μLの8 M 尿素を含む50 mM Tris-HCl、pH 8.0に溶解させた。0.5μLの500 mM ジチオスレイトール (DTT; Wako) を加え、25Cで30分間インキュベートした。その後、1.4μLの500 mM ヨードアセトアミド (Sigma-Aldrich) を加えて25℃で30分間インキュベートすることで、システインをアルキル化した。最後に、0.25μLの500 mM DTTを加えることでアルキル化を停止させた。余剰のDTT、尿素等を除くために、ゲルろ過カラムであるZeba(商標) 0.5 mL spin columnのマニュアルに従って脱塩を行った。そこに、2μgのtrypsin/Lys-C mix (Promega)を加えて37℃で16時間インキュベートすることで、IgG1、トランスフェリンを消化した。消化した試料は、固相抽出カラムであるOasis HLB 1cc Vac Cartridge, 30 mg Sorbent per Cartridge (Waters)のマニュアルに従って脱塩し、遠心エバポレーターで乾燥させた。
調製した2-AB標識糖鎖試料には,未反応の2-AB、ペプチド消化断片が多量に含まれている。セルロース微結晶をオクタデシル基結合シリカゲル(C18)に重層した200μLチップ (cellulose-C18 tip) を用いて2-AB標識糖鎖の選択的濃縮を以下の手順で行った。
(2) 100μLの80% ACN/0.1% TFAをcellulose-C18 tipに入れ、1秒間遠心(カラム内のエアの除去)を行った後、5μLの2-AB標識糖鎖試料(過剰の未反応2-AB、ペプチド消化断片を不純物として含む)をcellulose-C18 tipに入れ、20秒間遠心した。
(3) 100μLの80% ACN/0.1% TFAを加え、20秒遠心する作業を3回繰り返すことで、余剰の2-AB、ペプチド消化断片を除去し、2-AB標識糖鎖を選択的にセルロース微結晶層に濃縮させた。
(4) その後、50μLの50% ACNを加えて、専用のシリンジを用いて1.5 mLのチューブに溶液を回収した。
(5) この濃縮された2-AB標識糖鎖を遠心エバポレーターで乾燥させ、10μLの水に溶解させた。
濃縮された2-AB標識糖鎖は以下の手順でnanoLC/ESI/MS/MSを行った。
トラップカラム (PepMap100 C18 3μm、直径75μm×長さ20 mm; Thermo Scientific, 米国MA州) と分析カラム (Nano HPLC capillary column; 日京テクノス株式会社、日本国東京) を装着したナノ液体クロマトグラフ (EASY-nLC 1000; Thermo Scientific) をハイブリッド四重極オービトラップ質量分析計 (Q Exactive; Thermo Scientific) に接続し、溶解させた試料2μLをトラップカラムにインジェクション、脱塩した後、分析カラムで試料の分離を行った。試料の分離には、A溶媒に0.1% ギ酸水溶液、B溶媒0.1% ギ酸ACNを用いて、0分から60分でB溶媒0%からB溶媒45%のリニアグラジエント、60分から65分でB溶媒45%からB溶媒100%のリニアグラジエントを用いた。全測定を通じてポジティブイオンモード (印加電圧 2,000 V) で測定した。
2 ポリマー性ポリオール層
3 固相抽出担体層
4 遠心機
5 シリンジ
6 アダプター
Claims (17)
- カラム内に、固相抽出担体層と、その上に直接又は間接的に積層されたポリマー性ポリオール層とを含み、固相抽出担体層がカラムのアウトレット側に、ポリマー性ポリオール層がカラムのインレット側に配置される、糖鎖濃縮カラム。
- 固相抽出担体が少なくとも1種の逆相樹脂である、請求項1記載のカラム。
- 固相抽出担体が、オクタデシルシリル化シリカゲル、多孔性固体炭素材料、並びにスチレンジビニルベンゼン、ジビニルベンゼン、N含有メタクリレート、及びN-ビニルピロリドンから選択される少なくとも1種の官能基を有するポリマーから選択される少なくとも1種である、請求項1又は2記載のカラム。
- 固相抽出担体が、オクタデシルシリル化シリカゲル、多孔性固体炭素材料、スチレンジビニルベンゼンポリマー、ジビニルベンゼンポリマー、N含有メタクリレートポリマー、及びポリ(N-ビニルピロリドン)から選択される少なくとも1種である、請求項3記載のカラム。
- ポリマー性ポリオールが多糖高分子である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のカラム。
- 多糖高分子が、セルロース、アガロース、及びデキストランから選択される少なくとも1種である、請求項5記載のカラム。
- セルロースがセルロース微結晶又はセルロース繊維である、請求項6記載のカラム。
- 固相抽出担体層とポリマー性ポリオール層の体積比が1:12.5〜160である、請求項1〜7のいずれか1項に記載のカラム。
- カラム容量が100μL〜500μLである、請求項1〜8のいずれか1項に記載のカラム。
- ポリマー性ポリオール層の体積が5〜50μLである、請求項1〜9のいずれか1項に記載のカラム。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の糖鎖濃縮カラムに糖鎖含有試料及び試料溶解・希釈液を添加し、ポリマー性ポリオール層から固相抽出担体層に向かう方向の圧力をカラムに印加して、糖ペプチド又は遊離糖鎖をポリマー性ポリオール層に保持させる、試料添加工程;
カラム洗浄液をカラムに添加し、ポリマー性ポリオール層から固相抽出担体層に向かう方向の圧力をカラムに印加してカラムを洗浄することにより、夾雑物を除去してポリマー性ポリオール層内に糖ペプチド又は遊離糖鎖を濃縮保持させる、選択的濃縮工程;及び
溶出液をカラムに添加し、ポリマー性ポリオール層から固相抽出担体層に向かう方向の圧力をカラムに印加して糖ペプチドを溶出する、溶出工程
を含む、糖ペプチド又は遊離糖鎖の濃縮方法であって、試料溶解・希釈液、カラム洗浄液、及び溶出液として含水極性有機溶媒を用いる、方法。 - 糖ペプチドの濃縮方法であって、前記選択的濃縮工程に次いで、水性洗浄液をカラムに添加し、ポリマー性ポリオール層から固相抽出担体層に向かう方向の圧力をカラムに印加して、糖ペプチドを固相抽出担体層に濃縮する、再濃縮工程が行われる、請求項11記載の方法。
- 含水極性有機溶媒は、極性有機溶媒の濃度が75%〜95%である、請求項12記載の方法。
- 遊離糖鎖の濃縮方法であって、試料溶解・希釈液及びカラム洗浄液として用いる含水極性有機溶媒は、極性有機溶媒の濃度が75%〜95%であり、溶出液として用いる含水極性有機溶媒は、極性有機溶媒の濃度が40%〜60%である、請求項11記載の方法。
- 極性有機溶媒が、アセトニトリル及び低級アルコールから選択される少なくとも1種である、請求項11〜14のいずれか1項に記載の方法。
- カラムへの圧力の印加が遠心により行われる、請求項11〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のカラムを含む、糖鎖濃縮キット。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016095997 | 2016-05-12 | ||
JP2016095997 | 2016-05-12 | ||
JP2016169200 | 2016-08-31 | ||
JP2016169200 | 2016-08-31 | ||
PCT/JP2017/018037 WO2017195887A1 (ja) | 2016-05-12 | 2017-05-12 | 糖鎖濃縮カラム及び糖鎖濃縮方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2017195887A1 JPWO2017195887A1 (ja) | 2019-03-22 |
JP6849974B2 true JP6849974B2 (ja) | 2021-03-31 |
Family
ID=60267723
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018517094A Active JP6849974B2 (ja) | 2016-05-12 | 2017-05-12 | 糖鎖濃縮カラム及び糖鎖濃縮方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6849974B2 (ja) |
WO (1) | WO2017195887A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102665511B1 (ko) | 2018-06-26 | 2024-05-10 | 후지필름 가부시키가이샤 | 췌장암의 판정용 마커 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2563763T3 (es) * | 2011-02-10 | 2016-03-16 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Método para la purificación de un glicano y/o un glicoconjugado mediante cromatografía usando un algodón que comprende la fase estacionaria |
JP5804329B2 (ja) * | 2011-06-09 | 2015-11-04 | Jcrファーマ株式会社 | 糖蛋白質の分析法 |
JP2013142566A (ja) * | 2012-01-10 | 2013-07-22 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 糖鎖試料の調製方法 |
-
2017
- 2017-05-12 WO PCT/JP2017/018037 patent/WO2017195887A1/ja active Application Filing
- 2017-05-12 JP JP2018517094A patent/JP6849974B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2017195887A1 (ja) | 2017-11-16 |
JPWO2017195887A1 (ja) | 2019-03-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP3748340A1 (en) | Methods for the rapid preparation of labeled glycosylamines and for the analysis of glycosylated biomolecules producing the same | |
EP2616809B1 (en) | Isolation and deglycosylation of glycoproteins | |
JP5907540B2 (ja) | 綿を含む固定相を用いるクロマトグラフィーによりグリカン及び/又は複合糖質を精製するための方法 | |
JP5872768B2 (ja) | 糖鎖試料調製方法 | |
EP3821256B1 (en) | Detection and quantification of glycosylated peptides | |
JP6849974B2 (ja) | 糖鎖濃縮カラム及び糖鎖濃縮方法 | |
Wuhrer et al. | Two-dimensional HPLC separation with reverse-phase-nano-LC-MS/MS for the characterization of glycan pools after labeling with 2-aminobenzamide | |
WO2015033743A1 (ja) | 標識糖鎖試料の調製方法 | |
WO2012015028A1 (ja) | 抗体の糖鎖を調製する方法 | |
Wang et al. | Sulfonyl hydrazine-functionalized polymer as a specific capturer of reducing glycans from complex samples for high-throughput analysis by electrospray ionization mass spectrometry | |
US20190339236A1 (en) | Methods of detecting glycosaminoglycans | |
JP2013142566A (ja) | 糖鎖試料の調製方法 | |
JP2012189439A (ja) | 糖鎖試料の製造方法 | |
US20110015386A1 (en) | Permethylation of oligosaccharides | |
EP3961207A1 (en) | Method of fractionating a heterogeneous sample and apparatus for such a method | |
de Melo Rêgo et al. | PVA-Glutaraldehyde as support for lectin immobilization and affinity chromatography | |
JP2013224885A (ja) | シアロ糖鎖を含む糖鎖試料を液体クロマトグラフィー質量分析を用いて分析する方法 | |
Liu et al. | Integrated system for extraction, purification, and digestion of membrane proteins | |
Huang | Rapid Isolation and Quantification of Exosome and Lentivirus by Hydrophobic Interaction Chromatography on a Polyester Capillary-Channeled Polymer Fiber Stationary Phase | |
JP2024060941A (ja) | 糖鎖を標識する方法及びキット | |
Liu et al. | Preparation of Affinity Polymer Beads for Separating Sugary Proteins and Its Application | |
Böddi | Investigations of non-enzymatic glycation with new bioanalytical methods |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200309 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200309 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210216 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210225 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6849974 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |