JP7143190B2 - 酸性基を有する糖鎖の分析法 - Google Patents
酸性基を有する糖鎖の分析法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7143190B2 JP7143190B2 JP2018213384A JP2018213384A JP7143190B2 JP 7143190 B2 JP7143190 B2 JP 7143190B2 JP 2018213384 A JP2018213384 A JP 2018213384A JP 2018213384 A JP2018213384 A JP 2018213384A JP 7143190 B2 JP7143190 B2 JP 7143190B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- column
- carrier
- sugar chains
- sugar chain
- bap
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/282—Porous sorbents
- B01J20/283—Porous sorbents based on silica
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
- B01D15/18—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns
- B01D15/1864—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns using two or more columns
- B01D15/1871—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns using two or more columns placed in series
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/30—Partition chromatography
- B01D15/305—Hydrophilic interaction chromatography [HILIC]
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
- B01D15/363—Anion-exchange
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/282—Porous sorbents
- B01J20/285—Porous sorbents based on polymers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3214—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the method for obtaining this coating or impregnating
- B01J20/3217—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond
- B01J20/3219—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond involving a particular spacer or linking group, e.g. for attaching an active group
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
- B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
- B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
- B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
- B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J41/00—Anion exchange; Use of material as anion exchangers; Treatment of material for improving the anion exchange properties
- B01J41/04—Processes using organic exchangers
- B01J41/05—Processes using organic exchangers in the strongly basic form
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J41/00—Anion exchange; Use of material as anion exchangers; Treatment of material for improving the anion exchange properties
- B01J41/04—Processes using organic exchangers
- B01J41/07—Processes using organic exchangers in the weakly basic form
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J41/00—Anion exchange; Use of material as anion exchangers; Treatment of material for improving the anion exchange properties
- B01J41/08—Use of material as anion exchangers; Treatment of material for improving the anion exchange properties
- B01J41/12—Macromolecular compounds
- B01J41/14—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving unsaturated carbon-to-carbon bonds
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J41/00—Anion exchange; Use of material as anion exchangers; Treatment of material for improving the anion exchange properties
- B01J41/20—Anion exchangers for chromatographic processes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
- G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/38—Flow patterns
- G01N30/46—Flow patterns using more than one column
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/38—Flow patterns
- G01N30/46—Flow patterns using more than one column
- G01N30/461—Flow patterns using more than one column with serial coupling of separation columns
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/74—Optical detectors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N2030/067—Preparation by reaction, e.g. derivatising the sample
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
- G01N2030/8836—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving saccharides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
1.酸性糖鎖を分離するために用いられるカラムクロマトグラフィー用カラムであって,該カラムは,第1のカラムの流出口の下流に第2のカラムを流路により連結させてなるものであり,且つ,以下の(1)又は(2)から選択されるもの:
(1)該第1のカラムの担体が,疎水性に修飾されたシリカであって,且つ第一級アミン,第二級アミン又は/及び第三級アミンを含む基を有するシリカ(担体1)であり,
該第2のカラムの担体が,第一級アミン,第ニ級アミン又は/及び第三級アミンを含む基を有する樹脂(担体2)であるもの;
(2)該第1のカラムの担体が,第一級アミン,第ニ級アミン又は/及び第三級アミンを含む基を有する樹脂(担体2)であり,
該第2のカラムの担体が,疎水性に修飾されたシリカであって,且つ第一級アミン,第ニ級アミン又は/及び第三級アミンを含む基を有するシリカ(担体1)であるもの。
2.該第1のカラム及び第2のカラムが,いずれも親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムとしての性質を有するものである,上記1のカラム。
3.該担体2が,陰イオン交換樹脂としての性質を有するものである,上記1又は2のカラム。
4.該担体1が,一般式[I]で示される疎水基と,一般式[II]で示されるアミノ基とを有するものである,上記1~3のいずれかのカラム。
5.該担体2が,一般式[III]で示されるアミノ基を有するものである,上記1~4のいずれかのカラム。
6.該樹脂が,ポリビニルアルコールを基材とするものである,上記1~5のいずれかのカラム。
7.酸性糖鎖を分離する方法であって,
該酸性糖鎖を,アミノピリジン標識するステップと,
該アミノピリジン標識した酸性糖鎖を,上記1~6のいずれかのカラムを用いたカラムクロマトグラフィーに負荷し,次いで,該カラムからの流出液を,連続的に流路に導き,該流路中を流れる該流出液の蛍光強度を連続的に測定するステップであって,該カラムクロマトグラフィーが,移動相を疎水性の高い第1の移動相から疎水性の低い第2の移動相に継時的に変化させながら該カラムに通して行われるものであるステップと,
該測定により得られるクロマトグラムにおいて,該酸性糖鎖に対応する蛍光強度のピークを同定するステップとを含む,
方法。
8.該酸性糖鎖が,糖蛋白質から切り出されたものである,上記7の方法。
9.該糖蛋白質が,リソソーム酵素である,上記8の方法。
(a)糖鎖プロファイル移動相A:
800 mLのアセトニトリルに20 mLの酢酸を加えて混合した後,アセトニトリルを加えて1 Lとしたものを,糖鎖プロファイル移動相Aとした。
800 mLの純水に50 mLの酢酸と30 mLのトリエチルアミンを加えて混合した後,2 M塩酸を加えてpHを調整し,更に純水を加えて1 Lとしたものを,糖鎖プロファイル移動相Bとした。このとき,pHが,2.5,3.0,3.5,及び4.0であるものを調製した。
hI2S-ヒト化抗hTfR抗体融合蛋白質発現用ベクターは,配列番号1で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号2で示されるアミノ酸配列を有する重鎖からなるヒト化抗hTfR抗体をコードする遺伝子配列を用いて構築した。
CHO細胞(CHO-K1:American Type Culture Collectionから入手)を,下記の方法により,GenePulser(Bio-Rad社)を用いて,実施例2で構築したpE-hygr(LC)とpE-neo(HC-I2S)との組み合わせで,形質転換させた。細胞の形質転換は概ね以下の方法で行った。
I2S-抗hTfR抗体を,以下の方法で製造した。実施例3で得たhI2S-抗hTfR抗体発現株を,細胞密度が約2×105個/mLとなるように,4 mM L-アラニル-L-グルタミン,100 μmol/L ヒポキサンチン及び16 μmol/L チミジンを含有する,約200 Lの無血清培地(EX-CELL Advanced CHO Fed-batch Medium,Sigma Aldrich社)に懸濁させた。この細胞懸濁液の140 Lを培養槽に移した。培地をインペラ―で撹拌し,培地の溶存酸素濃度を約40%に保持し,34~37℃の温度範囲で,約11日間細胞を培養した。培養期間中,培地のグルコース濃度を監視し,培地のグルコース濃度が15 mmol/L未満となった場合には,直ちにグルコース濃度が約36 mmol/Lとなるように,グルコース溶液を培地に添加した。培養終了後に培地を回収した。回収した培地を,Millistak+HC Pod Filter grade D0HC(Merck社)でろ過し,更にMillistak+ HC Pod Filter(grade X0HC, Merck社)でろ過して,I2S-抗hTfR抗体を含む培養上清を得た。この培養上清を,PelliconTM 3 Cassette w/Ultracel PLCTK Membrane(孔径:30 kDa, 膜面積:1.14 m2,Merck社)を用いて限外ろ過して濃縮した。次いで,この濃縮液をOpticap XL600(0.22 μm, Merck社)を用いてろ過した。得られた液を濃縮培養上清とした。
濃縮培養上清を,0.5倍容の140 mM NaClを含有する20 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.0)を添加した後に,Millipak-200 Filter Unit(孔径:0.22 μm, Merck社)でろ過した。このろ過後の溶液を,カラム体積の4倍容の140 mM NaClを含有する20 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.0)で平衡化した,プロテインAアフィニティーカラムであるMabSelect SuRe LXカラム (カラム体積:約3.2 L, ベッド高:約20 cm, GE Healthcare社)に,200 cm/hrの一定流速で負荷し,I2S-抗hTfR抗体をプロテインAに吸着させた。
上記実施例5で得たI2S-抗hTfR抗体を0. 2mg採取し,減圧乾固させた後,50 μLの蛋白質溶解液(66.8 gのグアニジン塩酸塩,6.1 gのトリスヒドロキシメチルアミノメタン及び0.372 gのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを水に溶かし,1 N塩酸でpH 8.5に調整した後,水を加えて100 mLとしたもの)に溶解させた。次いで,4 μLの還元化溶液(10 mgのジチオスレイトールを50 μLの蛋白質溶解液に溶かしたもの)を添加して振り混ぜ,室温で30分間静置した。次いで,4 μLのヨード酢酸溶液(25 mgのヨード酢酸を60 μLの1 N水酸化ナトリウム水溶液に溶かしたもの)を添加して振り混ぜ,遮光下,室温で30分間静置した。次いで,反応物をゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して,I2S-抗hTfR抗体を含む画分を分取した。このときゲルろ過カラムクロマグラトフィーは,純水で平衡化させたSephadex(登録商標)G-25 superfine(カラム径5 mm,カラム長150 mm,GEヘルスケア)に反応物を付し,室温で流速1 mL/分で水を流して,紫外吸光光度計で波長215 nmの吸光度をモニターしながら行った。分取したI2S-抗hTfR抗体を含む画分を減圧乾固した。
上記実施例6で得た減圧乾固した還元アルキル化I2S-抗hTfR抗体に,70 μLの70 mmol/L重炭酸アンモニウム水溶液を加えて振り混ぜた。次いで,10 μLのトリプシン溶液(25 μgのトリプシンを50 mLの1 mmol/L塩酸に溶かしたもの)を加えて振り混ぜ,2~8℃で9時間静置して反応させた。次いで,溶液を95℃で5分間加熱してトリプシンを失活させ,これをトリプシン消化物とした。
上記実施例7で得たトリプシン消化物に,グリコシダーゼ溶液(N-グリコシダーゼを1,000 units/mLの濃度で純水に溶解させたもの)を5 μL加え,5℃で3時間静置して反応させた。次いで,溶液を95℃で5分間加熱してグリコシダーゼを失活させ,これをグリコシダーゼ消化物とした。
上記実施例8で得たグリコシダーゼ消化物に,20 μLの2-アミノピリジン溶液(150 mgの2-アミノピリジンを50 μLの酢酸に溶解したもの)を加えて振り混ぜ,80℃で1時間反応させた。次いで,20 μLのボラン-ジメチルアミン錯体溶液(20 mgのボラン-ジメチルアミン錯体を100 μLの酢酸に溶解したもの)を加えて振り混ぜ,80℃で1時間反応させた。次いで,100 μLのトルエンを加えて振り混ぜた後,遠心して,糖鎖を沈殿させるとともにトルエン層の上層を除去した。このトルエンによる抽出操作を,更に2回繰り返して行い,未反応の2-アミノピリジンを除去した。また,最後のトルエン抽出の際には,沈殿を残すようにして,可能な限りの溶液を除去した。ここで除去したトルエンを含む液は,有機溶媒廃棄用の容器に回収した。次いで,沈殿させた糖鎖を減圧乾固させた後,50 μLの水に溶解して糖鎖溶解液とし,これをゲルろ過カラムクロマグラトフィーに付して,アミノピリジン標識化糖鎖を含む画分を分取した。
実施例9で得た減圧乾固物に1 mLの純水を加えて溶解させた。これを0.5 mLずつ2本のチューブに分注し,減圧乾固させた後,80 μLの純水を加えて溶解させた。新しいチューブに溶解液を52 μL分取し,これに1 unitのアルカリフォスファターゼ(タカラバイオ社)及び6 μLの反応緩衝液(10 mMのMgCl2を含む500 mM Tris-HCl(pH 9.0))を加えて混合し,50℃で1時間反応させた。反応後の溶液30 μLに,75 μLの糖鎖プロファイル移動相A(実施例1で調製したもの)を加えて混合した。これを,アルカリフォスファターゼ処理試料(BAP処理試料)とした。また,別の新しいチューブに溶解液を52μL分取し,これに2 μLの純水及び6 μLの反応緩衝液(10 mMのMgCl2を含む500 mM Tris-HCl(pH 9.0))を加えて混合し,50℃で1時間反応させた。反応後の溶液30 μLに,75 μLの糖鎖プロファイル移動相Aを加えて混合させた。これを,アルカリフォスファターゼ(BAP)未処理試料(BAP未処理試料)とした。
実施例10で得た,BAP処理試料及びBAP未処理試料を,以下に示す条件(カラムクロマトグラフィー条件1及びカラムクロマトグラフィー条件2)でカラムに負荷し,それぞれの試料に含まれる糖鎖を分離,分析した。糖鎖プロファイル移動相A,及び糖鎖プロファイル移動相Bは,実施例1で調製したものである。なお,AsahipakTM NH2P-50 4Eは,ポリビニルアルコールを基材とし,官能基としてアミノ基が導入された樹脂を担体とする親水性相互作用クロマトグラフィー用カラム(順相カラムクロマトグラフィー用カラム)である。また,TSKgel NH2-100は,表面が疎水性に修飾されたシリカであって,且つ表面に官能基としてアミノアルキル基が導入されたものを担体とする親水性相互作用クロマトグラフィー用カラム(順相カラムクロマトグラフィー用カラム)である。
最初に,pH 2.5に調整した糖鎖プロファイル移動相Bを用いて,実施例11に示す方法により,酸性糖鎖の分離及び分析を実施した。その結果を図1に示す。カラムクロマトグラフィー条件1(クロマト条件1)での,BAP処理試料(図1中クロマトグラムA)及びBAP未処理試料(図1中クロマトグラムB)のクロマトグラムを比較すると,BAP未処理試料では確認できるが,BAP処理試料では確認できない,ピーク1及びピーク2がある。これらのピークはそれぞれ,1リン酸化糖鎖と2リン酸化糖鎖に対応する。BAP処理試料によりリン酸基が糖鎖から遊離するので,BAP処理試料ではこれらピークが消失する。次いで,カラムクロマトグラフィー条件2(クロマト条件2)での,BAP処理試料(図1中クロマトグラムC)及びBAP未処理試料(図1中クロマトグラムD)のクロマトグラムを比較すると,カラムクロマトグラフィー条件1の場合と同じく,BAP未処理試料では確認できるが,BAP処理試料では確認できない,それぞれ1リン酸化糖鎖と2リン酸化糖鎖に対応する,ピーク1及びピーク2がある。カラムクロマトグラフィー条件2では,カラムクロマトグラフィー条件1と比較して,ピーク1及びピーク2が出現するまでの溶出時間が長くなる傾向にある。
配列番号2:ヒト化抗hTfR抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号3:プライマーHyg-Sfi5’,合成配列
配列番号4:プライマーHyg-BstX3’,合成配列
配列番号5:ヒト化抗hTfR抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含む塩基配列,合成配列
配列番号7:抗hTfR抗体の重鎖とhI2Sの融合蛋白質をコードする塩基配列,合成配列
配列番号8:抗hTfR抗体の重鎖とhI2Sの融合蛋白質のアミノ酸配列
Claims (8)
- 第1のカラムの流出口の下流に第2のカラムを流路により連結させてなる,酸性糖鎖を分離するために用いられるカラムクロマトグラフィー用カラムであって,
該第1のカラムの担体が,疎水性に修飾されたシリカであって,且つ第一級アミン,第二級アミン又は/及び第三級アミンを含む基を有するシリカ(担体1)であり,
該第2のカラムの担体が,第一級アミン,第ニ級アミン又は/及び第三級アミンを含む基を有する陰イオン交換樹脂(担体2)であるもの。 - 該第1のカラム及び第2のカラムが,いずれも親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムとしての性質を有するものである,請求項1のカラム。
- 該樹脂が,ポリビニルアルコールを基材とするものである,請求項1~4のいずれかのカラム。
- 酸性糖鎖を分析する方法であって,
該酸性糖鎖を,アミノピリジン標識するステップと,
該アミノピリジン標識した酸性糖鎖を,請求項1~5のいずれかのカラムを用いたカラムクロマトグラフィーに負荷し,次いで,該カラムからの流出液を,連続的に流路に導き,該流路中を流れる該流出液の蛍光強度を連続的に測定するステップであって,該カラムクロマトグラフィーが,移動相を疎水性の高い第1の移動相から疎水性の低い第2の移動相に継時的に変化させながら該カラムに通して行われるものであるステップと,
該測定により得られるクロマトグラムにおいて,該酸性糖鎖に対応する蛍光強度のピークを同定するステップとを含む,
方法。 - 該酸性糖鎖が,糖タンパク質から切り出されたものである,請求項6の方法。
- 該糖タンパク質が,リソソーム酵素である,請求項7の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017219669 | 2017-11-15 | ||
JP2017219669 | 2017-11-15 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019090809A JP2019090809A (ja) | 2019-06-13 |
JP7143190B2 true JP7143190B2 (ja) | 2022-09-28 |
Family
ID=66539665
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018213384A Active JP7143190B2 (ja) | 2017-11-15 | 2018-11-14 | 酸性基を有する糖鎖の分析法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20200406229A1 (ja) |
EP (1) | EP3712609B1 (ja) |
JP (1) | JP7143190B2 (ja) |
WO (1) | WO2019098213A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7346201B2 (ja) * | 2019-09-25 | 2023-09-19 | 株式会社日立ハイテクサイエンス | アミノ酸の検出方法 |
JPWO2021230355A1 (ja) * | 2020-05-14 | 2021-11-18 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008309699A (ja) | 2007-06-15 | 2008-12-25 | Hitachi High-Technologies Corp | イオン交換および順相カラムによる2次元液体クロマトグラフ |
JP2010169691A (ja) | 2010-03-15 | 2010-08-05 | Mitsubishi Chemicals Corp | 糖鎖分離方法、検体分析方法、液体クロマトグラフィー装置、並びに糖鎖分析方法及び糖鎖分析装置 |
JP2015091953A (ja) | 2013-10-01 | 2015-05-14 | Jcrファーマ株式会社 | 2−アミノピリジンによる糖鎖の標識法 |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5057437A (en) * | 1988-07-27 | 1991-10-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Method for broad spectrum drug detection |
JPH08228795A (ja) * | 1994-12-27 | 1996-09-10 | Nakano Vinegar Co Ltd | 糖鎖分析用試料の調製方法及び該試料を用いた診断方法 |
JP3561351B2 (ja) * | 1995-11-02 | 2004-09-02 | 積水化学工業株式会社 | 糖類の分析方法 |
JP4393826B2 (ja) | 2003-09-19 | 2010-01-06 | 株式会社リコー | 現像装置、画像形成装置及びプロセスカートリッジ |
JP2005241389A (ja) | 2004-02-25 | 2005-09-08 | Ochiyanomizu Jiyoshi Univ | 蛍光標識糖鎖の特異的固定化試薬および固定化方法 |
CH706332B1 (de) | 2012-03-28 | 2015-10-15 | Zeochem Ag | Dotierte Materialien für die Umkehrphasen-Chromatographie. |
EP2745904B1 (en) * | 2012-12-21 | 2015-12-16 | Dionex Corporation | HILIC/Anion-Exchange/Cation-Exchange Multimodal Media |
WO2014144767A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Moderna Therapeutics, Inc. | Ion exchange purification of mrna |
EP3043905B1 (en) * | 2013-09-09 | 2018-06-20 | Lab-on-a-Bead AB | New diagnostic assay using particles with magnetic properties |
US10119944B2 (en) | 2013-12-24 | 2018-11-06 | Waters Technologies Corporation | Materials for hydrophilic interaction chromatography and processes for preparation and use thereof for analysis of glycoproteins and glycopeptides |
US11092574B2 (en) * | 2013-12-24 | 2021-08-17 | Waters Technologies Corporation | Materials for hydrophilic interaction chromatography and processes for preparation and use thereof for analysis of glycoproteins and glycopeptides |
CN105940298B (zh) | 2014-02-28 | 2018-05-04 | 昭和电工株式会社 | 液相色谱用填充剂及液相色谱用柱 |
-
2018
- 2018-11-14 US US16/763,285 patent/US20200406229A1/en not_active Abandoned
- 2018-11-14 EP EP18879360.8A patent/EP3712609B1/en active Active
- 2018-11-14 JP JP2018213384A patent/JP7143190B2/ja active Active
- 2018-11-14 WO PCT/JP2018/042064 patent/WO2019098213A1/ja unknown
-
2022
- 2022-12-29 US US18/147,894 patent/US11938464B2/en active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008309699A (ja) | 2007-06-15 | 2008-12-25 | Hitachi High-Technologies Corp | イオン交換および順相カラムによる2次元液体クロマトグラフ |
JP2010169691A (ja) | 2010-03-15 | 2010-08-05 | Mitsubishi Chemicals Corp | 糖鎖分離方法、検体分析方法、液体クロマトグラフィー装置、並びに糖鎖分析方法及び糖鎖分析装置 |
JP2015091953A (ja) | 2013-10-01 | 2015-05-14 | Jcrファーマ株式会社 | 2−アミノピリジンによる糖鎖の標識法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
DEGUCHI, K. et al.,Two-dimensional hydrophilic interaction chromatography coupling anion-exchange and hydrophilic interaction columns for separation of 2-pyridylamino derivatives of neutral and sialylated N-glycans,Journal of Chromatography A,2008年,Vol.1189,pp.169-174 |
KONDO, A. et al.,Separation of Pyridylamino Oligosaccharides by High-Performance Liquid Chromatography on an Amine-Bearing Silica Column,Analytical Biochemistry,1994年,Vol.219,pp.21-25 |
中川裕章,2/3次元マップ法による糖鎖構造解析,臨床化学,2005年,Vol.34,pp.319-325,特にp.321左欄3-7行 |
池上亨 他,親水性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)-開発の背景、および分離モードの特徴,Chromatography,2008年,Vol.29, No.2,pp.1-6 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20200406229A1 (en) | 2020-12-31 |
JP2019090809A (ja) | 2019-06-13 |
US11938464B2 (en) | 2024-03-26 |
US20230219063A1 (en) | 2023-07-13 |
WO2019098213A1 (ja) | 2019-05-23 |
EP3712609A4 (en) | 2021-08-18 |
EP3712609A1 (en) | 2020-09-23 |
EP3712609B1 (en) | 2023-12-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11938464B2 (en) | Analytical method for sugar chains having acidic groups | |
EP2768845B1 (en) | Separation method for fucosylated antibodies | |
JP2012162542A (ja) | 糖鎖誘導体の製造方法、構造解析方法、及び糖鎖誘導体 | |
Palanisamy et al. | Design, synthesis and characterisation of affinity ligands for glycoproteins | |
JP5109001B2 (ja) | α1,6フコース糖鎖の検出および分別方法 | |
JP6142973B1 (ja) | 糖タンパク質の糖鎖を調製する方法、キット及び装置 | |
US20220177582A1 (en) | Non-consensus glycosylation of bispecific antibodies | |
JP5804329B2 (ja) | 糖蛋白質の分析法 | |
US10260056B2 (en) | Cleavage of fucose in N-glycans | |
Barton et al. | Heterogeneity of IgGs: Role of Production, Processing, and Storage on Structure and Function | |
US20230193339A1 (en) | Preparation and Purification of Hypersialylated IGG | |
Tengattini et al. | Multi-approach LC-MS methods for the characterization of species-specific attributes of monoclonal antibodies from plants | |
RU2793400C2 (ru) | Способ очистки для удаления вариантов антител с сульфатированием тирозина; очищенные композиции | |
Allen | Development of Tools for Glycan Analysis and Quantitative Sialic Acid Glycomics | |
JP2023503442A (ja) | 無標識n-グリカン定量化方法 | |
Li et al. | Using capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate (CE‐SDS) and liquid chromatograph mass spectrometry (LC–MS) to identify glycosylated heavy chain heterogeneity in the anti‐VEGFR‐2 monoclonal antibody | |
WO2017018474A1 (ja) | コアフコース含有抗体の調製方法 | |
Zhang | LC-MS determination of glycosylation pattern on glycoproteins as critical quality attribute for biopharmaceuticals and potential markers for diseases | |
Grzeskowiak | 2-D DIGE to facilitate downstream process development for recombinant therapeutic antibodies | |
Settineri | Characterization of protein glycosylation by mass spectrometry |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210903 |
|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20220502 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220712 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220722 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220913 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220914 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7143190 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |