JP5804329B2 - 糖蛋白質の分析法 - Google Patents
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Description
本発明は，セルロース膜を用いて，糖蛋白質を分解して得られたペプチド断片の混合物から，糖鎖が共有結合したペプチド（糖ペプチド）と糖鎖を有さないペプチドを分離するステップを含む，糖蛋白質の分析法に関する。
糖蛋白質の糖鎖の分析は，一般に，分析すべき糖蛋白質を２群に分け，トリプシン処理してペプチド断片とした後，一方をグリコシダーゼで処理してグリコシダーゼ処理群とし，他方をグリコシダーゼで処理をしないグリコシダーゼ非処理群とし，次いでこれらを逆相カラムクロマトグラフィーに付して分析し，両群それぞれについて得られた２つのクロマトグラムを比較することにより行われている。糖鎖が共有結合したペプチドの断片（糖ペプチド断片）はグリコシダーゼ処理により糖鎖が切断されるので，２つのクロマトグラムを比較したとき，溶出位置の移動するピークが糖ペプチド断片として同定される。次いで，ここで同定された糖ペプチド断片を含む逆相カラムクロマトグラフィーのピークに一致する画分のみを選択的に分取し，次いで分取した画分について，ペプチド分析及び糖鎖構造の解析を行うことにより，如何なる糖鎖がタンパク質の如何なる位置に結合しているかを分析することができる。
上記の分析方法は，糖蛋白質をトリプシンで処理してペプチドに分解し，これを逆相カラムクロマトグラフィーに供して分離する工程を含む。蛋白質のトリプシンによる切断箇所は，蛋白質の分子量すなわちペプチド鎖の長さが増加すると，それに従って概ね増加する傾向にある。従って，比較的分子量の大きい糖蛋白質をトリプシンで処理した場合，得られるペプチド断片の分子種が多くなり，逆相カラムクロマトグラフィーの結果得られるクロマトグラム上で，ペプチド断片の各分子種に対応するピークが重なり合い，分離されないという現象が生じる。２以上のピークが重複すると，個々のピークを分離して分取することができないので，そのピークに対応するペプチドの分析ができない。従って，このような糖蛋白質の分析は困難である。
糖蛋白質をトリプシンで処理して得られるペプチド断片から，糖ペプチド断片のみを予め分離し，この予め分離された糖ペプチド断片のみを逆相カラムクロマトグラフィーで分析することができれば，分析すべき糖蛋白質の分子量が比較的大きい場合であっても，その分析が可能となる。何故ならば，糖ペプチド断片は，糖蛋白質をトリプシンで処理して得られるペプチド断片の全分子種の一部であるので，糖ペプチド断片のみを予め分離することにより，逆相カラムクロマトグラフィーで分析したときに得られるクロマトグラム上でのピーク数を減少させることができるからである。その結果，各々のピークが重複する可能性が小さくなるので，比較的分子量の大きい糖蛋白質であっても，その分析が可能となる。
糖蛋白質，例えばヒト免疫グロブリンＧを，ヒドラジン処理することにより得られる糖鎖由来のオリゴ糖を，セルロースカラムクロマトグラフィーを用いて単離精製する方法が知られている（特許文献１，特許文献２参照）。例えば，特許文献１には，予め水及びメタノールで順次洗浄したセルロースカラムを，ブタノール：エタノール：水＝４：１：１（Ｖ／Ｖ）の混合液で平衡化させ，これに糖鎖由来のオリゴ糖を含む溶液を通してオリゴ糖を選択的にセルロースカラムに結合させ，カラムをブタノール：エタノール：水＝４：１：１（Ｖ／Ｖ）の混合液で洗浄した後に，エタノール／水＝１：１（Ｖ／Ｖ）の混合液でオリゴ糖を溶出させて回収する方法が開示されている。しかしながら，これらの文献には，糖蛋白質を分解して得られた糖ペプチドを単離精製する方法についての記載はない。
上記背景の下で，本発明の目的は，糖蛋白質を分解して得られたペプチド断片の混合物から，糖鎖が共有結合したペプチド（糖ペプチド）と糖鎖を有さないペプチドを分離するステップを含む，糖蛋白質の分析法を提供することである。
上記目的に向けた研究において，本発明者らは，糖蛋白質であるヒトイズロン酸２−スルファターゼを分解して得られたペプチド断片の混合物から，セルロース膜を用いて，簡易に糖ペプチド断片のみを分離できることを見出した。本発明は，これらの発見に基づいて完成されたものである。すなわち，本発明は以下を提供する。
（１）糖蛋白質を分析する方法であって，糖蛋白質をペプチド断片に分解するステップと，該ペプチド断片を含有する溶液をセルロース膜に通過させて，糖ペプチド断片を該セルロース膜に結合させるステップと，該セルロース膜に結合させた該糖ペプチド断片を，該セルロース膜から溶出させるステップとを含む，方法。
（２）該分解が，蛋白質分解酵素を用いて行われるものである，（１）の方法。
（３）該糖蛋白質が，リソソーム酵素，エリスロポエチン，卵胞刺激ホルモン，甲状腺刺激ホルモン，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，抗体からなる群から選択されるものである，（１）又は（２）の方法。
（４）該リソソーム酵素が，イズロン酸２−スルファターゼ，α−ガラクトシダーゼＡ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α−Ｌ−イズロニダーゼ，Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ（グルコシルセラミダーゼ），リソソーム酸性リパーゼ，酸性α−グルコシダーゼからなる群から選択されるものである，（３）の方法。
（５）該セルロース膜から溶出からさせた該糖ペプチド断片を，逆相クロマトグラフィーに付し，得られたクロマトグラム上のピークに相当する画分を分取するステップと，分取された該画分に含まれる該糖ペプチド断片について，アミノ酸配列を決定するするステップとを更に含むものである，（１）〜（４）の方法。
（１）糖蛋白質を分析する方法であって，糖蛋白質をペプチド断片に分解するステップと，該ペプチド断片を含有する溶液をセルロース膜に通過させて，糖ペプチド断片を該セルロース膜に結合させるステップと，該セルロース膜に結合させた該糖ペプチド断片を，該セルロース膜から溶出させるステップとを含む，方法。
（２）該分解が，蛋白質分解酵素を用いて行われるものである，（１）の方法。
（３）該糖蛋白質が，リソソーム酵素，エリスロポエチン，卵胞刺激ホルモン，甲状腺刺激ホルモン，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，抗体からなる群から選択されるものである，（１）又は（２）の方法。
（４）該リソソーム酵素が，イズロン酸２−スルファターゼ，α−ガラクトシダーゼＡ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α−Ｌ−イズロニダーゼ，Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ（グルコシルセラミダーゼ），リソソーム酸性リパーゼ，酸性α−グルコシダーゼからなる群から選択されるものである，（３）の方法。
（５）該セルロース膜から溶出からさせた該糖ペプチド断片を，逆相クロマトグラフィーに付し，得られたクロマトグラム上のピークに相当する画分を分取するステップと，分取された該画分に含まれる該糖ペプチド断片について，アミノ酸配列を決定するするステップとを更に含むものである，（１）〜（４）の方法。
本発明によれば，糖蛋白質を分解して得られたペプチド断片の混合物から，糖ペプチド断片と糖鎖を有さないペプチド断片の混合物から，簡易に糖ペプチド断片のみを分離できるので，比較的分子量の大きい糖蛋白質の分析を簡易に実施することができる。
本発明において，「糖ペプチド」というときは，糖とペプチドとが共有結合したものをいう。糖ペプチドは，糖蛋白質をプロテアーゼで加水分解して得られる他，天然にも尿中等に存在する。また，糖ペプチドは，酵素反応を含む化学反応により，糖鎖をペプチド鎖に人工的に付加することによっても得られる。また，本発明において，「ペプチド断片」というときは，蛋白質（糖蛋白質を含む）をプロテアーゼで加水分解して得られるペプチドのことをいい，「糖ペプチド断片」というときは，糖蛋白質をプロテアーゼで加水分解して得られる糖ペプチドのことをいう。ペプチド断片は糖ペプチド断片を含む概念である。また，本発明において，「糖蛋白質」というときは，糖と蛋白質とが共有結合した一群の物質の総称のことをいう。
本発明において，糖蛋白質の分解は，蛋白質を構成するペプチド結合の特定の位置を選択的又は優先的に切断する手法により行われる。かかる手法には，蛋白質分解酵素（ペプチダーゼ）を使用して糖蛋白質を分解する酵素法と，ペプチダーゼを使用せず臭化シアン等により糖蛋白質を分解する化学法がある。酵素法に使用できるペプチダーゼとして，トリプシン，キモトリプシン，リジルエンドペプチダーゼ，グルタミンエンドペプチダーゼ，ペプチジル−ＡＳＰメタロエンドペプチダーゼ等が好適であるが，特にトリプシンが好適である。化学法としては，臭化シアン，２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸又はｏ−ヨードソ安息香酸を用いて糖蛋白質を分解する手法が好適に使用できる。
糖蛋白質の分解は，分解して得られたペプチド断片のアミノ酸配列の決定等を目的とする場合，一般に，糖蛋白質を構成するペプチド鎖の一時構造を直鎖状にしてから実施する。従って，ジスルフィド結合を分子内に有する糖蛋白質を分解する場合，予めジスルフィド結合を切断し，且つジスルフィド結合が再構成されないようにＳＨ基をブロッキングして，糖蛋白質を直鎖状のペプチドとする。本発明において，かかるジスルフィド結合を切断し且つＳＨ基をブロッキングする手法として，蛋白質変性剤存在及び還元化剤存在下で，糖蛋白質にＳＨ基のブロッキング剤を反応させる方法が使用できる。当該目的が達成できる限り，使用できる蛋白質変性剤，還元化剤及びＳＨ基のブロッキング剤に特に限定はないが，蛋白質変性剤としてグアニジン塩酸塩，還元化剤としてジチオスレイトール及びＳＨ基のブロッキング剤としてヨード酢酸が好適に使用できる。
本発明において，分析される糖蛋白質は，特に限定はないが，好ましくはイズロン酸２−スルファターゼ，α−ガラクトシダーゼＡ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α−Ｌ−イズロニダーゼ，Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ（グルコシルセラミダーゼ），リソソーム酸性リパーゼ，酸性α−グルコシダーゼ等のリソソーム酵素，エリスロポエチン，卵胞刺激ホルモン，甲状腺刺激ホルモン，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，抗体であり，特に，組換え体技術を用いて合成されたヒト等の哺乳動物の糖蛋白質である。
糖蛋白質を分解して得られたペプチド断片の混合物は，当該混合物を含む溶液を，当該セルロース膜を通過させることによって，糖ペプチドと糖鎖を有さないペプチドとに分離できる。本発明において，使用できるセルロース膜に特に限定はないが，市販の親水性再生セルロース，例えばスパルタン（ＨＰＬＣサンプル前処理用シリンジフィルター，ワットマン社）が好適に使用できる。このとき，当該セルロース膜を通過させるペプチド断片の混合物は，予めブタノールとエタノールと水の混合液（溶解液）に溶解させたペプチド断片溶液とする。この溶解液のブタノールとエタノールと水の比率は，好ましくは，ブタノール：エタノール：水＝３〜５：０．５〜１．５：０．５〜１．５（Ｖ／Ｖ），より好ましくはブタノール：エタノール：水＝３．５〜４．５：０．８〜１．２：０．８〜１．２（Ｖ／Ｖ），更に好ましくは３．８〜４．２：０．９〜１．１：０．９〜１．１（Ｖ／Ｖ）である。また，当該セルロース膜は，ペプチド断片溶液を通過させる前に，予めブタノールとエタノールと水の混合液（平衡化液）で平衡化させる。この平衡化液のブタノールとエタノールと水の比率は，好ましくは，ブタノール：エタノール：水＝３〜５：０．５〜１．５：０．５〜１．５（Ｖ／Ｖ），より好ましくはブタノール：エタノール：水＝３．５〜４．５：０．８〜１．２：０．８〜１．２（Ｖ／Ｖ），更に好ましくは３．８〜４．２：０．９〜１．１：０．９〜１．１（Ｖ／Ｖ）である。当該平衡化液のブタノールとエタノールと水の比率は，溶解液のものと同一であることが望ましいが，異なってもよい。ペプチド断片溶液を平衡化液で平衡化させたセルロース膜に通過させると，該溶液中に含まれる糖ペプチド断片が選択的にセルロース膜に結合する一方，糖鎖を有さない糖ペプチド断片はセルロース膜を通過する。従って，通液を分取することにより，糖鎖を有さないペプチド断片を選択的に得ることができる。
ペプチド断片溶液を通過させた後，セルロース膜はブタノールとエタノールと水の混合液（洗浄液）で洗浄される。当該洗浄液のブタノールとエタノールと水の比率は，好ましくは，ブタノール：エタノール：水＝３〜５：０．５〜１．５：０．５〜１．５（Ｖ／Ｖ），より好ましくはブタノール：エタノール：水＝３．５〜４．５：０．８〜１．２：０．８〜１．２（Ｖ／Ｖ），更に好ましくは３．８〜４．２：０．９〜１．１：０．９〜１．１（Ｖ／Ｖ）である。当該洗浄液のブタノールとエタノールと水の比率は，平衡化液のものと同一であることが望ましいが，異なってもよい。このとき得られるセルロース膜を通過させた洗浄液には，糖鎖を有さないペプチド断片が含まれるので，これを，上記通液に合わせることにより，より効率よく糖鎖を有さないペプチド断片を選択的に得ることができる。
セルロース膜に結合した糖ペプチド断片は，セルロース膜の洗浄後，エタノールと水の混合液（溶出用液）をセルロース膜に通過させることにより溶出される。この溶出用液のエタノールの比率は，好ましくは，エタノール：水＝１：１〜９（Ｖ／Ｖ），より好ましくはエタノール：水＝１：１．５〜４（Ｖ／Ｖ），更に好ましくは１：１．８〜２．２（Ｖ／Ｖ），より更に好ましくは１：２（Ｖ／Ｖ）である。セルロース膜を通過させた溶出液を分取することにより，糖ペプチド断片を選択的に得ることができる。
セルロース膜を通過させた溶出液に含まれる糖ペプチド断片は，逆相クロマトグラフィーに付すことにより，分子種ごとに分離することができる。逆相クロマトグラフィーにより得られたクロマトグラム上の各ピークは糖ペプチド断片の各分子種に対応するので，各ピークに対応する画分を分取することにより，糖ペプチド断片を分子種ごとに分離できる。このようにして分離された糖ペプチド断片の各分子種については，エドマン分解等を用いた周知の方法により，そのアミノ酸配列を分析することができる。同様の分析は，上記通液に含まれる糖鎖を有さないペプチド断片についても行うことができる。更に，同時に糖鎖の分析を行うことにより，如何なる糖鎖がタンパク質の如何なる位置に結合しているかを分析することができる。
以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
〔ヒトイズロン酸−２−スルファターゼのトリプシン消化〕
組換え体ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｒｈｌ２Ｓ）の精製品を，公知の手法を用いて準備した（米国特許公報５７９８２３９）。０．１ｍｇのｒｈｌ２Ｓを，５０μＬの蛋白質溶解液（６６．８ｇのグアニジン塩酸塩，６．１ｇのトリスヒドロキシメチルアミノメタン及び０．３７２ｇのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを水に溶かし，１Ｎ塩酸でｐＨ８．５に調整した後，水を加えて１００ｍＬとしたもの）に溶解させた後，４μＬの還元化溶液（１０ｍｇのジチオスレイトールを５０μＬの蛋白質溶解液に溶かしたもの）を添加して振り混ぜ，室温で３０分間静置した。次いで，４μＬのブロッキング溶液（２５ｍｇのヨード酢酸を６０μＬの１Ｎ水酸化ナトリウムに溶かしたもの）を添加して振り混ぜ，遮光下，室温で３０分間静置した。次いで，反応物をゲルろ過カラムクロマトフィーに付して，ｒｈｌ２Ｓを含む画分を分取した。このときゲルろ過カラムクロマトフィーは，純水で平衡化させたＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（カラム径５ｍｍ，カラム長１５０ｍｍ，ＧＥヘルスケア）に反応物を付し，室温で流速１ｍＬ／分で水を流して，紫外吸光光度計で波長２１５ｎｍの吸光度をモニターしながら行った。分取したｒｈｌ２Ｓを含む画分を減圧乾固し，６５μＬの純水で溶解した後，５μＬの１ｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム水溶液を加えて振り混ぜた。次いで，１０μＬのトリプシン溶液（２５μｇのトリプシンを５０ｍＬの１ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸に溶かしたもの）を加えて振り混ぜ，２〜８℃で９時間静置して反応させた。トリプシン反応後，溶液を９５℃で５分間加熱してトリプシンを失活させ，これをトリプシン消化物とした。
組換え体ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｒｈｌ２Ｓ）の精製品を，公知の手法を用いて準備した（米国特許公報５７９８２３９）。０．１ｍｇのｒｈｌ２Ｓを，５０μＬの蛋白質溶解液（６６．８ｇのグアニジン塩酸塩，６．１ｇのトリスヒドロキシメチルアミノメタン及び０．３７２ｇのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを水に溶かし，１Ｎ塩酸でｐＨ８．５に調整した後，水を加えて１００ｍＬとしたもの）に溶解させた後，４μＬの還元化溶液（１０ｍｇのジチオスレイトールを５０μＬの蛋白質溶解液に溶かしたもの）を添加して振り混ぜ，室温で３０分間静置した。次いで，４μＬのブロッキング溶液（２５ｍｇのヨード酢酸を６０μＬの１Ｎ水酸化ナトリウムに溶かしたもの）を添加して振り混ぜ，遮光下，室温で３０分間静置した。次いで，反応物をゲルろ過カラムクロマトフィーに付して，ｒｈｌ２Ｓを含む画分を分取した。このときゲルろ過カラムクロマトフィーは，純水で平衡化させたＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（カラム径５ｍｍ，カラム長１５０ｍｍ，ＧＥヘルスケア）に反応物を付し，室温で流速１ｍＬ／分で水を流して，紫外吸光光度計で波長２１５ｎｍの吸光度をモニターしながら行った。分取したｒｈｌ２Ｓを含む画分を減圧乾固し，６５μＬの純水で溶解した後，５μＬの１ｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム水溶液を加えて振り混ぜた。次いで，１０μＬのトリプシン溶液（２５μｇのトリプシンを５０ｍＬの１ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸に溶かしたもの）を加えて振り混ぜ，２〜８℃で９時間静置して反応させた。トリプシン反応後，溶液を９５℃で５分間加熱してトリプシンを失活させ，これをトリプシン消化物とした。
ｒｈｌ２Ｓは，分子量約７７ｋＤの糖蛋白質であり，その分子内にトリプシンの切断部位を理論上４５箇所存在するので，ｒｈｌ２Ｓをトリプシン処理することにより生じるペプチド断片の数は少なくとも４６となる。ｒｈｌ２Ｓは，分子内に８箇所の糖鎖結合部位がある。糖鎖結合部位の中で，Ａｓｎ４８８とＡｓｎ５１２の間にはトリプシンの切断部位が存在しないので，ｒｈｌ２Ｓをトリプシン処理することにより生じる糖ペプチド断片の数は理論上７である。
〔ヒトイズロン酸−２−スルファターゼのグリコシダーゼ処理〕
上記のトリプシン消化物を二分し，その一方に５μＬのグリコシダーゼ試液（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を振り混ぜ，２〜８℃で３時間静置した。次いで溶液９５℃で５分間加熱してグリコシダーゼを失活させた。もう一方のトリプシン消化物は，グリコシダーゼ未処理とした。
上記のトリプシン消化物を二分し，その一方に５μＬのグリコシダーゼ試液（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を振り混ぜ，２〜８℃で３時間静置した。次いで溶液９５℃で５分間加熱してグリコシダーゼを失活させた。もう一方のトリプシン消化物は，グリコシダーゼ未処理とした。
〔セルロース膜による糖ペプチドの分離〕
グリコシダーゼ未処理のｒｈｌ２Ｓのトリプシン消化物を濃縮乾固し，１００μＬの蒸留水で溶解した後，１００μＬのエタノールと４００μＬのブタノールを順次加えて振り混ぜて，試料溶液とした。５ｍＬ容量のシリンジ（テルモシリンジ針無し５ｍＬ ＳＳ−０５ＳＺ）に水を５ｍＬ吸い取り，これにセルロース膜（スパルタン３０，ワットマン社）を取り付けて，シリンジのピストンをゆっくりと押し下げて圧を加え，セルロース膜に水を通した。次いで，同様にして，エタノール：水＝１：２（Ｖ／Ｖ）の混合液（溶出用液）５ｍＬ，次いでブタノール：エタノール：水＝４：１：１（Ｖ／Ｖ）の混合液（平衡化液）５ｍＬをセルロース膜に通して，セルロース膜を平衡化させた。次いで，同様にして試料溶液をセルロース膜に通し，通液を回収した（通液１）。次いで，５ｍＬの平衡化液をセルロース膜に通し，通液を回収した（通液２）。次いで５ｍＬの溶出用液をセルロース膜に通し，溶出液を回収した。通液１と２を合わせて通液とした。
グリコシダーゼ未処理のｒｈｌ２Ｓのトリプシン消化物を濃縮乾固し，１００μＬの蒸留水で溶解した後，１００μＬのエタノールと４００μＬのブタノールを順次加えて振り混ぜて，試料溶液とした。５ｍＬ容量のシリンジ（テルモシリンジ針無し５ｍＬ ＳＳ−０５ＳＺ）に水を５ｍＬ吸い取り，これにセルロース膜（スパルタン３０，ワットマン社）を取り付けて，シリンジのピストンをゆっくりと押し下げて圧を加え，セルロース膜に水を通した。次いで，同様にして，エタノール：水＝１：２（Ｖ／Ｖ）の混合液（溶出用液）５ｍＬ，次いでブタノール：エタノール：水＝４：１：１（Ｖ／Ｖ）の混合液（平衡化液）５ｍＬをセルロース膜に通して，セルロース膜を平衡化させた。次いで，同様にして試料溶液をセルロース膜に通し，通液を回収した（通液１）。次いで，５ｍＬの平衡化液をセルロース膜に通し，通液を回収した（通液２）。次いで５ｍＬの溶出用液をセルロース膜に通し，溶出液を回収した。通液１と２を合わせて通液とした。
〔逆相カラムクロマトグラフィーによる分析〕
上記の操作で得られた溶出液及び通液を減圧乾固した後，１００μＬの純水に溶解してサンプル溶液とし，これを逆相クロマトグラフィーに３０μＬ付して分析した。逆相クロマトグラフィーは，逆相カラム（Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ５４，内径４．６ｍｍ，長さ２５０ｍｍ，粒径５μｍ，Ｇｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ社）を取り付けた高速液体クロマトグラフ装置（島津ＨＰＬＣシステムＬＣ−２０Ａ）を用いて行った。移動相Ａを０．１％トリフルオロ酢酸水溶液，移動相Ｂを０．１％トリフルオロ酢酸−７０％アセトニトリル水溶液とし，移動相Ａと移動相Ｂを〔移動相Ａ：移動相Ｂ＝９８：２（Ｖ／Ｖ）〕の比率で混ぜた混合液で逆相カラムを平衡化させた後，サンプル溶液をそれぞれ付した。４６分間かけて移動相Ａと移動相Ｂの移動相における移動相Ｂの比率を２％から６０％まで直線的に上昇させ，更に，７分間かけて移動相における移動相Ｂの比率を９９％にまで直線的に上昇させ，続いて移動相Ｂの比率を９９％とした移動相を１２分間流した。このとき，移動相の流速を０．５ｍＬ／分，カラム温度を５０℃に設定し，カラム出口からの流路に蛍光検出器を設置し，２１５ｎｍの吸光度を記録してクロマトグラムを作成した。
またグルコシダーゼ処理したトリプシン消化物と，グルコシダーゼ未処理のトリプシン消化物とを，セルロース膜に通過させることなく，そのままサンプル溶液とし，これを逆相クロマトグラフィーに１０μＬ付して上記と同様にしてそれぞれ分析した。
上記の操作で得られた溶出液及び通液を減圧乾固した後，１００μＬの純水に溶解してサンプル溶液とし，これを逆相クロマトグラフィーに３０μＬ付して分析した。逆相クロマトグラフィーは，逆相カラム（Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ５４，内径４．６ｍｍ，長さ２５０ｍｍ，粒径５μｍ，Ｇｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ社）を取り付けた高速液体クロマトグラフ装置（島津ＨＰＬＣシステムＬＣ−２０Ａ）を用いて行った。移動相Ａを０．１％トリフルオロ酢酸水溶液，移動相Ｂを０．１％トリフルオロ酢酸−７０％アセトニトリル水溶液とし，移動相Ａと移動相Ｂを〔移動相Ａ：移動相Ｂ＝９８：２（Ｖ／Ｖ）〕の比率で混ぜた混合液で逆相カラムを平衡化させた後，サンプル溶液をそれぞれ付した。４６分間かけて移動相Ａと移動相Ｂの移動相における移動相Ｂの比率を２％から６０％まで直線的に上昇させ，更に，７分間かけて移動相における移動相Ｂの比率を９９％にまで直線的に上昇させ，続いて移動相Ｂの比率を９９％とした移動相を１２分間流した。このとき，移動相の流速を０．５ｍＬ／分，カラム温度を５０℃に設定し，カラム出口からの流路に蛍光検出器を設置し，２１５ｎｍの吸光度を記録してクロマトグラムを作成した。
またグルコシダーゼ処理したトリプシン消化物と，グルコシダーゼ未処理のトリプシン消化物とを，セルロース膜に通過させることなく，そのままサンプル溶液とし，これを逆相クロマトグラフィーに１０μＬ付して上記と同様にしてそれぞれ分析した。
〔分析結果〕
通液と溶出液を逆相クロマトグラフィーに付したときのそれぞれのクロマトグラムを比較したところ，両者で得られるピークの位置が異なり，セルロース膜によって，糖鎖を有さないペプチド断片が通液に，糖ペプチド断片が溶出液に分取され，糖の有無によってペプチド断片が分離されたことが示唆された（図１）。
通液と溶出液を逆相クロマトグラフィーに付したときのそれぞれのクロマトグラムを比較したところ，両者で得られるピークの位置が異なり，セルロース膜によって，糖鎖を有さないペプチド断片が通液に，糖ペプチド断片が溶出液に分取され，糖の有無によってペプチド断片が分離されたことが示唆された（図１）。
次いで，グリコシダーゼ未処理のトリプシン消化物と，グリコシダーゼ処理をしたトリプシン消化物とを，セルロース膜に通すことなく，逆相クロマトグラフィーに付したときのそれぞれのクロマトグラムを比較したところ，グリコシダーゼ処理の有無により移動又は消失するピークがあった（図２）。グリコシダーゼ処理の有無により移動又は消失するピークは，糖ペプチド断片に由来するピークであると考えられた。そこで，図１の溶出液のクロマトグラムと，図２のグリコシダーゼ未処理のトリプシン消化物のクロマトグラムとを比較した（図３）。その結果，溶出液のクロマトグラムの各ピークは，グリコシダーゼ未処理のトリプシン消化物のクロマトグラムにおける糖ペプチド断片に由来すると考えられたピーク（図中矢印で示す）とほぼ一致することがわかった。
次いで，溶出液を付したときのクロマトグラムで得られた，糖ペプチド断片に由来すると考えられた図中矢印で示した７つのピークに対応する画分を分取し，それぞれアミノ酸分析を行った。その結果，これらの７つの画分に含まれるペプチド断片のアミノ酸配列は，理論上ｒｈｌ２Ｓをトリプシン処理したときに生じると想定された７つの糖ペプチド断片のアミノ酸配列と一致した。
以上の結果から，ｒｈｌ２Ｓをトリプシン消化することにより生じるペプチド断片から，セルロース膜を用いて，糖ペプチド断片と糖を有さないペプチド断片が，それぞれ溶出液と通液に分離されたことがわかった。また，分離された糖ペプチド断片を逆相クロマトグラフィーで更に分離することにより，各糖ペプチド断片のアミノ酸配列を決定することができることがわかった。以上のことから，糖蛋白質をペプチド断片に分解した後，該ペプチド断片を含有する溶液をセルロース膜に通過させて，糖ペプチド断片を該セルロース膜に結合させるステップを，糖蛋白質の分析法における１ステップとして組み込むことが，糖蛋白質の分析方法として有効であることがわかった。
本発明によれば，糖蛋白質を分解して得られたペプチド断片の混合物から，糖ペプチド断片と糖鎖を有さないペプチド断片を簡便に分離することができるので，医薬品等に用いる糖蛋白質の分析法として使用することができる。
Claims (6)
- 糖蛋白質を分析する方法であって，糖蛋白質をペプチド断片に分解するステップと，該ペプチド断片を含有する溶液をセルロース膜に通過させて，糖ペプチド断片を該セルロース膜に結合させるステップと，該セルロース膜に結合させた該糖ペプチド断片を，該セルロース膜から溶出させるステップと，該セルロース膜から溶出させた該糖ペプチド断片を，逆相クロマトグラフィーに付し，得られたクロマトグラム上のピークに相当する画分を分取するステップと，分取された該画分に含まれる該糖ペプチド断片について，アミノ酸配列を決定するステップとを含む，方法。
- 該分解が，蛋白質分解酵素を用いて行われるものである，請求項１の方法。
- 該糖蛋白質が，リソソーム酵素，エリスロポエチン，卵胞刺激ホルモン，甲状腺刺激ホルモン，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，抗体からなる群から選択されるものである，請求項１又は２の方法。
- 該リソソーム酵素が，イズロン酸２−スルファターゼ，α−ガラクトシダーゼＡ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α−Ｌ−イズロニダーゼ，Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ（グルコシルセラミダーゼ），リソソーム酸性リパーゼ，酸性α−グルコシダーゼからなる群から選択されるものである，請求項３の方法。
- 該糖ペプチド断片の該セルロース膜からの該溶出が，エタノールと水の混合液をセルロース膜に通過させることにより行われるものである，請求項１乃至４のいずれかの方法。
- 該混合液におけるエタノールと水の比率が，エタノール：水＝１：１．５〜４（Ｖ／Ｖ）であるものである，請求項５の方法。
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