JP6238087B2 - 標識糖鎖試料の調製方法 - Google Patents
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Description
本発明は、標識した糖鎖試料を調製する方法に関し、特に標識したＯ型糖鎖試料を効率的に調製する方法に関する。
糖鎖とは、グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、キシロース（Ｘｙｌ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、シアル酸などの単糖およびこれらの誘導体が鎖状に連なった分子の総称である。
糖鎖は非常に多様性に富み、生物が有する様々な機能に関与する物質である。糖鎖は生体内でタンパク質や脂質などに結合した複合糖質として存在することが多く、生体内の糖鎖は細胞間情報伝達、タンパク質の機能や相互作用の調整などに深く関わっていることが明らかになりつつある。
糖鎖を有する生体高分子としては、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のプロテオグリカン、細胞の分化、増殖、接着、移動等に影響を与える糖脂質、および細胞間相互作用や細胞認識に関与している糖タンパク質等が挙げられるが、これらの高分子の糖鎖が、互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御する機構が次第に明らかにされつつある。さらに、このような糖鎖と細胞の分化増殖、細胞接着、免疫、および細胞の癌化との関係が明確にされれば、糖鎖工学と、医学、細胞工学、あるいは臓器工学と密接に関連させて新たな展開を図ることが期待できる。
病気を早期発見して生活の質（ＱＯＬ）を高く保つためには、病気の発症の予防や推移を診断できるバイオマーカーが必要である。糖鎖生合成にかかわる糖転移酵素の遺伝子破壊マウスの解析から、糖鎖はさまざまな組織・器官の機能維持に必須であることが明らかにされている（非特許文献１，２）。また、糖鎖修飾に異常がみられると様々な疾病が引き起こされることも知られている（非特許文献３）。糖鎖の構造は細胞の癌化や様々な疾病によって著しく変化するので、疾病の推移を調べるためのバイオマーカーとしての利用が期待されている。
糖鎖はバイオ医薬品の理解に重要な品質特性の一つとしても挙げられており、バイオ医薬品の同等性の担保にも有益と言われている。そのため、バイオ医薬品の製造プロセスの設計や工程内管理として糖鎖分析法の導入を求める声もある。
糖鎖自体は蛍光性、紫外吸収性をもたないため、糖鎖を分析する際には予め標識を施すことが多い。糖鎖をＨＰＬＣあるいはＨＰＬＣ−ＭＳで分析する場合は、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ誘導体化（２ＡＢ化）、２−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ誘導体化（ＰＡ化）などの蛍光標識を施すことが一般的である（非特許文献４）。また、糖鎖をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析する場合にも、標識を施すことにより測定感度の向上を図ることが行われる（非特許文献５、６）。
糖鎖に標識を施す（ラベル化する）際には、標識効率を高めるため糖鎖に対して過剰量の標識試薬を作用させる場合が多い。試料溶液中に過剰の標識試薬が存在すると、ＨＰＬＣ測定や質量分析に支障をきたすため、あらかじめ除去する必要がある。試薬の除去法としてモノリスシリカを用いる方法が有用な方法として良く用いられている。従来法として用いられている方法は、糖鎖の中でもＮ型糖鎖（アスパラギン結合型糖鎖）と呼ばれる糖鎖群を対象に検討されており、Ｎ型糖鎖の捕捉回収には十分であるが、Ｎ型糖鎖よりも分子量が小さいＯ型糖鎖（セリン・スレオニン結合型糖鎖）と呼ばれる分子に関しては、捕捉回収の回収率が低く、Ｏ型糖鎖の定量的な解析は特に困難であり、高い回収率でＯ型糖鎖を回収できる方法が求められていた（非特許文献７〜９）。
Ioffe E., Stanley P., Proc. Natl. Acad. Sci., 91, pp.728-732 (1994)
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本発明の目的は、Ｏ型糖鎖に代表される分子量の小さい糖鎖群を標識反応後、効率的に精製し、回収しうる、標識糖鎖試料の調製方法を提供することである。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、標識糖鎖を高濃度の有機溶媒で希釈してシリカ系担体に適用し、当該担体を高濃度の有機溶媒で洗浄し、当該担体に吸着した標識糖鎖を水を含む溶液で溶出することにより、標識糖鎖（特に、標識されたＯ型糖鎖）のロスを顕著に低減しつつ、標識糖鎖以外の物質（試薬、塩類、添加剤、未標識物など）を効率よく除去することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、より詳しくは、以下を提供するものである。
[１] 標識糖鎖試料を調製する方法であって、
（工程１）標識糖鎖を含む試料溶液をシリカ系担体と接触させることにより、シリカ系担体に糖鎖成分を吸着させる工程、
（工程２）シリカ系担体を洗浄液で洗浄する工程、
（工程３）シリカ系担体に溶出液を接触させ、吸着した糖鎖成分を溶出させる工程、を含み、工程１における試料溶液が９５体積％を超える有機溶媒を含む溶液である方法。
（工程１）標識糖鎖を含む試料溶液をシリカ系担体と接触させることにより、シリカ系担体に糖鎖成分を吸着させる工程、
（工程２）シリカ系担体を洗浄液で洗浄する工程、
（工程３）シリカ系担体に溶出液を接触させ、吸着した糖鎖成分を溶出させる工程、を含み、工程１における試料溶液が９５体積％を超える有機溶媒を含む溶液である方法。
[２] 前記工程１における試料溶液に含まれる有機溶媒がアセトニトリルである、[１]に記載の方法。
[３] 工程２における洗浄液が９５体積％を超える有機溶媒および５体積％未満の水を含む溶液である、[１]または[２]に記載の方法。
[４] 前記工程２における洗浄液に含まれる有機溶媒がアセトニトリルである、[３]に記載の方法。
[５] 工程３における溶出液が１体積％以上の水を含む溶液である、[１]から[４]のいずれかに記載の方法。
[６] 工程３における溶出液が５０体積％以上の水を含む溶液である、[５]に記載の方法。
[７] 工程３における溶出液が水である、[５]に記載の方法。
[８] 前記シリカ系担体がモノリスシリカである、[１]から[７]のいずれかに記載の方法。
[９] 標識糖鎖が、糖鎖の還元末端に、アミノ基、ヒドラジド基、またはアミノオキシ基を含む化合物を結合させたものである、[１]から[８]のいずれかに記載の方法。
[１０] 標識糖鎖が、下記から選ばれる少なくとも一つのアミノ基含有化合物を、糖鎖の還元末端に結合させたものである、[９]に記載の方法。
2-aminopyridine； 2-aminobenzamide； 2-aminoanthranilic acid； 7-amino-1-naphthol； 3-(acetylamino)-6-aminoacridine； 9-aminopyrene-1,4,6-trisulfonic acid； 8-aminonaphtalene-1,3,6-trisulfonic acid； 7-amino-1,3-naphtalenedisulfonicacid： 2-amino-9(10H)-acridone； 5-aminofluorescein； Dansylethylenediamine； 7-amino-4-methylcoumarine； benzylamine。
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[１１] 標識糖鎖が、下記から選ばれる少なくとも一つのヒドラジド基含有化合物を、糖鎖の還元末端に結合させたものである、[９]に記載の方法。
2-aminobenzhydrazide； 2-hydrazinobenzoic acid； benzylhydrazine； 5-Dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl hydrazine(Dansylhydrazine)； 2-hydrazinopyridine；9-fluorenylmethyl carbazate(Fmoc hydrazine)； 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionoc acid, hydrazide； 2-(6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin)acetohydrazide； 7-diethylaminocoumarin-3-carboxylic acid, hydrazide(DCCH)； phenylhydrazine；1-Naphthaleneacethydrazide； phenylacetic hydrazide。
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[１２] 標識糖鎖が、下記から選ばれる少なくとも一つのアミノオキシ基含有化合物を、糖鎖の還元末端に結合さたものである、[９]に記載の方法。
N-aminooxyacetyl(tryptophyl)arginine methyl ester； O-benzylhydroxylamine； Ophenylhydroxylamine；O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine； O-(4-nitrobenzyl)hydroxylamine； 2-aminooxypyridine； 2-aminooxymethylpyridine； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid methyl ester； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid ethyl ester； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid n-butyl ester； aminooxy-biotin。
N-aminooxyacetyl(tryptophyl)arginine methyl ester； O-benzylhydroxylamine； Ophenylhydroxylamine；O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine； O-(4-nitrobenzyl)hydroxylamine； 2-aminooxypyridine； 2-aminooxymethylpyridine； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid methyl ester； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid ethyl ester； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid n-butyl ester； aminooxy-biotin。
[１３] [１]から[１２]のいずれかに記載の方法によって調製された標識糖鎖試料。
[１４] [１]から[１３]のいずれかに記載の方法によって調製された標識糖鎖試料を、ＨＰＬＣ、質量分析、ＬＣ−ＭＳ、またはキャピラリ電気泳動法の分析手段によって分析する、糖鎖の分析方法。
本発明の方法によれば、標識されたＯ型糖鎖の回収率を飛躍的に高めることが可能となるとともに、標識した糖鎖以外の成分を効率よく除去することが可能となる。従って、本発明は、Ｏ型糖鎖の分析に有用である。
（糖鎖試料）
本発明において使用する糖鎖試料は、例えば全血、血清、血漿、尿、唾液、細胞、組織、ウイルス、植物組織などの生体試料から調製されたものを用いることができる。また、精製された、あるいは未精製の糖タンパク質から調製されたものを用いることができる。糖鎖試料としては、別途精製された純粋な糖鎖を用いてもよい。
本発明において使用する糖鎖試料は、例えば全血、血清、血漿、尿、唾液、細胞、組織、ウイルス、植物組織などの生体試料から調製されたものを用いることができる。また、精製された、あるいは未精製の糖タンパク質から調製されたものを用いることができる。糖鎖試料としては、別途精製された純粋な糖鎖を用いてもよい。
生体試料に含まれる糖タンパク質から糖鎖を遊離させる手段としては、例えば、Ｎ−グリコシダーゼあるいはＯ−グリコシダーゼを用いたグリコシダーゼ処理、ヒドラジン分解、アルカリ処理によるβ脱離などの方法を用いることができる。Ｎ型糖鎖の分析を行う場合は、Ｎ−グリコシダーゼを用いる方法が好ましい。グリコシダーゼ処理に先立って、トリプシンやキモトリプシンなどを用いたプロテアーゼ処理を行ってもよい。Ｏ型糖鎖の分析を行う場合は、ヒドラジン分解を用いる方法が好ましい。ヒドラジン分解に先立って、トリプシンやキモトリプシンなどを用いてプロテアーゼ処理を行ってもよい。
（糖鎖精製）
糖鎖を標識する前に、糖鎖以外の莢雑物（例えばタンパク質、ペプチド、核酸、脂質等）を除去することが好ましい。莢雑物の除去法としては、例えば、ゲルろ過精製、限外ろ過、透析、極性を利用した固相抽出、イオン交換樹脂による精製、溶解性の差を利用した沈殿などを用いることができる。糖鎖と選択的に結合する固相担体（例えば住友ベークライト（株）製 ＢｌｏｔＧｌｙｃｏ ＢＳ−４５６０１Ｓ、非特許文献６参照）による精製を用いることもできる。莢雑物の除去を行わずに糖鎖を標識してもよい。
糖鎖を標識する前に、糖鎖以外の莢雑物（例えばタンパク質、ペプチド、核酸、脂質等）を除去することが好ましい。莢雑物の除去法としては、例えば、ゲルろ過精製、限外ろ過、透析、極性を利用した固相抽出、イオン交換樹脂による精製、溶解性の差を利用した沈殿などを用いることができる。糖鎖と選択的に結合する固相担体（例えば住友ベークライト（株）製 ＢｌｏｔＧｌｙｃｏ ＢＳ−４５６０１Ｓ、非特許文献６参照）による精製を用いることもできる。莢雑物の除去を行わずに糖鎖を標識してもよい。
（糖鎖の標識）
糖鎖試料を、必要に応じて乾燥させたのち、標識試薬を加えて反応させて、糖鎖を標識することができる。標識反応は、例えば、還元的アミノ化反応を用いて任意のアミノ化合物で標識する反応であることが好ましい。標識試薬としては、糖鎖の還元末端と反応性を有するアミノ基、ヒドラジド基、アミノオキシ基等の官能基を含む物質が好ましい。
糖鎖試料を、必要に応じて乾燥させたのち、標識試薬を加えて反応させて、糖鎖を標識することができる。標識反応は、例えば、還元的アミノ化反応を用いて任意のアミノ化合物で標識する反応であることが好ましい。標識試薬としては、糖鎖の還元末端と反応性を有するアミノ基、ヒドラジド基、アミノオキシ基等の官能基を含む物質が好ましい。
アミノ基を有する物質としては、以下に列挙した化合物群から選ぶことが好ましいが、これに限定されるものではない。
2-aminopyridine； 2-aminobenzamide； 2-aminoanthranilic acid； 7-amino-1-naphthol； 3-(acetylamino)-6-aminoacridine； 9-aminopyrene-1,4,6-trisulfonic acid； 8-aminonaphtalene-1,3,6-trisulfonic acid； 7-amino-1,3-naphtalenedisulfonic acid： 2-amino-9(10H)-acridone； 5-aminofluorescein； Dansylethylenediamine； 7-amino-4-methylcoumarine； benzylamine
これら化合物のうち、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２ＡＢ）は糖鎖をＨＰＬＣ分析する際の標識として多用されており、特に好ましい。
2-aminopyridine； 2-aminobenzamide； 2-aminoanthranilic acid； 7-amino-1-naphthol； 3-(acetylamino)-6-aminoacridine； 9-aminopyrene-1,4,6-trisulfonic acid； 8-aminonaphtalene-1,3,6-trisulfonic acid； 7-amino-1,3-naphtalenedisulfonic acid： 2-amino-9(10H)-acridone； 5-aminofluorescein； Dansylethylenediamine； 7-amino-4-methylcoumarine； benzylamine
これら化合物のうち、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２ＡＢ）は糖鎖をＨＰＬＣ分析する際の標識として多用されており、特に好ましい。
ヒドラジド基を有する物質としては、以下に列挙した化合物群から選ぶことが好ましい
が、これに限定されるものではない。
2-aminobenzhydrazide; 2-hydrazinobenzoic acid； benzylhydrazine； 5-Dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl hydrazine（Dansylhydrazine）； 2-hydrazinopyridine； 9-fluorenylmethyl carbazate（Fmoc hydrazine）； 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionoc acid, hydrazide； 2-(6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin)acetohydrazide； 7-diethylaminocoumarin-3-carboxylic acid, hydrazide（DCCH）； phenylhydrazine； 1-Naphthaleneacethydrazide； phenylacetic hydrazide。
が、これに限定されるものではない。
2-aminobenzhydrazide; 2-hydrazinobenzoic acid； benzylhydrazine； 5-Dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl hydrazine（Dansylhydrazine）； 2-hydrazinopyridine； 9-fluorenylmethyl carbazate（Fmoc hydrazine）； 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionoc acid, hydrazide； 2-(6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin)acetohydrazide； 7-diethylaminocoumarin-3-carboxylic acid, hydrazide（DCCH）； phenylhydrazine； 1-Naphthaleneacethydrazide； phenylacetic hydrazide。
アミノオキシ基を有する物質としては、以下に列挙した化合物群から選ぶことが好ましいが、これに限定されるものではない。
N-aminooxyacetyl(tryptophyl)arginine methyl ester; O-benzylhydroxylamine； O-phenylhydroxylamine； O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine； O-(4-nitrobenzyl)hydroxylamine； 2-aminooxypyridine； 2-aminooxymethylpyridine； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid methyl ester； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoicacid ethyl ester； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid n-butyl ester; aminooxy-biotin。
N-aminooxyacetyl(tryptophyl)arginine methyl ester; O-benzylhydroxylamine； O-phenylhydroxylamine； O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine； O-(4-nitrobenzyl)hydroxylamine； 2-aminooxypyridine； 2-aminooxymethylpyridine； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid methyl ester； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoicacid ethyl ester； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid n-butyl ester; aminooxy-biotin。
本発明においては、標識反応の条件は限定されるものではないが、例えば、糖鎖に対して１０等量以上の標識試薬を添加し、還元剤の存在下で加熱反応を行うことが好ましい。反応系においてｐＨは、酸性から中性の条件であることが好ましく、２〜９がより好ましく、２〜８がさらに好ましく、２〜７が最も好ましい。反応温度は、４〜９０℃が好ましく、２５〜９０℃がより好ましく、４０〜９０℃がさらに好ましい。反応時間は、１０分間〜２４時間が好ましく、１０分間〜８時間がより好ましく、１０分間〜３時間がさらに好ましい。ヒドラジド基含有化合物またはアミノオキシ基含有化合物で標識する場合には、還元剤は必ずしも添加しなくともよい。
特に、アミノ化合物が２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅの場合、ｐＨは、酸性から中性の条件であり、好ましくは２〜９であり、より好ましくは２〜８であり、さらに好ましくは２〜７である。反応温度は、４〜９０℃であり、好ましくは３０〜９０℃であり、さらに好ましくは４０〜８０℃である。アミノ化合物の濃度は、１ｍＭ〜１０Ｍであり、好ましくは１０ｍＭ〜１０Ｍであり、さらに好ましくは１００ｍＭ〜１Ｍである。還元剤の濃度は、１ｍＭ〜１０Ｍであり、好ましくは１０ｍＭ〜１０Ｍであり、さらに好ましくは１００ｍＭ〜２Ｍである。反応時間は、１０分間〜２４時間であり、好ましくは１０分間〜８時間であり、さらに好ましくは１時間〜３時間である。
また、還元剤としては、例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、メチルアミンボラン、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、ピコリンボラン、ピリジンボランなどが使用可能であるが、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用するのが反応性の面から考えて好ましい。
（標識糖鎖の精製）
上記の方法により調製された標識糖鎖を含む試料溶液（標識糖鎖溶液）には、試薬、塩類、添加剤、未標識物が含まれているため、直接分析に供することは困難である。このため、分析前に予めこれらの物質を除去することが必要となる。除去方法としては、標識糖鎖を含む試料溶液を、シラノール基を有するシリカ系担体と接触させることにより、シリカ系担体に糖鎖成分を吸着させる工程（工程１）；シリカ系担体を洗浄液で洗浄する工程（工程２）；シリカ系担体に溶出液を接触させ、吸着した糖鎖成分を溶出させる工程（工程３）；を含む方法を用いることが好ましい。シリカ系担体がシラノール基を有することで、効率的に標識糖鎖の捕捉を行うことができ、その結果、標識糖鎖以外の物質（糖鎖以外の莢雑物、試薬、塩類、添加剤、未標識物等）を除去した標識糖鎖試料を調製することが可能になる。
上記の方法により調製された標識糖鎖を含む試料溶液（標識糖鎖溶液）には、試薬、塩類、添加剤、未標識物が含まれているため、直接分析に供することは困難である。このため、分析前に予めこれらの物質を除去することが必要となる。除去方法としては、標識糖鎖を含む試料溶液を、シラノール基を有するシリカ系担体と接触させることにより、シリカ系担体に糖鎖成分を吸着させる工程（工程１）；シリカ系担体を洗浄液で洗浄する工程（工程２）；シリカ系担体に溶出液を接触させ、吸着した糖鎖成分を溶出させる工程（工程３）；を含む方法を用いることが好ましい。シリカ系担体がシラノール基を有することで、効率的に標識糖鎖の捕捉を行うことができ、その結果、標識糖鎖以外の物質（糖鎖以外の莢雑物、試薬、塩類、添加剤、未標識物等）を除去した標識糖鎖試料を調製することが可能になる。
本発明に係るシリカ系担体としては、シリカを含有する担体であればよく、シリカのみからなるものであっても、シリカ−有機物ハイブリッド型であってもよい。また、その形状も特に制限されず、粒子状、板状、繊維状、多孔質状等のいずれであってもよい。本発明では、これらの中でも、モノリスシリカを用いることが特に好ましい。モノリスシリカとは、３次元網目構造をもつフィルター状の多孔質連続体をなすシリカであり、従来の粒子状シリカと比較して、通液性がより良好であること、フリット（ビーズ塞き止め用の部材）が不要であること、デッドボリュームが少ないことなどの長所がある（特開平６−２６５５３４号公報）。モノリスシリカは、カラム状の容器またはマルチウェルプレートに固定されていることが好ましい。
モノリスシリカのポアサイズについては、小さすぎると通液性が低下し、大きすぎると理論段数が低下し、それにより糖鎖の回収量が低下してしまう。そのため、モノリスシリカのポアサイズは、例えば、互いに連続した細孔（スルーポア）径が１〜１００μｍであることが好ましく、１〜５０μｍであることがより好ましく、１〜３０μｍであることがさらに好ましく、１〜２０μｍであることが最も好ましい。モノリスシリカの性状については、順相モードまたはＨＩＬＩＣ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）モードが好ましい。
モノリスシリカの使用形態としては、モノリスシリカが固定されたカラムまたはマルチウェルプレートに標識糖鎖を含む試料溶液を注入し、自然落下、吸引、加圧、遠心などの方法により試料溶液をモノリスシリカ部を通過させたのち、洗浄液で洗浄し、溶出液を添加して糖鎖成分を溶出させることが好ましい。
シリカ系担体（好ましくはモノリスシリカ）に適用する試料溶液は、９５体積％を超える有機溶媒を含む溶液であることが好ましく、９６体積％以上の有機溶媒を含む溶液であることがより好ましく、９８体積％以上の有機溶媒を含む溶液であることがさらに好ましく、９９体積％以上の有機溶媒を含む溶液であることが特に好ましい。前記有機溶媒としてはアセトニトリル、ヘキサン、酢酸エチル、塩化メチレン、テトラヒドロフランなどを用いることができるが、アセトニトリルが最も好ましい。
糖鎖試料を適用した後、シリカ系担体（好ましくはモノリスシリカ）を洗浄液で洗浄することが好ましい。洗浄液は、９５体積％を超える有機溶媒および５体積％未満の水を含む溶液であることが好ましく、９６体積％以上の有機溶媒および４体積％以下の水を含む溶液であることがより好ましく、９８体積％以上の有機溶媒および２体積％以下の水を含む溶液であることがさらに好ましく、９９体積％以上の有機溶媒および１体積％以下の水を含む溶液であることが特に好ましく、１００％の有機溶媒であることが最も好ましい。前記有機溶媒としてはアセトニトリルヘキサン、酢酸エチル、塩化メチレン、テトラヒドロフランなどを用いることができるが、アセトニトリルが最も好ましい。
洗浄操作後、シリカ系担体（好ましくはモノリスシリカ）に溶出液を添加し、吸着した標識糖鎖を溶出することが好ましい。溶出液は１０体積％以上の水を含むことが好ましく、５０体積％以上の水を含むことがより好ましく、水が最も好ましい。水以外の成分は、例えば、アセトニトリル、および、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノールに代表されるアルコールから選ばれる有機溶媒であることが好ましい。回収した糖鎖溶液（標識糖鎖試料）は、必要に応じて濃縮、乾燥、あるいは希釈して各種測定に供することができる。
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いた糖鎖分析）
得られた標識糖鎖は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳに代表される質量分析法で分析することができる。
得られた標識糖鎖は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳに代表される質量分析法で分析することができる。
（ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳを用いた糖鎖分析）
得られた標識糖鎖は、ＨＰＬＣやＬＣ−ＭＳを用いて分析することができる。特に糖鎖が２ＡＢ化されている場合、ＨＰＬＣやＬＣ−ＭＳによる分析が特に好適である。
得られた標識糖鎖は、ＨＰＬＣやＬＣ−ＭＳを用いて分析することができる。特に糖鎖が２ＡＢ化されている場合、ＨＰＬＣやＬＣ−ＭＳによる分析が特に好適である。
（その他の糖鎖分析）
得られた標識糖鎖は、キャピラリ電気泳動など各種分析に供することができる。
得られた標識糖鎖は、キャピラリ電気泳動など各種分析に供することができる。
以下の実施例にて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されることはない。
Ａ．標識した糖鎖試料の調製
グルコースが１個以上結合した混合物であるグルコースオリゴマーを、ヒドラジド基含有ポリマービーズ（住友ベークライト株式会社製、ＢＳ−４５６０１Ｓ）５ｍｇに添加し、２％酢酸を含むアセトニトリル１８０μＬを加えたのち、８０℃で１時間反応させ、乾固させた。２Ｍグアニジン塩酸塩溶液、水、メタノール、１％トリエチルアミン溶液にてポリマービーズを洗浄後、１０％無水酢酸／メタノール溶液を添加し、室温で３０分間反応させヒドラジド基をキャッピングした。キャッピング後、メタノールおよび水でポリマービーズを洗浄した。ビーズに純水２０μＬおよび２％酢酸を含むアセトニトリル１８０μＬを加え、８０℃で１時間加熱・乾固させることにより、ビーズから糖鎖を遊離させた。遊離させた糖鎖を５０μＬの２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２ＡＢ）溶液（３５０ｍＭの２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ、１Ｍのシアノ水素化ホウ素ナトリウムになるように３０％（ｖ／ｖ）酢酸／ＤＭＳＯ混合溶媒に溶解した溶液）に溶解し、この溶液５０μＬを上述のビーズに添加し、８０℃で２時間反応させることにより糖鎖を２ＡＢ標識した。上清を回収し、２ＡＢ標識糖鎖（２ＡＢ標識グルコースオリゴマー）溶液（未反応の２ＡＢを含む）を得た。
グルコースが１個以上結合した混合物であるグルコースオリゴマーを、ヒドラジド基含有ポリマービーズ（住友ベークライト株式会社製、ＢＳ−４５６０１Ｓ）５ｍｇに添加し、２％酢酸を含むアセトニトリル１８０μＬを加えたのち、８０℃で１時間反応させ、乾固させた。２Ｍグアニジン塩酸塩溶液、水、メタノール、１％トリエチルアミン溶液にてポリマービーズを洗浄後、１０％無水酢酸／メタノール溶液を添加し、室温で３０分間反応させヒドラジド基をキャッピングした。キャッピング後、メタノールおよび水でポリマービーズを洗浄した。ビーズに純水２０μＬおよび２％酢酸を含むアセトニトリル１８０μＬを加え、８０℃で１時間加熱・乾固させることにより、ビーズから糖鎖を遊離させた。遊離させた糖鎖を５０μＬの２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２ＡＢ）溶液（３５０ｍＭの２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ、１Ｍのシアノ水素化ホウ素ナトリウムになるように３０％（ｖ／ｖ）酢酸／ＤＭＳＯ混合溶媒に溶解した溶液）に溶解し、この溶液５０μＬを上述のビーズに添加し、８０℃で２時間反応させることにより糖鎖を２ＡＢ標識した。上清を回収し、２ＡＢ標識糖鎖（２ＡＢ標識グルコースオリゴマー）溶液（未反応の２ＡＢを含む）を得た。
Ｂ．ラベル化糖鎖の精製
標識糖鎖を含む溶液中の標識糖鎖以外の物質である、試薬、塩類、添加剤、未標識物を低減させるため、以下の方法で固相抽出を行った。
標識糖鎖を含む溶液中の標識糖鎖以外の物質である、試薬、塩類、添加剤、未標識物を低減させるため、以下の方法で固相抽出を行った。
（実施例１）
２ＡＢ標識糖鎖溶液から、モノリスシリカを用いて試薬、塩類、添加剤、未標識物の除去を行った。モノリスシリカとして、ジーエルサイエンス株式会社製「ＭｏｎｏＦａｓスピンカラム」を用いた。本カラムは、スルーポア径１５μｍのディスク状モノリスシリカフィルターが容量約１ｍＬのチューブの底部に固定されたものであり、試料溶液をチューブ内に注入して遠心することにより、試料溶液をモノリスシリカの細孔内を通過させる仕組みになっている。
２ＡＢ標識糖鎖溶液から、モノリスシリカを用いて試薬、塩類、添加剤、未標識物の除去を行った。モノリスシリカとして、ジーエルサイエンス株式会社製「ＭｏｎｏＦａｓスピンカラム」を用いた。本カラムは、スルーポア径１５μｍのディスク状モノリスシリカフィルターが容量約１ｍＬのチューブの底部に固定されたものであり、試料溶液をチューブ内に注入して遠心することにより、試料溶液をモノリスシリカの細孔内を通過させる仕組みになっている。
２ＡＢ標識糖鎖溶液をアセトニトリル（ＡＣＮ）で希釈し（溶液中のアセトニトリル濃度：９９体積％）、モノリスシリカスピンカラムに注入し、卓上遠心機で遠心して通過させて標識糖鎖を吸着させた。カラムの洗浄条件の比較を行った。アセトニトリル／水（９５：５，ｖ／ｖ）でカラムを洗浄したのち、純水５０μＬを加えて吸着成分を溶出させ、回収しＨＰＬＣを行った場合（第１の条件、図１）と、１００％のアセトニトリルでカラムを洗浄したのち、純水５０μＬを加えて吸着成分を溶出させ、回収しＨＰＬＣを行った場合（第２の条件、図２）とを比較した。
Ｎ型糖鎖の糖残基数に相当するモデルとしてグルコースが７つ結合したＧｌｃ７、Ｏ型糖鎖の糖残基数に相当するモデルとしてグルコースが１つのＧｌｃ１に着目した。第１の条件がＮ型糖鎖の回収に問題はなかったことから、各条件でのＧｌｃ７のピーク面積に対するＧｌｃ1のピーク面積比を、精製したグルコースオリゴマーをそのままＨＰＬＣに供した場合のＧｌｃ７のピーク面積に対するＧｌｃ1のピーク面積比（＝７.０）と比較し、Ｏ型糖鎖の回収率を求めた。第１の条件で行った場合（図１）のＧｌｃ７のピーク面積に対するＧｌｃ1のピーク面積比は４．７６、第２の条件で行った場合（図２）のＧｌｃ７のピーク面積に対するＧｌｃ1のピーク面積比は６．４９であり、Ｏ型糖鎖の回収率は第１の洗浄方法では約７０％と回収率が比較的低いが、第２の条件では約９０％以上と高く、第２の洗浄条件によればＯ型糖鎖の回収率が飛躍的に高まることが判明した。ＨＰＬＣの条件を表１に示す。
Ｎ型糖鎖の糖残基数に相当するモデルとしてグルコースが７つ結合したＧｌｃ７、Ｏ型糖鎖の糖残基数に相当するモデルとしてグルコースが１つのＧｌｃ１に着目した。第１の条件がＮ型糖鎖の回収に問題はなかったことから、各条件でのＧｌｃ７のピーク面積に対するＧｌｃ1のピーク面積比を、精製したグルコースオリゴマーをそのままＨＰＬＣに供した場合のＧｌｃ７のピーク面積に対するＧｌｃ1のピーク面積比（＝７.０）と比較し、Ｏ型糖鎖の回収率を求めた。第１の条件で行った場合（図１）のＧｌｃ７のピーク面積に対するＧｌｃ1のピーク面積比は４．７６、第２の条件で行った場合（図２）のＧｌｃ７のピーク面積に対するＧｌｃ1のピーク面積比は６．４９であり、Ｏ型糖鎖の回収率は第１の洗浄方法では約７０％と回収率が比較的低いが、第２の条件では約９０％以上と高く、第２の洗浄条件によればＯ型糖鎖の回収率が飛躍的に高まることが判明した。ＨＰＬＣの条件を表１に示す。
（実施例２）
従来法では２ＡＢ標識糖鎖溶液中には、約５％のＤＭＳＯおよび酢酸を含有している。Ｏ型糖鎖の回収におけるこれらの成分の影響を調べた。２ＡＢ標識グルコースオリゴマーを、１％ＤＭＳＯ／９９％アセトニトリル（体積％、以下同様）、５％ＤＭＳＯ／９５％アセトニトリル、１０％ＤＭＳＯ／９０％アセトニトリル、１％酢酸／９９％アセトニトリル、５％酢酸／９５％アセトニトリル、１０％酢酸／９０％アセトニトリルに溶解させた６種の溶液を調製し、モノリスシリカに注入後、１００％アセトニトリルで洗浄した。６本のモノリスシリカカラムに純水５０μＬを加えて吸着成分を溶出させ、回収しそれぞれのＨＰＬＣを行った場合（図３）を比較した。
従来法では２ＡＢ標識糖鎖溶液中には、約５％のＤＭＳＯおよび酢酸を含有している。Ｏ型糖鎖の回収におけるこれらの成分の影響を調べた。２ＡＢ標識グルコースオリゴマーを、１％ＤＭＳＯ／９９％アセトニトリル（体積％、以下同様）、５％ＤＭＳＯ／９５％アセトニトリル、１０％ＤＭＳＯ／９０％アセトニトリル、１％酢酸／９９％アセトニトリル、５％酢酸／９５％アセトニトリル、１０％酢酸／９０％アセトニトリルに溶解させた６種の溶液を調製し、モノリスシリカに注入後、１００％アセトニトリルで洗浄した。６本のモノリスシリカカラムに純水５０μＬを加えて吸着成分を溶出させ、回収しそれぞれのＨＰＬＣを行った場合（図３）を比較した。
実施例１で既に示した方法と同様な方法で、各条件でのＧｌｃ７のピーク面積に対するＧｌｃ1のピーク面積比を、精製したグルコースオリゴマーをそのままＨＰＬＣに供した場合のＧｌｃ７のピーク面積に対するＧｌｃ1のピーク面積比（＝４．０３）と比較し、Ｏ型糖鎖の回収率を求めた。１％ＤＭＳＯ／９９％アセトニトリル、５％ＤＭＳＯ／９５％アセトニトリル、１０％ＤＭＳＯ／９０％アセトニトリル、１％酢酸／９９％アセトニトリル、５％酢酸／９５％アセトニトリル、１０％酢酸／９０％アセトニトリルに溶解させた各条件でのＧｌｃ７のピーク面積に対するＧｌｃ1のピーク面積比はそれぞれ、３．９１、２．５８、１．４８、３．５７、２．１６、１．４７であり、Ｏ型糖鎖の回収率はそれぞれ、９７％、６４％、３７％、８９％、５４％、３６％となった。従来の条件付近では５０〜６５％程度の回収率しか望めないが、１％以下のＤＭＳＯを含む溶液（すなわち、９９％以上のアセトニトリルを含む溶液）や１％以下の酢酸を含む溶液（すなわち、９９％以上のアセトニトリルを含む溶液）に溶解すると、驚くべきことに、Ｏ型糖鎖の回収率が約９０％以上となり、Ｏ型糖鎖の回収率が飛躍的に高まることが判明した。
本発明によれば、Ｏ型糖鎖に代表される分子量の小さい糖鎖群を標識反応後、標識糖鎖のロスを低減しつつ、標識糖鎖以外の物質である、試薬、塩類、添加剤、未標識物を効率よく除去でき、Ｎ型糖鎖のみならず、Ｏ型糖鎖の定量的な分析が可能となる。多くの腫瘍マーカーのエピトープがＯ型糖鎖上に存在することが示唆されていることから、本発明は、例えば、癌などの疾患の診断や、シアロ糖鎖を標的とした新たなバイオマーカーの開発に有用である。従って、本発明は、例えば、医療分野において大きく貢献しうるものである。
Claims (12)
- 標識糖鎖試料を調製する方法であって、
（工程１）標識糖鎖を含む試料溶液をシリカ系担体と接触させることにより、シリカ系担体に糖鎖成分を吸着させる工程、
（工程２）シリカ系担体を洗浄液で洗浄する工程、
（工程３）シリカ系担体に溶出液を接触させ、吸着した糖鎖成分を溶出させる工程、を含み、工程１における試料溶液が９９体積％を超えるアセトニトリルを含む溶液である方法。 - 工程２における洗浄液が９５体積％を超えるアセトニトリルおよび５体積％未満の水を含む溶液である、請求項１に記載の方法。
- 工程２における洗浄液が１００体積％のアセトニトリルである、請求項２に記載の方法。
- 工程３における溶出液が１体積％以上の水を含む溶液である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
- 工程３における溶出液が５０体積％以上の水を含む溶液である、請求項４に記載の方法。
- 工程３における溶出液が水である、請求項４に記載の方法。
- 前記シリカ系担体がモノリスシリカである、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
- 標識糖鎖が、糖鎖の還元末端に、アミノ基、ヒドラジド基、またはアミノオキシ基を含む化合物を結合させたものである、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
- 標識糖鎖が、下記から選ばれる少なくとも一つのアミノ基含有化合物を、糖鎖の還元末端に結合させたものである、請求項８に記載の方法。
2-aminopyridine； 2-aminobenzamide； 2-aminoanthranilic acid； 7-amino-1-naphthol； 3-(acetylamino)-6-aminoacridine； 9-aminopyrene-1,4,6-trisulfonic acid； 8-aminonaphtalene-1,3,6-trisulfonic acid； 7-amino-1,3-naphtalenedisulfonicacid： 2-amino-9(10H)-acridone； 5-aminofluorescein； Dansylethylenediamine； 7-amino-4-methylcoumarine； benzylamine - 標識糖鎖が、下記から選ばれる少なくとも一つのヒドラジド基含有化合物を、糖鎖の還元末端に結合させたものである、請求項８に記載の方法。
2-aminobenzhydrazide； 2-hydrazinobenzoic acid； benzylhydrazine； 5-Dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl hydrazine(Dansylhydrazine)； 2-hydrazinopyridine；9-fluorenylmethyl carbazate(Fmoc hydrazine)； 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionoc acid, hydrazide； 2-(6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin)acetohydrazide； 7-diethylaminocoumarin-3-carboxylic acid, hydrazide(DCCH)； phenylhydrazine；1-Naphthaleneacethydrazide； phenylacetic hydrazide - 標識糖鎖が、下記から選ばれる少なくとも一つのアミノオキシ基含有化合物を、糖鎖の還元末端に結合さたものである、請求項８に記載の方法。
N-aminooxyacetyl(tryptophyl)arginine methyl ester； O-benzylhydroxylamine； Ophenylhydroxylamine；O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine； O-(4-nitrobenzyl)hydroxylamine； 2-aminooxypyridine； 2-aminooxymethylpyridine； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid methyl ester； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid ethyl ester； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid n-butyl ester； aminooxy-biotin - （工程ａ）請求項１から１１のいずれかに記載の方法を実施する工程、および
（工程ｂ）工程ａによって調製された標識糖鎖試料を、ＨＰＬＣ、質量分析、ＬＣ−ＭＳ、またはキャピラリ電気泳動法の分析手段によって分析する工程、
を含む、糖鎖の分析方法。
Applications Claiming Priority (3)
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