WO2015033743A1 - 標識糖鎖試料の調製方法 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method for preparing a labeled sugar chain sample, and more particularly to a method for efficiently preparing a labeled O-type sugar chain sample.
- Sugar chains include glucose (Glc), galactose (Gal), mannose (Man), fucose (Fuc), xylose (Xyl), N-acetylglucosamine (GlcNAc), N-acetylgalactosamine (GalNAc), sialic acid, etc.
- Glc glucose
- Gal mannose
- Man fucose
- Xyl xylose
- Xyl N-acetylglucosamine
- GalNAc N-acetylgalactosamine
- sialic acid etc.
- Sugar chains are very diverse and are substances involved in various functions of living organisms. Sugar chains often exist as complex carbohydrates bound to proteins and lipids in vivo, and in vivo sugar chains are deeply involved in cell-to-cell signal transduction, protein functions and interactions. It is becoming clear.
- Biopolymers with sugar chains include plant cell wall proteoglycans that contribute to cell stabilization, glycolipids that affect cell differentiation, proliferation, adhesion, migration, etc., and intercellular interactions and cell recognition. Glycoproteins involved, etc. can be mentioned, but the mechanism by which these high-molecular sugar chains control advanced and precise biological reactions while acting, assisting, amplifying, regulating, or inhibiting each other's functions gradually becomes clearer It is being done. Furthermore, once the relationship between such sugar chains and cell differentiation and proliferation, cell adhesion, immunity, and cell carcinogenesis is clarified, glycoengineering is closely related to medicine, cell engineering, or organ engineering. We can expect new developments.
- Non-Patent Documents 1 and 2 glycosyltransferase gene-disrupted mice involved in sugar chain biosynthesis reveals that sugar chains are essential for maintaining the functions of various tissues and organs. It is also known that various diseases are caused when an abnormality is observed in sugar chain modification (Non-patent Document 3). Since the structure of the sugar chain changes markedly depending on the canceration of cells and various diseases, it is expected to be used as a biomarker for examining the transition of diseases.
- Sugar chains are listed as one of the important quality characteristics for understanding biopharmaceuticals, and are said to be useful for ensuring the equivalence of biopharmaceuticals. For this reason, there is a demand for the introduction of a sugar chain analysis method for designing a biopharmaceutical manufacturing process and for in-process management.
- a sugar chain When a sugar chain is labeled (labeled), an excessive amount of a labeling reagent is often allowed to act on the sugar chain in order to increase the labeling efficiency. If an excessive labeling reagent is present in the sample solution, it will hinder HPLC measurement and mass spectrometry, so it must be removed in advance.
- a method for removing the reagent a method using monolithic silica is often used as a useful method.
- the method used as a conventional method has been studied for a sugar chain group called an N-type sugar chain (asparagine-linked sugar chain) among sugar chains, and is sufficient for capturing and collecting N-type sugar chains.
- An object of the present invention is to provide a method for preparing a labeled sugar chain sample, which can efficiently purify and recover a sugar chain group having a low molecular weight typified by an O-type sugar chain after a labeling reaction.
- the present inventors diluted the labeled sugar chain with a high concentration organic solvent and applied it to a silica-based support, and washed the support with a high concentration organic solvent. , By eluting the labeled sugar chain adsorbed on the carrier with a solution containing water, while reducing the loss of the labeled sugar chain (particularly, the labeled O-type sugar chain), Reagents, salts, additives, unlabeled substances, etc.) can be efficiently removed, and the present invention has been completed.
- the present invention provides the following.
- a method for preparing a labeled sugar chain sample (Step 1) a step of adsorbing a sugar chain component to a silica-based carrier by bringing a sample solution containing a labeled sugar chain into contact with the silica-based carrier; (Step 2) A step of washing the silica-based carrier with a washing liquid, (Step 3) A method in which an eluate is brought into contact with a silica-based carrier and the adsorbed sugar chain component is eluted, and the sample solution in Step 1 is a solution containing an organic solvent exceeding 95% by volume.
- a glycan for analyzing a labeled glycan sample prepared by the method according to any one of [1] to [13] by an analytical means such as HPLC, mass spectrometry, LC-MS, or capillary electrophoresis Analysis method.
- the recovery rate of labeled O-type sugar chains can be dramatically increased, and components other than the labeled sugar chains can be efficiently removed. Therefore, the present invention is useful for analysis of O-type sugar chains.
- FIG. 1 is a diagram showing an HPLC peak pattern of the 2AB-labeled glucose oligomer obtained as described above.
- the 2AB-labeled glucose oligomer adsorbed on monolithic silica was washed with 100% acetonitrile and then eluted with pure water.
- FIG. 2 is a diagram showing an HPLC peak pattern of the 2AB-labeled glucose oligomer obtained as described above.
- FIG. 3 is a diagram showing an HPLC peak pattern of the 2AB-labeled glucose oligomer obtained as described above.
- sugar chain sample As the sugar chain sample used in the present invention, for example, those prepared from biological samples such as whole blood, serum, plasma, urine, saliva, cells, tissues, viruses, plant tissues, and the like can be used. In addition, purified or prepared from unpurified glycoprotein can be used. As the sugar chain sample, a pure sugar chain purified separately may be used.
- a sugar chain from a glycoprotein contained in a biological sample for example, methods such as glycosidase treatment using N-glycosidase or O-glycosidase, hydrazine decomposition, and ⁇ elimination by alkali treatment can be used.
- a method using N-glycosidase is preferable.
- a protease treatment using trypsin, chymotrypsin, or the like may be performed.
- a method using hydrazine decomposition Prior to hydrazine degradation, protease treatment may be performed using trypsin or chymotrypsin.
- glycosyrene purification Prior to labeling the sugar chain, it is preferable to remove contaminants other than the sugar chain (eg, protein, peptide, nucleic acid, lipid, etc.).
- contaminants other than the sugar chain eg, protein, peptide, nucleic acid, lipid, etc.
- a method for removing impurities for example, gel filtration purification, ultrafiltration, dialysis, solid phase extraction using polarity, purification using an ion exchange resin, precipitation using a difference in solubility, and the like can be used.
- Purification using a solid phase carrier that selectively binds to a sugar chain for example, BlotGlyco BS-45601S manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd., see Non-patent Document 6
- the sugar chain may be labeled without removing impurities.
- the labeling reaction is preferably a reaction for labeling with any amino compound using, for example, a reductive amination reaction.
- the labeling reagent is preferably a substance containing a functional group such as an amino group, a hydrazide group, or an aminooxy group that is reactive with the reducing end of the sugar chain.
- the substance having an amino group is preferably selected from the group of compounds listed below, but is not limited thereto.
- the substance having a hydrazide group is preferably selected from the group of compounds listed below, but is not limited thereto.
- the substance having an aminooxy group is preferably selected from the group of compounds listed below, but is not limited thereto.
- N-aminooxyacetyl (tryptophyl) arginine methyl ester O-benzylhydroxylamine; O-phenylhydroxylamine; O- (2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl) hydroxylamine; O- (4-nitrobenzyl) hydroxylamine; 2-aminooxypyridine; 4-[(aminooxyacetyl) amino] benzoic acid methyl ester; 4-[(aminooxyacetyl) amino] benzoic acid ethyl ester; 4-[(aminooxyacetyl) amino] benzoic acid n-butyl ester; aminooxy-biotin.
- the conditions for the labeling reaction are not limited, but for example, it is preferable to add 10 equivalents or more of a labeling reagent to the sugar chain and perform the heating reaction in the presence of a reducing agent.
- the pH is preferably an acidic to neutral condition, more preferably 2 to 9, more preferably 2 to 8, and most preferably 2 to 7.
- the reaction temperature is preferably 4 to 90 ° C, more preferably 25 to 90 ° C, and further preferably 40 to 90 ° C.
- the reaction time is preferably 10 minutes to 24 hours, more preferably 10 minutes to 8 hours, and even more preferably 10 minutes to 3 hours.
- a reducing agent is not necessarily added.
- the pH is acidic to neutral, preferably 2 to 9, more preferably 2 to 8, and still more preferably 2 to 7.
- the reaction temperature is 4 to 90 ° C, preferably 30 to 90 ° C, more preferably 40 to 80 ° C.
- the concentration of the amino compound is 1 mM to 10M, preferably 10 mM to 10M, and more preferably 100 mM to 1M.
- the concentration of the reducing agent is 1 mM to 10M, preferably 10 mM to 10M, more preferably 100 mM to 2M.
- the reaction time is 10 minutes to 24 hours, preferably 10 minutes to 8 hours, and more preferably 1 hour to 3 hours.
- reducing agent for example, sodium cyanoborohydride, methylamine borane, dimethylamine borane, trimethylamine borane, picoline borane, pyridine borane, and the like can be used. It is preferable from the viewpoint of sex.
- the sample solution (labeled sugar chain solution) containing the labeled sugar chain prepared by the above method contains reagents, salts, additives, and unlabeled substances, it is difficult to directly perform the analysis. For this reason, it is necessary to remove these substances in advance before analysis.
- a removal method a sample solution containing a labeled sugar chain is brought into contact with a silica-based carrier having a silanol group to adsorb a sugar chain component to the silica-based carrier (step 1); the silica-based carrier is washed with a washing liquid.
- step 2 it is preferable to use a method including a step (step 2) of contacting the eluate with a silica-based carrier and eluting the adsorbed sugar chain component (step 3). Since the silica-based carrier has a silanol group, the labeled sugar chain can be efficiently captured. As a result, substances other than the labeled sugar chain (contaminants other than sugar chains, reagents, salts, additives, It is possible to prepare a labeled sugar chain sample from which unlabeled substances and the like are removed.
- the silica-based carrier according to the present invention may be any carrier containing silica, and may be composed only of silica or may be a silica-organic hybrid type.
- the shape is not particularly limited, and may be any of a particulate shape, a plate shape, a fiber shape, a porous shape, and the like.
- Monolithic silica is a silica that forms a filter-like porous continuum having a three-dimensional network structure. It has better liquid permeability than conventional particulate silica, and frit (bead blocking). There is an advantage that a member for use is not required and the dead volume is small (Japanese Patent Laid-Open No. 6-265534).
- Monolithic silica is preferably fixed to a columnar container or multiwell plate.
- the pore size of the monolithic silica is, for example, preferably such that the pores (through pores) continuous with each other have a diameter of 1 to 100 ⁇ m, more preferably 1 to 50 ⁇ m, still more preferably 1 to 30 ⁇ m. Most preferred is ⁇ 20 ⁇ m.
- a normal phase mode or a HILIC (Hydrophilic Interaction Chromatography) mode is preferable.
- Monolithic silica is used by injecting a sample solution containing a labeled sugar chain into a column or multiwell plate on which monolithic silica is fixed, and subjecting the sample solution to a monolithic silica part by methods such as natural dropping, suction, pressurization, and centrifugation. It is preferable that the glycan component is eluted by adding the eluate after washing with a washing solution.
- the sample solution applied to the silica-based support is preferably a solution containing an organic solvent exceeding 95% by volume, more preferably a solution containing 96% by volume or more of an organic solvent, 98 It is more preferable that the solution contains an organic solvent of not less than volume%, and it is particularly preferable that the solution contains 99% or more of an organic solvent.
- the organic solvent acetonitrile, hexane, ethyl acetate, methylene chloride, tetrahydrofuran and the like can be used, and acetonitrile is most preferable.
- the cleaning liquid is preferably a solution containing more than 95% by volume of an organic solvent and less than 5% by volume of water, more preferably a solution containing 96% by volume or more of an organic solvent and 4% by volume or less of water, More preferably, it is a solution containing 98% by volume or more of an organic solvent and 2% by volume or less of water, particularly preferably a solution containing 99% by volume or more of an organic solvent and 1% by volume or less of water, 100% Most preferably, the organic solvent.
- the organic solvent acetonitrile hexane, ethyl acetate, methylene chloride, tetrahydrofuran and the like can be used, and acetonitrile is most preferable.
- a silica-based carrier preferably monolithic silica
- the eluate preferably contains 10% by volume or more of water, more preferably contains 50% by volume or more of water, and most preferably water.
- the component other than water is preferably an organic solvent selected from, for example, acetonitrile and alcohols typified by methanol, ethanol, 2-propanol, and butanol.
- the recovered sugar chain solution (labeled sugar chain sample) can be concentrated, dried, or diluted as necessary to be used for various measurements.
- the obtained labeled sugar chain can be analyzed by mass spectrometry represented by MALDI-TOF MS.
- the obtained labeled sugar chain can be analyzed using HPLC or LC-MS.
- analysis by HPLC or LC-MS is particularly suitable.
- the obtained labeled sugar chain can be subjected to various analyzes such as capillary electrophoresis.
- Glucose oligomer which is a mixture of one or more glucose units
- BS-45601S hydrazide group-containing polymer beads
- acetonitrile containing 2% acetic acid was added.
- the mixture was reacted at 80 ° C. for 1 hour and dried.
- the polymer beads were washed with 2M guanidine hydrochloride solution, water, methanol, 1% triethylamine solution, 10% acetic anhydride / methanol solution was added, and reacted at room temperature for 30 minutes to cap the hydrazide group.
- the polymer beads were washed with methanol and water.
- Sugar beads were released from the beads by adding 20 ⁇ L of pure water and 180 ⁇ L of acetonitrile containing 2% acetic acid to the beads, and heating and drying at 80 ° C. for 1 hour.
- 50 ⁇ L of 2-aminobenzamide (2AB) solution solution dissolved in 30% (v / v) acetic acid / DMSO mixed solvent so as to be 350 mM 2-aminobenzamide, 1 M sodium cyanoborohydride
- 50 ⁇ L of this solution was added to the above beads and reacted at 80 ° C. for 2 hours to label the sugar chain with 2AB.
- the supernatant was recovered to obtain a 2AB-labeled sugar chain (2AB-labeled glucose oligomer) solution (including unreacted 2AB).
- Example 1 Reagents, salts, additives, and unlabeled substances were removed from the 2AB-labeled sugar chain solution using monolithic silica.
- “MonoFas spin column” manufactured by GL Sciences Inc. was used as monolithic silica.
- a disk-shaped monolithic silica filter with a through-pore diameter of 15 ⁇ m is fixed to the bottom of a tube having a capacity of about 1 mL.
- the sample solution is injected into the tube and centrifuged to obtain a fine monolithic silica solution. It is designed to pass through the hole.
- the 2AB-labeled sugar chain solution was diluted with acetonitrile (ACN) (acetonitrile concentration in the solution: 99% by volume), injected into a monolithic silica spin column, centrifuged through a table centrifuge, and allowed to adsorb the labeled sugar chain.
- ACN acetonitrile
- the column washing conditions were compared. When the column is washed with acetonitrile / water (95: 5, v / v), 50 ⁇ L of pure water is added to elute the adsorbed component, and the HPLC is performed (first condition, FIG. 1).
- the ratio of the peak area of Glc1 to the peak area of Glc7 under the first condition (FIG. 1) is 4.76
- the peak area of Glc1 with respect to the peak area of Glc7 under the second condition is 4.76
- the 2AB-labeled sugar chain solution contains about 5% DMSO and acetic acid.
- the influence of these components on the recovery of O-type sugar chains was investigated.
- 2AB-labeled glucose oligomer was converted to 1% DMSO / 99% acetonitrile (volume%, the same applies below), 5% DMSO / 95% acetonitrile, 10% DMSO / 90% acetonitrile, 1% acetic acid / 99% acetonitrile, 5% acetic acid / 95.
- the ratio of Glc1 to the peak area of Glc7 under the same conditions as in the method already described in Example 1, and the peak ratio of Glc1 to the peak area of Glc7 when the purified glucose oligomer was directly subjected to HPLC. Compared with the area ratio ( 4.03), the recovery rate of the O-type sugar chain was determined. Dissolve in 1% DMSO / 99% acetonitrile, 5% DMSO / 95% acetonitrile, 10% DMSO / 90% acetonitrile, 1% acetic acid / 99% acetonitrile, 5% acetic acid / 95% acetonitrile, 10% acetic acid / 90% acetonitrile.
- the ratio of the peak area of Glc1 to the peak area of Glc7 under each condition is 3.91, 2.58, 1.48, 3.57, 2.16, and 1.47, respectively.
- the rates were 97%, 64%, 37%, 89%, 54% and 36%, respectively.
- a reagent, salt, or additive that is a substance other than a labeled sugar chain while reducing a loss of the labeled sugar chain after labeling a sugar chain group having a small molecular weight typified by an O-type sugar chain
- Unlabeled substances can be efficiently removed, and quantitative analysis of not only N-type sugar chains but also O-type sugar chains becomes possible. Since it has been suggested that epitopes of many tumor markers are present on O-type sugar chains, the present invention provides, for example, diagnosis of diseases such as cancer and new biomarkers targeting sialo-sugar chains. Useful for development. Therefore, the present invention can greatly contribute to the medical field, for example.
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Abstract
標識糖鎖を高濃度の有機溶媒で希釈してシリカ系担体に適用し、当該担体を高濃度の有機溶媒で洗浄し、当該担体に吸着した標識糖鎖を水を含む溶液で溶出することにより、標識糖鎖(特にO型糖鎖)のロスを顕著に低減しつつ、標識糖鎖以外の物質(試薬、塩類、添加剤、未標識物など)を効率よく除去することが可能であることを見出した。
Description
本発明は、標識した糖鎖試料を調製する方法に関し、特に標識したO型糖鎖試料を効率的に調製する方法に関する。
糖鎖とは、グルコース(Glc)、ガラクトース(Gal)、マンノース(Man)、フコース(Fuc)、キシロース(Xyl)、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、シアル酸などの単糖およびこれらの誘導体が鎖状に連なった分子の総称である。
糖鎖は非常に多様性に富み、生物が有する様々な機能に関与する物質である。糖鎖は生体内でタンパク質や脂質などに結合した複合糖質として存在することが多く、生体内の糖鎖は細胞間情報伝達、タンパク質の機能や相互作用の調整などに深く関わっていることが明らかになりつつある。
糖鎖を有する生体高分子としては、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のプロテオグリカン、細胞の分化、増殖、接着、移動等に影響を与える糖脂質、および細胞間相互作用や細胞認識に関与している糖タンパク質等が挙げられるが、これらの高分子の糖鎖が、互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御する機構が次第に明らかにされつつある。さらに、このような糖鎖と細胞の分化増殖、細胞接着、免疫、および細胞の癌化との関係が明確にされれば、糖鎖工学と、医学、細胞工学、あるいは臓器工学と密接に関連させて新たな展開を図ることが期待できる。
病気を早期発見して生活の質(QOL)を高く保つためには、病気の発症の予防や推移を診断できるバイオマーカーが必要である。糖鎖生合成にかかわる糖転移酵素の遺伝子破壊マウスの解析から、糖鎖はさまざまな組織・器官の機能維持に必須であることが明らかにされている(非特許文献1,2)。また、糖鎖修飾に異常がみられると様々な疾病が引き起こされることも知られている(非特許文献3)。糖鎖の構造は細胞の癌化や様々な疾病によって著しく変化するので、疾病の推移を調べるためのバイオマーカーとしての利用が期待されている。
糖鎖はバイオ医薬品の理解に重要な品質特性の一つとしても挙げられており、バイオ医薬品の同等性の担保にも有益と言われている。そのため、バイオ医薬品の製造プロセスの設計や工程内管理として糖鎖分析法の導入を求める声もある。
糖鎖自体は蛍光性、紫外吸収性をもたないため、糖鎖を分析する際には予め標識を施すことが多い。糖鎖をHPLCあるいはHPLC-MSで分析する場合は、2-aminobenzamide誘導体化(2AB化)、2-aminopyridine誘導体化(PA化)などの蛍光標識を施すことが一般的である(非特許文献4)。また、糖鎖をMALDI-TOF MSで分析する場合にも、標識を施すことにより測定感度の向上を図ることが行われる(非特許文献5、6)。
糖鎖に標識を施す(ラベル化する)際には、標識効率を高めるため糖鎖に対して過剰量の標識試薬を作用させる場合が多い。試料溶液中に過剰の標識試薬が存在すると、HPLC測定や質量分析に支障をきたすため、あらかじめ除去する必要がある。試薬の除去法としてモノリスシリカを用いる方法が有用な方法として良く用いられている。従来法として用いられている方法は、糖鎖の中でもN型糖鎖(アスパラギン結合型糖鎖)と呼ばれる糖鎖群を対象に検討されており、N型糖鎖の捕捉回収には十分であるが、N型糖鎖よりも分子量が小さいO型糖鎖(セリン・スレオニン結合型糖鎖)と呼ばれる分子に関しては、捕捉回収の回収率が低く、O型糖鎖の定量的な解析は特に困難であり、高い回収率でO型糖鎖を回収できる方法が求められていた(非特許文献7~9)。
Ioffe E., Stanley P., Proc. Natl. Acad. Sci., 91, pp.728-732 (1994)
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本発明の目的は、O型糖鎖に代表される分子量の小さい糖鎖群を標識反応後、効率的に精製し、回収しうる、標識糖鎖試料の調製方法を提供することである。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、標識糖鎖を高濃度の有機溶媒で希釈してシリカ系担体に適用し、当該担体を高濃度の有機溶媒で洗浄し、当該担体に吸着した標識糖鎖を水を含む溶液で溶出することにより、標識糖鎖(特に、標識されたO型糖鎖)のロスを顕著に低減しつつ、標識糖鎖以外の物質(試薬、塩類、添加剤、未標識物など)を効率よく除去することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、より詳しくは、以下を提供するものである。
[1] 標識糖鎖試料を調製する方法であって、
(工程1)標識糖鎖を含む試料溶液をシリカ系担体と接触させることにより、シリカ系担体に糖鎖成分を吸着させる工程、
(工程2)シリカ系担体を洗浄液で洗浄する工程、
(工程3)シリカ系担体に溶出液を接触させ、吸着した糖鎖成分を溶出させる工程、を含み、工程1における試料溶液が95体積%を超える有機溶媒を含む溶液である方法。
(工程1)標識糖鎖を含む試料溶液をシリカ系担体と接触させることにより、シリカ系担体に糖鎖成分を吸着させる工程、
(工程2)シリカ系担体を洗浄液で洗浄する工程、
(工程3)シリカ系担体に溶出液を接触させ、吸着した糖鎖成分を溶出させる工程、を含み、工程1における試料溶液が95体積%を超える有機溶媒を含む溶液である方法。
[2] 前記工程1における試料溶液に含まれる有機溶媒がアセトニトリルである、[1]に記載の方法。
[3] 工程2における洗浄液が95体積%を超える有機溶媒および5体積%未満の水を含む溶液である、[1]または[2]に記載の方法。
[4] 前記工程2における洗浄液に含まれる有機溶媒がアセトニトリルである、[3]に記載の方法。
[5] 工程3における溶出液が1体積%以上の水を含む溶液である、[1]から[4]のいずれかに記載の方法。
[6] 工程3における溶出液が50体積%以上の水を含む溶液である、[5]に記載の方法。
[7] 工程3における溶出液が水である、[5]に記載の方法。
[8] 前記シリカ系担体がモノリスシリカである、[1]から[7]のいずれかに記載の方法。
[9] 標識糖鎖が、糖鎖の還元末端に、アミノ基、ヒドラジド基、またはアミノオキシ基を含む化合物を結合させたものである、[1]から[8]のいずれかに記載の方法。
[10] 標識糖鎖が、下記から選ばれる少なくとも一つのアミノ基含有化合物を、糖鎖の還元末端に結合させたものである、[9]に記載の方法。
2-aminopyridine; 2-aminobenzamide; 2-aminoanthranilic acid; 7-amino-1-naphthol; 3-(acetylamino)-6-aminoacridine; 9-aminopyrene-1,4,6-trisulfonic acid; 8-aminonaphtalene-1,3,6-trisulfonic acid; 7-amino-1,3-naphtalenedisulfonicacid: 2-amino-9(10H)-acridone; 5-aminofluorescein; Dansylethylenediamine; 7-amino-4-methylcoumarine; benzylamine。
2-aminopyridine; 2-aminobenzamide; 2-aminoanthranilic acid; 7-amino-1-naphthol; 3-(acetylamino)-6-aminoacridine; 9-aminopyrene-1,4,6-trisulfonic acid; 8-aminonaphtalene-1,3,6-trisulfonic acid; 7-amino-1,3-naphtalenedisulfonicacid: 2-amino-9(10H)-acridone; 5-aminofluorescein; Dansylethylenediamine; 7-amino-4-methylcoumarine; benzylamine。
[11] 標識糖鎖が、下記から選ばれる少なくとも一つのヒドラジド基含有化合物を、糖鎖の還元末端に結合させたものである、[9]に記載の方法。
2-aminobenzhydrazide; 2-hydrazinobenzoic acid; benzylhydrazine; 5-Dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl hydrazine(Dansylhydrazine); 2-hydrazinopyridine;9-fluorenylmethyl carbazate(Fmoc hydrazine); 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionoc acid, hydrazide; 2-(6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin)acetohydrazide; 7-diethylaminocoumarin-3-carboxylic acid, hydrazide(DCCH); phenylhydrazine;1-Naphthaleneacethydrazide; phenylacetic hydrazide。
2-aminobenzhydrazide; 2-hydrazinobenzoic acid; benzylhydrazine; 5-Dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl hydrazine(Dansylhydrazine); 2-hydrazinopyridine;9-fluorenylmethyl carbazate(Fmoc hydrazine); 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionoc acid, hydrazide; 2-(6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin)acetohydrazide; 7-diethylaminocoumarin-3-carboxylic acid, hydrazide(DCCH); phenylhydrazine;1-Naphthaleneacethydrazide; phenylacetic hydrazide。
[12] 標識糖鎖が、下記から選ばれる少なくとも一つのアミノオキシ基含有化合物を、糖鎖の還元末端に結合さたものである、[9]に記載の方法。
N-aminooxyacetyl(tryptophyl)arginine methyl ester; O-benzylhydroxylamine; Ophenylhydroxylamine;O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine; O-(4-nitrobenzyl)hydroxylamine; 2-aminooxypyridine; 2-aminooxymethylpyridine; 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid methyl ester; 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid ethyl ester; 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid n-butyl ester; aminooxy-biotin。
N-aminooxyacetyl(tryptophyl)arginine methyl ester; O-benzylhydroxylamine; Ophenylhydroxylamine;O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine; O-(4-nitrobenzyl)hydroxylamine; 2-aminooxypyridine; 2-aminooxymethylpyridine; 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid methyl ester; 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid ethyl ester; 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid n-butyl ester; aminooxy-biotin。
[13] [1]から[12]のいずれかに記載の方法によって調製された標識糖鎖試料。
[14] [1]から[13]のいずれかに記載の方法によって調製された標識糖鎖試料を、HPLC、質量分析、LC-MS、またはキャピラリ電気泳動法の分析手段によって分析する、糖鎖の分析方法。
本発明の方法によれば、標識されたO型糖鎖の回収率を飛躍的に高めることが可能となるとともに、標識した糖鎖以外の成分を効率よく除去することが可能となる。従って、本発明は、O型糖鎖の分析に有用である。
(糖鎖試料)
本発明において使用する糖鎖試料は、例えば全血、血清、血漿、尿、唾液、細胞、組織、ウイルス、植物組織などの生体試料から調製されたものを用いることができる。また、精製された、あるいは未精製の糖タンパク質から調製されたものを用いることができる。糖鎖試料としては、別途精製された純粋な糖鎖を用いてもよい。
本発明において使用する糖鎖試料は、例えば全血、血清、血漿、尿、唾液、細胞、組織、ウイルス、植物組織などの生体試料から調製されたものを用いることができる。また、精製された、あるいは未精製の糖タンパク質から調製されたものを用いることができる。糖鎖試料としては、別途精製された純粋な糖鎖を用いてもよい。
生体試料に含まれる糖タンパク質から糖鎖を遊離させる手段としては、例えば、N-グリコシダーゼあるいはO-グリコシダーゼを用いたグリコシダーゼ処理、ヒドラジン分解、アルカリ処理によるβ脱離などの方法を用いることができる。N型糖鎖の分析を行う場合は、N-グリコシダーゼを用いる方法が好ましい。グリコシダーゼ処理に先立って、トリプシンやキモトリプシンなどを用いたプロテアーゼ処理を行ってもよい。O型糖鎖の分析を行う場合は、ヒドラジン分解を用いる方法が好ましい。ヒドラジン分解に先立って、トリプシンやキモトリプシンなどを用いてプロテアーゼ処理を行ってもよい。
(糖鎖精製)
糖鎖を標識する前に、糖鎖以外の莢雑物(例えばタンパク質、ペプチド、核酸、脂質等)を除去することが好ましい。莢雑物の除去法としては、例えば、ゲルろ過精製、限外ろ過、透析、極性を利用した固相抽出、イオン交換樹脂による精製、溶解性の差を利用した沈殿などを用いることができる。糖鎖と選択的に結合する固相担体(例えば住友ベークライト(株)製 BlotGlyco BS-45601S、非特許文献6参照)による精製を用いることもできる。莢雑物の除去を行わずに糖鎖を標識してもよい。
糖鎖を標識する前に、糖鎖以外の莢雑物(例えばタンパク質、ペプチド、核酸、脂質等)を除去することが好ましい。莢雑物の除去法としては、例えば、ゲルろ過精製、限外ろ過、透析、極性を利用した固相抽出、イオン交換樹脂による精製、溶解性の差を利用した沈殿などを用いることができる。糖鎖と選択的に結合する固相担体(例えば住友ベークライト(株)製 BlotGlyco BS-45601S、非特許文献6参照)による精製を用いることもできる。莢雑物の除去を行わずに糖鎖を標識してもよい。
(糖鎖の標識)
糖鎖試料を、必要に応じて乾燥させたのち、標識試薬を加えて反応させて、糖鎖を標識することができる。標識反応は、例えば、還元的アミノ化反応を用いて任意のアミノ化合物で標識する反応であることが好ましい。標識試薬としては、糖鎖の還元末端と反応性を有するアミノ基、ヒドラジド基、アミノオキシ基等の官能基を含む物質が好ましい。
糖鎖試料を、必要に応じて乾燥させたのち、標識試薬を加えて反応させて、糖鎖を標識することができる。標識反応は、例えば、還元的アミノ化反応を用いて任意のアミノ化合物で標識する反応であることが好ましい。標識試薬としては、糖鎖の還元末端と反応性を有するアミノ基、ヒドラジド基、アミノオキシ基等の官能基を含む物質が好ましい。
アミノ基を有する物質としては、以下に列挙した化合物群から選ぶことが好ましいが、これに限定されるものではない。
2-aminopyridine; 2-aminobenzamide; 2-aminoanthranilic acid; 7-amino-1-naphthol; 3-(acetylamino)-6-aminoacridine; 9-aminopyrene-1,4,6-trisulfonic acid; 8-aminonaphtalene-1,3,6-trisulfonic acid; 7-amino-1,3-naphtalenedisulfonic acid: 2-amino-9(10H)-acridone; 5-aminofluorescein; Dansylethylenediamine; 7-amino-4-methylcoumarine; benzylamine
これら化合物のうち、2-aminobenzamide(2AB)は糖鎖をHPLC分析する際の標識として多用されており、特に好ましい。
2-aminopyridine; 2-aminobenzamide; 2-aminoanthranilic acid; 7-amino-1-naphthol; 3-(acetylamino)-6-aminoacridine; 9-aminopyrene-1,4,6-trisulfonic acid; 8-aminonaphtalene-1,3,6-trisulfonic acid; 7-amino-1,3-naphtalenedisulfonic acid: 2-amino-9(10H)-acridone; 5-aminofluorescein; Dansylethylenediamine; 7-amino-4-methylcoumarine; benzylamine
これら化合物のうち、2-aminobenzamide(2AB)は糖鎖をHPLC分析する際の標識として多用されており、特に好ましい。
ヒドラジド基を有する物質としては、以下に列挙した化合物群から選ぶことが好ましい
が、これに限定されるものではない。
2-aminobenzhydrazide; 2-hydrazinobenzoic acid; benzylhydrazine; 5-Dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl hydrazine(Dansylhydrazine); 2-hydrazinopyridine; 9-fluorenylmethyl carbazate(Fmoc hydrazine); 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionoc acid, hydrazide; 2-(6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin)acetohydrazide; 7-diethylaminocoumarin-3-carboxylic acid, hydrazide(DCCH); phenylhydrazine; 1-Naphthaleneacethydrazide; phenylacetic hydrazide。
が、これに限定されるものではない。
2-aminobenzhydrazide; 2-hydrazinobenzoic acid; benzylhydrazine; 5-Dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl hydrazine(Dansylhydrazine); 2-hydrazinopyridine; 9-fluorenylmethyl carbazate(Fmoc hydrazine); 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionoc acid, hydrazide; 2-(6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin)acetohydrazide; 7-diethylaminocoumarin-3-carboxylic acid, hydrazide(DCCH); phenylhydrazine; 1-Naphthaleneacethydrazide; phenylacetic hydrazide。
アミノオキシ基を有する物質としては、以下に列挙した化合物群から選ぶことが好ましいが、これに限定されるものではない。
N-aminooxyacetyl(tryptophyl)arginine methyl ester; O-benzylhydroxylamine; O-phenylhydroxylamine; O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine; O-(4-nitrobenzyl)hydroxylamine; 2-aminooxypyridine; 2-aminooxymethylpyridine; 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid methyl ester; 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoicacid ethyl ester; 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid n-butyl ester; aminooxy-biotin。
N-aminooxyacetyl(tryptophyl)arginine methyl ester; O-benzylhydroxylamine; O-phenylhydroxylamine; O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine; O-(4-nitrobenzyl)hydroxylamine; 2-aminooxypyridine; 2-aminooxymethylpyridine; 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid methyl ester; 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoicacid ethyl ester; 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid n-butyl ester; aminooxy-biotin。
本発明においては、標識反応の条件は限定されるものではないが、例えば、糖鎖に対して10等量以上の標識試薬を添加し、還元剤の存在下で加熱反応を行うことが好ましい。反応系においてpHは、酸性から中性の条件であることが好ましく、2~9がより好ましく、2~8がさらに好ましく、2~7が最も好ましい。反応温度は、4~90℃が好ましく、25~90℃がより好ましく、40~90℃がさらに好ましい。反応時間は、10分間~24時間が好ましく、10分間~8時間がより好ましく、10分間~3時間がさらに好ましい。ヒドラジド基含有化合物またはアミノオキシ基含有化合物で標識する場合には、還元剤は必ずしも添加しなくともよい。
特に、アミノ化合物が2-aminobenzamideの場合、pHは、酸性から中性の条件であり、好ましくは2~9であり、より好ましくは2~8であり、さらに好ましくは2~7である。反応温度は、4~90℃であり、好ましくは30~90℃であり、さらに好ましくは40~80℃である。アミノ化合物の濃度は、1mM~10Mであり、好ましくは10mM~10Mであり、さらに好ましくは100mM~1Mである。還元剤の濃度は、1mM~10Mであり、好ましくは10mM~10Mであり、さらに好ましくは100mM~2Mである。反応時間は、10分間~24時間であり、好ましくは10分間~8時間であり、さらに好ましくは1時間~3時間である。
また、還元剤としては、例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、メチルアミンボラン、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、ピコリンボラン、ピリジンボランなどが使用可能であるが、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用するのが反応性の面から考えて好ましい。
(標識糖鎖の精製)
上記の方法により調製された標識糖鎖を含む試料溶液(標識糖鎖溶液)には、試薬、塩類、添加剤、未標識物が含まれているため、直接分析に供することは困難である。このため、分析前に予めこれらの物質を除去することが必要となる。除去方法としては、標識糖鎖を含む試料溶液を、シラノール基を有するシリカ系担体と接触させることにより、シリカ系担体に糖鎖成分を吸着させる工程(工程1);シリカ系担体を洗浄液で洗浄する工程(工程2);シリカ系担体に溶出液を接触させ、吸着した糖鎖成分を溶出させる工程(工程3);を含む方法を用いることが好ましい。シリカ系担体がシラノール基を有することで、効率的に標識糖鎖の捕捉を行うことができ、その結果、標識糖鎖以外の物質(糖鎖以外の莢雑物、試薬、塩類、添加剤、未標識物等)を除去した標識糖鎖試料を調製することが可能になる。
上記の方法により調製された標識糖鎖を含む試料溶液(標識糖鎖溶液)には、試薬、塩類、添加剤、未標識物が含まれているため、直接分析に供することは困難である。このため、分析前に予めこれらの物質を除去することが必要となる。除去方法としては、標識糖鎖を含む試料溶液を、シラノール基を有するシリカ系担体と接触させることにより、シリカ系担体に糖鎖成分を吸着させる工程(工程1);シリカ系担体を洗浄液で洗浄する工程(工程2);シリカ系担体に溶出液を接触させ、吸着した糖鎖成分を溶出させる工程(工程3);を含む方法を用いることが好ましい。シリカ系担体がシラノール基を有することで、効率的に標識糖鎖の捕捉を行うことができ、その結果、標識糖鎖以外の物質(糖鎖以外の莢雑物、試薬、塩類、添加剤、未標識物等)を除去した標識糖鎖試料を調製することが可能になる。
本発明に係るシリカ系担体としては、シリカを含有する担体であればよく、シリカのみからなるものであっても、シリカ-有機物ハイブリッド型であってもよい。また、その形状も特に制限されず、粒子状、板状、繊維状、多孔質状等のいずれであってもよい。本発明では、これらの中でも、モノリスシリカを用いることが特に好ましい。モノリスシリカとは、3次元網目構造をもつフィルター状の多孔質連続体をなすシリカであり、従来の粒子状シリカと比較して、通液性がより良好であること、フリット(ビーズ塞き止め用の部材)が不要であること、デッドボリュームが少ないことなどの長所がある(特開平6-265534号公報)。モノリスシリカは、カラム状の容器またはマルチウェルプレートに固定されていることが好ましい。
モノリスシリカのポアサイズについては、小さすぎると通液性が低下し、大きすぎると理論段数が低下し、それにより糖鎖の回収量が低下してしまう。そのため、モノリスシリカのポアサイズは、例えば、互いに連続した細孔(スルーポア)径が1~100μmであることが好ましく、1~50μmであることがより好ましく、1~30μmであることがさらに好ましく、1~20μmであることが最も好ましい。モノリスシリカの性状については、順相モードまたはHILIC(Hydrophilic interaction chromatography)モードが好ましい。
モノリスシリカの使用形態としては、モノリスシリカが固定されたカラムまたはマルチウェルプレートに標識糖鎖を含む試料溶液を注入し、自然落下、吸引、加圧、遠心などの方法により試料溶液をモノリスシリカ部を通過させたのち、洗浄液で洗浄し、溶出液を添加して糖鎖成分を溶出させることが好ましい。
シリカ系担体(好ましくはモノリスシリカ)に適用する試料溶液は、95体積%を超える有機溶媒を含む溶液であることが好ましく、96体積%以上の有機溶媒を含む溶液であることがより好ましく、98体積%以上の有機溶媒を含む溶液であることがさらに好ましく、99体積%以上の有機溶媒を含む溶液であることが特に好ましい。前記有機溶媒としてはアセトニトリル、ヘキサン、酢酸エチル、塩化メチレン、テトラヒドロフランなどを用いることができるが、アセトニトリルが最も好ましい。
糖鎖試料を適用した後、シリカ系担体(好ましくはモノリスシリカ)を洗浄液で洗浄することが好ましい。洗浄液は、95体積%を超える有機溶媒および5体積%未満の水を含む溶液であることが好ましく、96体積%以上の有機溶媒および4体積%以下の水を含む溶液であることがより好ましく、98体積%以上の有機溶媒および2体積%以下の水を含む溶液であることがさらに好ましく、99体積%以上の有機溶媒および1体積%以下の水を含む溶液であることが特に好ましく、100%の有機溶媒であることが最も好ましい。前記有機溶媒としてはアセトニトリルヘキサン、酢酸エチル、塩化メチレン、テトラヒドロフランなどを用いることができるが、アセトニトリルが最も好ましい。
洗浄操作後、シリカ系担体(好ましくはモノリスシリカ)に溶出液を添加し、吸着した標識糖鎖を溶出することが好ましい。溶出液は10体積%以上の水を含むことが好ましく、50体積%以上の水を含むことがより好ましく、水が最も好ましい。水以外の成分は、例えば、アセトニトリル、および、メタノール、エタノール、2-プロパノール、ブタノールに代表されるアルコールから選ばれる有機溶媒であることが好ましい。回収した糖鎖溶液(標識糖鎖試料)は、必要に応じて濃縮、乾燥、あるいは希釈して各種測定に供することができる。
(MALDI-TOF MSを用いた糖鎖分析)
得られた標識糖鎖は、MALDI-TOF MSに代表される質量分析法で分析することができる。
得られた標識糖鎖は、MALDI-TOF MSに代表される質量分析法で分析することができる。
(HPLCおよびLC-MSを用いた糖鎖分析)
得られた標識糖鎖は、HPLCやLC-MSを用いて分析することができる。特に糖鎖が2AB化されている場合、HPLCやLC-MSによる分析が特に好適である。
得られた標識糖鎖は、HPLCやLC-MSを用いて分析することができる。特に糖鎖が2AB化されている場合、HPLCやLC-MSによる分析が特に好適である。
(その他の糖鎖分析)
得られた標識糖鎖は、キャピラリ電気泳動など各種分析に供することができる。
得られた標識糖鎖は、キャピラリ電気泳動など各種分析に供することができる。
以下の実施例にて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されることはない。
A.標識した糖鎖試料の調製
グルコースが1個以上結合した混合物であるグルコースオリゴマーを、ヒドラジド基含有ポリマービーズ(住友ベークライト株式会社製、BS-45601S)5mgに添加し、2%酢酸を含むアセトニトリル180μLを加えたのち、80℃で1時間反応させ、乾固させた。2Mグアニジン塩酸塩溶液、水、メタノール、1%トリエチルアミン溶液にてポリマービーズを洗浄後、10%無水酢酸/メタノール溶液を添加し、室温で30分間反応させヒドラジド基をキャッピングした。キャッピング後、メタノールおよび水でポリマービーズを洗浄した。ビーズに純水20μLおよび2%酢酸を含むアセトニトリル180μLを加え、80℃で1時間加熱・乾固させることにより、ビーズから糖鎖を遊離させた。遊離させた糖鎖を50μLの2-aminobenzamide(2AB)溶液(350mMの2-aminobenzamide、1Mのシアノ水素化ホウ素ナトリウムになるように30%(v/v)酢酸/DMSO混合溶媒に溶解した溶液)に溶解し、この溶液50μLを上述のビーズに添加し、80℃で2時間反応させることにより糖鎖を2AB標識した。上清を回収し、2AB標識糖鎖(2AB標識グルコースオリゴマー)溶液(未反応の2ABを含む)を得た。
グルコースが1個以上結合した混合物であるグルコースオリゴマーを、ヒドラジド基含有ポリマービーズ(住友ベークライト株式会社製、BS-45601S)5mgに添加し、2%酢酸を含むアセトニトリル180μLを加えたのち、80℃で1時間反応させ、乾固させた。2Mグアニジン塩酸塩溶液、水、メタノール、1%トリエチルアミン溶液にてポリマービーズを洗浄後、10%無水酢酸/メタノール溶液を添加し、室温で30分間反応させヒドラジド基をキャッピングした。キャッピング後、メタノールおよび水でポリマービーズを洗浄した。ビーズに純水20μLおよび2%酢酸を含むアセトニトリル180μLを加え、80℃で1時間加熱・乾固させることにより、ビーズから糖鎖を遊離させた。遊離させた糖鎖を50μLの2-aminobenzamide(2AB)溶液(350mMの2-aminobenzamide、1Mのシアノ水素化ホウ素ナトリウムになるように30%(v/v)酢酸/DMSO混合溶媒に溶解した溶液)に溶解し、この溶液50μLを上述のビーズに添加し、80℃で2時間反応させることにより糖鎖を2AB標識した。上清を回収し、2AB標識糖鎖(2AB標識グルコースオリゴマー)溶液(未反応の2ABを含む)を得た。
B.ラベル化糖鎖の精製
標識糖鎖を含む溶液中の標識糖鎖以外の物質である、試薬、塩類、添加剤、未標識物を低減させるため、以下の方法で固相抽出を行った。
標識糖鎖を含む溶液中の標識糖鎖以外の物質である、試薬、塩類、添加剤、未標識物を低減させるため、以下の方法で固相抽出を行った。
(実施例1)
2AB標識糖鎖溶液から、モノリスシリカを用いて試薬、塩類、添加剤、未標識物の除去を行った。モノリスシリカとして、ジーエルサイエンス株式会社製「MonoFasスピンカラム」を用いた。本カラムは、スルーポア径15μmのディスク状モノリスシリカフィルターが容量約1mLのチューブの底部に固定されたものであり、試料溶液をチューブ内に注入して遠心することにより、試料溶液をモノリスシリカの細孔内を通過させる仕組みになっている。
2AB標識糖鎖溶液から、モノリスシリカを用いて試薬、塩類、添加剤、未標識物の除去を行った。モノリスシリカとして、ジーエルサイエンス株式会社製「MonoFasスピンカラム」を用いた。本カラムは、スルーポア径15μmのディスク状モノリスシリカフィルターが容量約1mLのチューブの底部に固定されたものであり、試料溶液をチューブ内に注入して遠心することにより、試料溶液をモノリスシリカの細孔内を通過させる仕組みになっている。
2AB標識糖鎖溶液をアセトニトリル(ACN)で希釈し(溶液中のアセトニトリル濃度:99体積%)、モノリスシリカスピンカラムに注入し、卓上遠心機で遠心して通過させて標識糖鎖を吸着させた。カラムの洗浄条件の比較を行った。アセトニトリル/水(95:5,v/v)でカラムを洗浄したのち、純水50μLを加えて吸着成分を溶出させ、回収しHPLCを行った場合(第1の条件、図1)と、100%のアセトニトリルでカラムを洗浄したのち、純水50μLを加えて吸着成分を溶出させ、回収しHPLCを行った場合(第2の条件、図2)とを比較した。
N型糖鎖の糖残基数に相当するモデルとしてグルコースが7つ結合したGlc7、O型糖鎖の糖残基数に相当するモデルとしてグルコースが1つのGlc1に着目した。第1の条件がN型糖鎖の回収に問題はなかったことから、各条件でのGlc7のピーク面積に対するGlc1のピーク面積比を、精製したグルコースオリゴマーをそのままHPLCに供した場合のGlc7のピーク面積に対するGlc1のピーク面積比(=7.0)と比較し、O型糖鎖の回収率を求めた。第1の条件で行った場合(図1)のGlc7のピーク面積に対するGlc1のピーク面積比は4.76、第2の条件で行った場合(図2)のGlc7のピーク面積に対するGlc1のピーク面積比は6.49であり、O型糖鎖の回収率は第1の洗浄方法では約70%と回収率が比較的低いが、第2の条件では約90%以上と高く、第2の洗浄条件によればO型糖鎖の回収率が飛躍的に高まることが判明した。HPLCの条件を表1に示す。
N型糖鎖の糖残基数に相当するモデルとしてグルコースが7つ結合したGlc7、O型糖鎖の糖残基数に相当するモデルとしてグルコースが1つのGlc1に着目した。第1の条件がN型糖鎖の回収に問題はなかったことから、各条件でのGlc7のピーク面積に対するGlc1のピーク面積比を、精製したグルコースオリゴマーをそのままHPLCに供した場合のGlc7のピーク面積に対するGlc1のピーク面積比(=7.0)と比較し、O型糖鎖の回収率を求めた。第1の条件で行った場合(図1)のGlc7のピーク面積に対するGlc1のピーク面積比は4.76、第2の条件で行った場合(図2)のGlc7のピーク面積に対するGlc1のピーク面積比は6.49であり、O型糖鎖の回収率は第1の洗浄方法では約70%と回収率が比較的低いが、第2の条件では約90%以上と高く、第2の洗浄条件によればO型糖鎖の回収率が飛躍的に高まることが判明した。HPLCの条件を表1に示す。
(実施例2)
従来法では2AB標識糖鎖溶液中には、約5%のDMSOおよび酢酸を含有している。O型糖鎖の回収におけるこれらの成分の影響を調べた。2AB標識グルコースオリゴマーを、1%DMSO/99%アセトニトリル(体積%、以下同様)、5%DMSO/95%アセトニトリル、10%DMSO/90%アセトニトリル、1%酢酸/99%アセトニトリル、5%酢酸/95%アセトニトリル、10%酢酸/90%アセトニトリルに溶解させた6種の溶液を調製し、モノリスシリカに注入後、100%アセトニトリルで洗浄した。6本のモノリスシリカカラムに純水50μLを加えて吸着成分を溶出させ、回収しそれぞれのHPLCを行った場合(図3)を比較した。
従来法では2AB標識糖鎖溶液中には、約5%のDMSOおよび酢酸を含有している。O型糖鎖の回収におけるこれらの成分の影響を調べた。2AB標識グルコースオリゴマーを、1%DMSO/99%アセトニトリル(体積%、以下同様)、5%DMSO/95%アセトニトリル、10%DMSO/90%アセトニトリル、1%酢酸/99%アセトニトリル、5%酢酸/95%アセトニトリル、10%酢酸/90%アセトニトリルに溶解させた6種の溶液を調製し、モノリスシリカに注入後、100%アセトニトリルで洗浄した。6本のモノリスシリカカラムに純水50μLを加えて吸着成分を溶出させ、回収しそれぞれのHPLCを行った場合(図3)を比較した。
実施例1で既に示した方法と同様な方法で、各条件でのGlc7のピーク面積に対するGlc1のピーク面積比を、精製したグルコースオリゴマーをそのままHPLCに供した場合のGlc7のピーク面積に対するGlc1のピーク面積比(=4.03)と比較し、O型糖鎖の回収率を求めた。1%DMSO/99%アセトニトリル、5%DMSO/95%アセトニトリル、10%DMSO/90%アセトニトリル、1%酢酸/99%アセトニトリル、5%酢酸/95%アセトニトリル、10%酢酸/90%アセトニトリルに溶解させた各条件でのGlc7のピーク面積に対するGlc1のピーク面積比はそれぞれ、3.91、2.58、1.48、3.57、2.16、1.47であり、O型糖鎖の回収率はそれぞれ、97%、64%、37%、89%、54%、36%となった。従来の条件付近では50~65%程度の回収率しか望めないが、1%以下のDMSOを含む溶液(すなわち、99%以上のアセトニトリルを含む溶液)や1%以下の酢酸を含む溶液(すなわち、99%以上のアセトニトリルを含む溶液)に溶解すると、驚くべきことに、O型糖鎖の回収率が約90%以上となり、O型糖鎖の回収率が飛躍的に高まることが判明した。
本発明によれば、O型糖鎖に代表される分子量の小さい糖鎖群を標識反応後、標識糖鎖のロスを低減しつつ、標識糖鎖以外の物質である、試薬、塩類、添加剤、未標識物を効率よく除去でき、N型糖鎖のみならず、O型糖鎖の定量的な分析が可能となる。多くの腫瘍マーカーのエピトープがO型糖鎖上に存在することが示唆されていることから、本発明は、例えば、癌などの疾患の診断や、シアロ糖鎖を標的とした新たなバイオマーカーの開発に有用である。従って、本発明は、例えば、医療分野において大きく貢献しうるものである。
Claims (14)
- 標識糖鎖試料を調製する方法であって、
(工程1)標識糖鎖を含む試料溶液をシリカ系担体と接触させることにより、シリカ系担体に糖鎖成分を吸着させる工程、
(工程2)シリカ系担体を洗浄液で洗浄する工程、
(工程3)シリカ系担体に溶出液を接触させ、吸着した糖鎖成分を溶出させる工程、を含み、工程1における試料溶液が95体積%を超える有機溶媒を含む溶液である方法。 - 前記工程1における試料溶液に含まれる有機溶媒がアセトニトリルである、請求項1に記載の方法。
- 工程2における洗浄液が95体積%を超える有機溶媒および5体積%未満の水を含む溶液である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記工程2における洗浄液に含まれる有機溶媒がアセトニトリルである、請求項3に記載の方法。
- 工程3における溶出液が1体積%以上の水を含む溶液である、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 工程3における溶出液が50体積%以上の水を含む溶液である、請求項5に記載の方法。
- 工程3における溶出液が水である、請求項5に記載の方法。
- 前記シリカ系担体がモノリスシリカである、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
- 標識糖鎖が、糖鎖の還元末端に、アミノ基、ヒドラジド基、またはアミノオキシ基を含む化合物を結合させたものである、請求項1から8のいずれかに記載の方法。
- 標識糖鎖が、下記から選ばれる少なくとも一つのアミノ基含有化合物を、糖鎖の還元末端に結合させたものである、請求項9に記載の方法。
2-aminopyridine; 2-aminobenzamide; 2-aminoanthranilic acid; 7-amino-1-naphthol; 3-(acetylamino)-6-aminoacridine; 9-aminopyrene-1,4,6-trisulfonic acid; 8-aminonaphtalene-1,3,6-trisulfonic acid; 7-amino-1,3-naphtalenedisulfonicacid: 2-amino-9(10H)-acridone; 5-aminofluorescein; Dansylethylenediamine; 7-amino-4-methylcoumarine; benzylamine - 標識糖鎖が、下記から選ばれる少なくとも一つのヒドラジド基含有化合物を、糖鎖の還元末端に結合させたものである、請求項9に記載の方法。
2-aminobenzhydrazide; 2-hydrazinobenzoic acid; benzylhydrazine; 5-Dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl hydrazine(Dansylhydrazine); 2-hydrazinopyridine;9-fluorenylmethyl carbazate(Fmoc hydrazine); 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionoc acid, hydrazide; 2-(6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin)acetohydrazide; 7-diethylaminocoumarin-3-carboxylic acid, hydrazide(DCCH); phenylhydrazine;1-Naphthaleneacethydrazide; phenylacetic hydrazide - 標識糖鎖が、下記から選ばれる少なくとも一つのアミノオキシ基含有化合物を、糖鎖の還元末端に結合さたものである、請求項9に記載の方法。
N-aminooxyacetyl(tryptophyl)arginine methyl ester; O-benzylhydroxylamine; Ophenylhydroxylamine;O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine; O-(4-nitrobenzyl)hydroxylamine; 2-aminooxypyridine; 2-aminooxymethylpyridine; 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid methyl ester; 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid ethyl ester; 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid n-butyl ester; aminooxy-biotin - 請求項1から12のいずれかに記載の方法によって調製された標識糖鎖試料。
- 請求項1から13のいずれかに記載の方法によって調製された標識糖鎖試料を、HPLC、質量分析、LC-MS、またはキャピラリ電気泳動法の分析手段によって分析する、糖鎖の分析方法。
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