JP5872768B2 - 糖鎖試料調製方法 - Google Patents

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Description

本発明は、ラベル化した糖鎖の精製方法に関する。
糖鎖とは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸などの単糖およびこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に結合した分子の総称である。
糖鎖は非常に多様性に富んでおり、天然に存在する生物が有する様々な機能に関与する物質である。糖鎖は生体内でタンパク質や脂質などに結合した複合糖質として存在することが多く、生体内の重要な構成成分の一つである。生体内の糖鎖は細胞間情報伝達、タンパク質の機能や相互作用の調整などに深く関わっていることが明らかになりつつある。
例えば、糖鎖を有する生体高分子としては、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のプロテオグリカン、細胞の分化、増殖、接着、移動等に影響を与える糖脂質、及び細胞間相互作用や細胞認識に関与している糖タンパク質等が挙げられるが、これらの高分子の糖鎖が、互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御する機構が次第に明らかにされつつある。さらに、このような糖鎖と細胞の分化増殖、細胞接着、免疫、及び細胞の癌化との関係が明確にされれば、この糖鎖工学と、医学、細胞工学、あるいは臓器工学とを密接に関連させて新たな展開を図ることが期待できる。
病気を早期発見して生活の質（ＱＯＬ）を高く保つためには、病気の発症の予防や推移を診断できるバイオマーカーが必要である。糖鎖生合成にかかわる糖転移酵素の遺伝子破壊マウスの解析から、糖鎖はさまざまな組織・器官の機能維持に必須であることが明らかにされている（非特許文献１，２）。また、糖鎖修飾に異常がみられるとさまざまな疾病が引き起こされることも知られている（非特許文献３）。糖鎖の構造は細胞の癌化やさまざまな疾病によって著しく変化するので、疾病の推移を調べるためのバイオマーカーとしての利用が期待されている。
糖鎖自体は蛍光性、紫外吸収性をもたないため、糖鎖を分析する際には予め修飾（ラベル化）を施すことが多い。糖鎖をＨＰＬＣあるいはＨＰＬＣ−ＭＳで分析する場合は、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ誘導体化（２ＡＢ化）、２−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ誘導体化（ＰＡ化）などの蛍光ラベル化が一般的である（非特許文献４）。また、糖鎖をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析する場合にも、ラベル化を施すことにより測定感度の向上を図ることが行われる（非特許文献５、６）。
糖鎖をラベル化する際には、ラベル化効率を高めるため糖鎖に対して過剰量のラベル化試薬を作用させる場合が多い。試料溶液中に過剰のラベル化試薬が存在すると、ＨＰＬＣ測定や質量分析に支障をきたすため、あらかじめ除去する必要がある。試薬の除去にはゲルろ過（例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５を使用、非特許文献６）、固相抽出（例えばシリカゲル、グラファイトカーボン等を使用）などの方法が利用される。従来、これらの分離を行う場合には、適当な容器（カラム、カートリッジなど）に固相（充填材）を充填したものが主に使用されてきた。これらのカラム（カートリッジ）の分離性能を上げるためには、固相の充填密度を上げる、充填剤の数平均直径を小さくする、のいずれかの方法が通常用いられる。しかし、前者では、充填剤の形状や直径のばらつきが原因となって充填密度が思うように上がらず、後者では、カラムや装置への圧力負荷が大きくなるため、処理速度に限界を生じやすい。また、小スケールのカラム（カートリッジ）では、充填剤を保持するために必要なフリット（ビーズ塞き止め用の部材）のデッド・ボリュームが分離性能、回収率を下げる要因となりやすい。これらの問題を解決し、効率よくラベル化糖鎖を精製する手段が求められていた。
Ioffe E., Stanley P., Proc. Natl. Acad. Sci., 91, pp.728-732 (1994) Metzler M., Gertz A., Sarker M., Schachter H., Schrader J.W., Marth J.D., EMBO J., 13, pp.2056-2065 (1994) Powell L.D., Paneerselvam K., Vij R., Diaz S., Manzi A., Buist N., Freeze H., Varki A., J. Clin. Invest., 94, pp.1901-1909 (1994) Shilova N.V., Bovin N.V., Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 29, pp.309-324 (2003) Shinohara Y., Furukawa J.-i., Niikura K., Miura Y., Nishimura S.-I., Anal. Chem., 76, pp.6989-6997 (2004) Furukawa J.-i., Shinohara Y., Kuramoto H., Miura Y., Shimaoka H., Kurogochi M., Nakano M., Nishimura S.-I., Anal. Chem., 80, pp.1094-1101 (2008)
発明の概要
本発明の目的は、糖鎖ラベル化反応後、過剰のラベル化試薬を効率よく除去する手段を提供することである。
本発明は以下の通りである。
（１） ラベル化糖鎖を含む試料溶液中の未反応のラベル化試薬を低減させるための糖鎖試料調製方法であって、
（工程１）ラベル化糖鎖を含む前記試料溶液をモノリスシリカ（３次元網目構造をもつフィルター状の多孔質連続体をなすシリカであって、シリカに有機物を含有するものを除く。）と接触させることにより、前記モノリスシリカに糖鎖成分を吸着させる工程、
（工程２）前記モノリスシリカを洗浄液で洗浄する工程、
（工程３）前記モノリスシリカに溶出液を接触させ、吸着した糖鎖成分を溶出させる工程、
を含み、
前記工程１において、前記試料溶液が９０体積％以上のアセトニトリルを含むことを特徴とする糖鎖試料調製方法。
（２） 前記工程１が、流路内に前記モノリスシリカを充填したカラム状の容器に前記試料溶液を注入する工程、自然落下、吸引、加圧、又は遠心の方法により前記試料溶液をモノリスシリカ部に通過させる工程、を含む（１）に記載の糖鎖試料調製方法。
（３） 前記工程１において、前記試料溶液が９５体積％以上のアセトニトリルを含む（１）または（２）に記載の糖鎖試料調製方法。
（４） 前記工程２において、前記洗浄液が有機溶媒および水を含む溶液である（１）ないし（３）のいずれか１項に記載の糖鎖試料調製方法。
（５） 前記工程２において、前記洗浄液が９０体積％以上の有機溶媒および１０体積％以下の水を含む溶液である（４）に記載の糖鎖試料調製方法。
（６） 前記工程２において、前記洗浄液が９５体積％以上の有機溶媒および５体積％以下の水を含む溶液である（４）に記載の糖鎖試料調製方法。
（７） 前記洗浄液に含まれる前記有機溶媒がアセトニトリルである（４）ないし（６）のいずれか１項に記載の糖鎖試料調製方法。
（８） 前記工程３において、前記溶出液が１０体積％以上の水を含む溶液である（１）ないし（７）のいずれか１項に記載の糖鎖試料調製方法。
（９） 前記工程３において、前記溶出液が５０体積％以上の水を含む溶液である（１）ないし（８）のいずれか１項に記載の糖鎖試料調製方法。
（１０） 前記工程３において、前記溶出液が水である（１）ないし（７）のいずれか１項に記載の糖鎖試料調製方法。
（１１） 前記ラベル化糖鎖が、糖鎖の還元末端にアミノ基、ヒドラジド基、又はアミノオキシ基を含む化合物を結合したものである（１）ないし（１０）のいずれか１項に記載の糖鎖試料調製方法。
（１２） 前記ラベル化糖鎖が、下記から選ばれる少なくとも一つのアミノ基含有化合物を、糖鎖の還元末端に結合したものである（１）ないし（１０）のいずれか１項に記載の糖鎖試料調製方法。
2-aminopyridine； 2-aminobenzamide； 2-aminoanthranilic acid； 7-amino-1-naphthol； 3-(acetylamino)-6-aminoacridine； 9-aminopyrene-1,4,6-trisulfonic acid； 8-aminonaphtalene-1,3,6-trisulfonic acid； 7-amino-1,3-naphtalenedisulfonic acid： 2-amino-9(10H)-acridone； 5-aminofluorescein； Dansylethylenediamine； 7-amino-4-methylcoumarine； benzylamine
（１３） 前記ラベル化糖鎖が、下記から選ばれる少なくとも一つのヒドラジド基含有化合物を、糖鎖の還元末端に結合したものである（１）ないし（１０）のいずれか１項に記載の糖鎖試料調製方法。
2-aminobenzhydrazide； 2-hydrazinobenzoic acid； benzylhydrazine； 5-Dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl hydrazine (Dansylhydrazine)； 2-hydrazinopyridine； 9-fluorenylmethyl carbazate (Fmoc hydrazine)； 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionoc acid, hydrazide； 2-(6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin)acetohydrazide； 7-diethylaminocoumarin-3-carboxylic acid, hydrazide (DCCH)； phenylhydrazine；1-Naphthaleneacethydrazide； phenylacetic hydrazide
（１４） 前記ラベル化糖鎖が、下記から選ばれる少なくとも一つのアミノオキシ基含有化合物を、糖鎖の還元末端に結合したものである（１）ないし（１０）のいずれか１項に記載の糖鎖試料調製方法。
N-aminooxyacetyl(tryptophyl)arginine methyl ester； O-benzylhydroxylamine； O-phenylhydroxylamine； O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine； O-(4-nitrobenzyl)hydroxylamine； 2-aminooxypyridine； 2-aminooxymethylpyridine； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid methyl ester； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid ethyl ester； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid n-butyl ester； aminooxy-biotin
である。
本発明の方法を用いると、糖鎖をラベル化した後に過剰量のラベル化試薬を簡単に除去することが可能となり、糖鎖分析の高効率化に寄与する。
モノリスシリカを用いて精製した２ＡＢ化糖鎖（フェツインのＮ型糖鎖）のＨＰＬＣチャートである。 モノリスシリカを用いて精製したＰＡ化糖鎖（フェツインのＮ型糖鎖）のＨＰＬＣチャートである。 図２の拡大図である。 粒子状シリカゲル用いて精製した２ＡＢ化糖鎖（フェツインのＮ型糖鎖）のＨＰＬＣチャートである
本発明は、ラベル化糖鎖を含む試料溶液中の未反応のラベル化試薬を低減させるための糖鎖試料調製方法であって、（工程１）ラベル化糖鎖を含む試料溶液をモノリスシリカと接触させることにより、モノリスシリカに糖鎖成分を吸着させる工程、（工程２）モノリスシリカを洗浄液で洗浄する工程、（工程３）モノリスシリカに溶出液を接触させ、吸着した糖鎖成分を溶出させる工程、を含む糖鎖試料調製方法である。
（工程１）〜（工程３）において、ラベル化糖鎖と未反応ラベル化試薬とが分離されて、精製されたラベル化糖鎖が調製された糖鎖試料として得られ、更にラベル化糖鎖を各種分析方法で分析することができる。
（糖鎖試料）
本発明において使用する糖鎖試料は、例えば全血、血清、血漿、尿、唾液、細胞、組織、ウイルス、植物組織などの生体試料から調製されたものを用いることができる。また、精製された、あるいは未精製の糖タンパク質から調製されたものを用いることができる。試料として、別途精製された純粋な糖鎖を用いてもよい。糖鎖遊離手段を用いて上記生体試料に含まれる糖タンパク質から糖鎖を遊離させる。糖鎖を遊離させる手段としては、Ｎ−グリコシダーゼあるいはＯ−グリコシダーゼを用いたグリコシダーゼ処理、ヒドラジン分解、アルカリ処理によるβ脱離などの方法を用いることができる。Ｎ型糖鎖の分析を行う場合は、Ｎ−グリコシダーゼを用いる方法が好ましい。グリコシダーゼ処理に先立って、トリプシンやキモトリプシンなどを用いてプロテアーゼ処理を行ってもよい。
（糖鎖精製）
糖鎖をラベル化する前に、糖鎖以外の莢雑物（例えばタンパク質、ペプチド、核酸、脂質等）を除去することが好ましい。莢雑物の除去法としては、例えばゲルろ過精製、限外ろ過、透析、極性を利用した固相抽出、イオン交換樹脂による精製、溶解性の差を利用した沈殿などを用いることができる。糖鎖と選択的に結合する固相担体（例えば住友ベークライト（株）製 ＢｌｏｔＧｌｙｃｏ ＢＳ−４５６０１Ｓ、非特許文献６参照）による精製を用いることもできる。莢雑物の除去を行わずに糖鎖をラベル化してもよい。
（糖鎖のラベル化）
糖鎖を含む試料を、必要に応じて乾燥させたのち、ラベル化試薬を加えて反応させラベル化することができる。ラベル化反応は、例えば、還元的アミノ化反応を用いて任意のアミノ化合物で標識化する反応であることが好ましい。ラベル化試薬としては、糖鎖の還元末端と反応性を有するアミノ基、ヒドラジド基、アミノオキシ基等の官能基を含む物質が好ましい。
アミノ基を有する物質としては、以下に列挙した化合物群から選ぶことが好ましいが、これに限定されるものではない。
2-aminopyridine； 2-aminobenzamide； 2-aminoanthranilic acid； 7-amino-1-naphthol； 3-(acetylamino)-6-aminoacridine； 9-aminopyrene-1,4,6-trisulfonic acid； 8-aminonaphtalene-1,3,6-trisulfonic acid； 7-amino-1,3-naphtalenedisulfonic acid： 2-amino-9(10H)-acridone； 5-aminofluorescein； Dansylethylenediamine； 7-amino-4-methylcoumarine； benzylamine
これら化合物のうち、２−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ（ＰＡ化）、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２ＡＢ化）、２−ａｍｉｎｏａｎｔｈｒａｎｉｌｉｃ ａｃｉｄ（２ＡＡ化）、３−（ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）−６−ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅ（ＡＡ−Ａｃ化）は糖鎖をＨＰＬＣ分析する際のラベル化として多用されており、特に好ましい。
また、8-aminonaphtalene-1,3,6-trisulfonic acid（ＡＰＴＳ）は糖鎖をキャピラリ電気泳動法で分析する際に多用されており、特に好ましい。
ヒドラジド基を有する物質としては、以下に列挙した化合物群から選ぶことが好ましいが、これに限定されるものではない。
2-aminobenzhydrazide; 2-hydrazinobenzoic acid； benzylhydrazine；
5-Dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl hydrazine（Dansylhydrazine）； 2-hydrazinopyridine； 9-fluorenylmethyl carbazate（Fmoc hydrazine）； 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionoc acid, hydrazide； 2-(6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin)acetohydrazide； 7-diethylaminocoumarin-3-carboxylic acid, hydrazide（DCCH）； phenylhydrazine； 1-Naphthaleneacethydrazide； phenylacetic hydrazide
アミノオキシ基を有する物質としては、以下に列挙した化合物群から選ぶことが好ましいが、これに限定されるものではない。
N-aminooxyacetyl(tryptophyl)arginine methyl ester; O-benzylhydroxylamine； O-phenylhydroxylamine； O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine； O-(4-nitrobenzyl)hydroxylamine； 2-aminooxypyridine； 2-aminooxymethylpyridine； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid methyl ester； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid ethyl ester； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid n-butyl ester; aminooxy-biotin
これらの化合物のうち、N-aminooxyacetyl(tryptophyl)arginine methyl ester（aoWR）は、MALDI-TOF MS測定時の感度を向上させる効果があり、特に好ましい。
上記化合物の合成は、特に限定されないが、例えば国際公報ＷＯ２００８／０１８１７０号公報等に示されるような公知法に従って行うことができる。
本発明の方法は、ラベル化反応の条件に限定されるものではないが、例えば糖鎖に対して１０等量以上のラベル化試薬を添加し、還元剤の存在下で加熱反応を行うことが好ましい。反応系においてｐＨが酸性から中性の条件であるのが好ましく、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜８であり、さらに好ましくは２〜７である。反応温度に関しては４〜９０℃が好ましく、好ましくは２５〜９０℃で、さらに好ましくは４０〜９０℃である。反応時間は、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、より好ましくは１０分間〜３時間である。ヒドラジド基含有化合物、アミノオキシ基含有化合物でラベル化を行う場合には、還元剤は必ずしも添加しなくともよい。
特に、アミノ化合物が２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅの場合、ｐＨが酸性から中性の条件で、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜８であり、さらに好ましくは２〜７である。反応温度に関しては４〜９０℃、好ましくは３０〜９０℃で、さらに好ましくは４０〜８０℃である。アミノ化合物の濃度は１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜１０Ｍで、さらに好ましくは１００ｍＭ〜１Ｍである。還元剤の濃度は、１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜１０Ｍ、さらに好ましくは１００ｍＭ〜２Ｍである。反応時間は、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、さらに好ましくは１時間〜３時間である。
また、還元剤は例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、メチルアミンボラン、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、ピコリンボラン、ピリジンボランなどが使用可能であるが、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用するのが反応性の面から考えて好ましい。
（ラベル化糖鎖の精製）
上記の方法により調製されたラベル化糖鎖溶液には、未反応のラベル化試薬が含まれているため、直接分析に供することは困難である。このため、測定前に予め未反応のラベル化試薬を除去することが必要となる。試薬の除去にはゲル粒子、あるいはシリカゲル粒子等をカラム、カートリッジに充填したデバイスを用いることが多い。これらのカラム（カートリッジ）の分離性能を上げるためには、固相の充填密度を上げる、充填剤の数平均直径を小さくする、のいずれかの方法が通常用いられる。しかし、前者では、充填剤の形状や直径のばらつきが原因となって充填密度が思うように上がらず、後者では、カラムや装置への圧力負荷が大きくなるため、処理速度に限界を生じやすい。また、小スケールのカラム（カートリッジ）では、充填剤を保持するために必要なフリット（ビーズ塞き止め用の部材）のデッド・ボリュームが分離性能、回収率を下げる要因となりやすい。
本発明では、これらの問題を回避するための手段として、モノリスシリカを用いる。モノリスシリカとは、３次元網目構造をもつフィルター状の多孔質連続体をなすシリカであり、従来の粒子状シリカと比較して、通液性が良好、フリットが不要、デッドボリュームが少ないなどの長所がある（特開平６−２６５５３４）。モノリスシリカはカラム状の容器、あるいは、マルチウェルプレートに固定されていることが好ましい。
モノリスシリカのポアサイズについては、小さすぎると通液性が低下し、大きすぎると理論段数が低下し、糖鎖の回収量が低下する。そのため、モノリスシリカのポアサイズは、例えば、互いに連続した細孔（スルーポア）径が１〜１００μｍであることが好ましく、より好ましくは１〜５０μｍ、さらに好ましくは１〜３０μｍであり、１〜２０μｍであることが最も好ましい。
モノリスシリカの性状については、順相モード、あるいは、ＨＩＬＩＣ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）モードが好ましい。
モノリスシリカの使用形態としては、モノリスシリカが固定されたカラムあるいはマルチウェルプレートにラベル化糖鎖を含む試料溶液を注入し、自然落下、吸引、加圧、遠心などの方法により試料溶液をモノリスシリカ部を通過させたのち、洗浄液で洗浄し、溶出液を添加し糖鎖成分を溶出させることが好ましい。
モノリスシリカにアプライする試料溶液は、９０体積％以上の有機溶媒を含むことが好ましく、９５体積％以上の有機溶媒を含むことがさらに好ましい。有機溶媒はアセトニトリル、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ヘキサン、酢酸エチル、塩化メチレン、テトラヒドロフランなどを用いることができるが、アセトニトリルが最も好ましい。
糖鎖試料をアプライしたのち、モノリスシリカを洗浄液で洗浄することが好ましい。洗浄液は９０体積％以上の有機溶媒と１０体積％以下の水を含むことが好ましく、９５体積％以上の有機溶媒と５体積％以下の水を含むことがさらに好ましい。有機溶媒はアセトニトリル、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ヘキサン、酢酸エチル、塩化メチレン、テトラヒドロフランなどを用いることができるが、アセトニトリルが最も好ましい。組成の異なる洗浄液、たとえば１００％アセトニトリルと、アセトニトリル／水（９５：５，ｖ／ｖ）混合溶媒で順次洗浄することも好ましい。
洗浄操作後、モノリスシリカに溶出液を添加し、吸着したラベル化糖鎖を溶出することが好ましい。溶出液は１０体積％以上の水を含むことが好ましく、５０体積％以上の水を含むことがより好ましく、水が最も好ましい。水以外の成分は、例えば、アセトニトリル、および、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールに代表されるアルコールから選ばれる有機溶媒であることが好ましい。
回収した糖鎖溶液は、必要に応じて濃縮、乾燥、あるいは希釈して各種測定に供することができる。
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いた糖鎖分析）
得られたラベル化糖鎖は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳに代表される質量分析法で分析することができる。特に糖鎖がＮ−ａｍｉｎｏｏｘｙａｃｅｔｙｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ（ａｒｇｉｎｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）でラベル化されている場合、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いて高感度分析を行うことができる。
（ＨＰＬＣを用いた糖鎖分析）
得られたラベル化糖鎖は、ＨＰＬＣを用いて分析することができる。特に糖鎖がＰＡ化、２ＡＢ化、２ＡＡ化、ＡＡ−Ａｃ化されている場合、特に好適に分析可能である。
（その他の糖鎖分析）
得られたラベル化糖鎖は、ＬＣ−ＭＳ、ＨＰＬＣ−ＭＳ、キャピラリ電気泳動など各種分析に供することができる。
以下の実施例にて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されることはない。
（糖鎖試料の調製）
モデル糖タンパク質としてフェツイン（ウシ胎児血清由来）を用いた。フェツイン１ｍｇを容器に取り、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液５０μＬに溶解させた。１２０ｍＭジチオスレイトール溶液５μＬを加えて６０℃で３０分インキュベートしたのち、１２３ｍＭヨードアセトアミド溶液１０μＬを加え、室温で１時間静置した。さらにトリプシン４００ｕｎｉｔを加え、３７℃で１６時間静置した。９０℃で５分間処理してトリプシンを失活させたのち、Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ Ｆ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）１ｕｎｉｔを添加し、３７℃で１６時間インキュベートすることで糖鎖を遊離させた。純水を加えて液量を１００μＬに調整した。
（糖鎖精製）
糖鎖捕捉性を有するポリマービーズを用いて糖鎖精製を行った。上記で得られたフェツイン糖鎖溶液２０μＬ（フェツイン２００μｇ相当）を、ヒドラジド基含有ポリマービーズ（住友ベークライト株式会社製、ＢＳ−４５６０１Ｓ）５ｍｇに添加し、２％酢酸を含むアセトニトリル１８０μＬを加えたのち、８０℃で１時間反応させ、乾固させた。２Ｍグアニジン塩酸塩溶液、水、メタノール、１％トリエチルアミン溶液にてポリマービーズを洗浄後、１０％無水酢酸／メタノール溶液を添加し、室温で３０分間反応させヒドラジド基をキャッピングした。キャッピング後、メタノールおよび水でポリマービーズを洗浄した。ビーズに純水２０μＬおよび２％酢酸を含むアセトニトリル１８０μＬを加え、８０℃で１時間加熱・乾固させることにより、ビーズから糖鎖を遊離させた。
（糖鎖のラベル化）
糖鎖のラベル化を以下の２通りのいずれかで行なった。
（２ＡＢラベル化）
２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅを３５０ｍＭの濃度で３０％（ｖ／ｖ）酢酸／ＤＭＳＯ混合溶媒に溶解した。さらに、還元剤としてシアノ水素化ホウ素ナトリウムを１Ｍの濃度で上記溶液に溶解した。この溶液５０μＬを上述のビーズに添加し、８０℃で２時間反応させることにより糖鎖を２ＡＢラベル化した。上清を回収し、２ＡＢラベル化糖鎖溶液（未反応の２ＡＢを含む）を得た。
（ＰＡラベル化）
２−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ ５５２ｍｇを酢酸２００μｇに溶解した（ＰＡ溶液）。ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ−ｂｏｒａｎｅ ２００ｍｇを酢酸水溶液（純水５０μＬと酢酸８０μＬを混合）に溶解した（還元剤溶液）。
ＰＡ溶液３０μＬを上述のビーズに添加し、９０℃で１時間反応させた。その後、還元剤溶液１１０μＬを加え、８０℃で３５分間反応させた。
（ラベル化糖鎖の精製）
未反応のラベル化試薬を除去するため、以下の方法で固相抽出を行った。
（実施例１）
２ＡＢラベル化した試料溶液から、モノリスシリカを用いて未反応２ＡＢの除去を行った。モノリスシリカとして、ジーエルサイエンス株式会社製「ＭｏｎｏＦａｓスピンカラム」を用いた。本カラムは、スルーポア径１５μｍのディスク状モノリスシリカフィルターが容量約１ｍＬのチューブの底部に固定されたものであり、試料溶液をチューブ内に注入して遠心することにより、試料溶液をモノリスシリカの細孔内を通過させる仕組みになっている。
上記で得た２ＡＢラベル化糖鎖溶液をアセトニトリルで希釈し、アセトニトリル含量が９５％（ｖ／ｖ）となるように調製した。この試料溶液の全量を、モノリスシリカスピンカラムに注入し、卓上遠心機で遠心して通過させてラベル化糖鎖を吸着させた。アセトニトリル、アセトニトリル／水（９５：５，ｖ／ｖ）でカラムを順次洗浄したのち、純水５０μＬを加えて吸着成分を溶出させ、回収した。
（実施例２）
ＰＡラベル化した試料溶液から、モノリスシリカを用いて未反応ＰＡの除去を行った。操作は実施例１と同様に行った。
（比較例１）
２ＡＢラベル化した試料溶液から、粒子状シリカゲルを用いて未反応２ＡＢの除去を行った。シリカゲルは三菱化学ヤトロン製「イアトロビーズ６ＲＳ−８０６０」を用いた。シリカゲル約３０ｍｇをディスポーザブルカラム（ポリプロピレン製のカラムにポリエチレン製のフリットを装着したもの）に充填し、これに実施例１と同様に調製した試料溶液を添加し、溶液をカラム内で自然落下させてラベル化糖鎖を吸着させた。アセトニトリル、アセトニトリル／水（９５：５，ｖ／ｖ）でカラムを順次洗浄したのち、純水５０μＬを加えて吸着成分を溶出させ、回収した。
（ＨＰＬＣ測定）
上記実施例および比較例の方法で得た糖鎖溶液をＨＰＬＣで測定した。ＨＰＬＣ装置は日立ハイテクノロジーズ製ＬａＣｈｒｏｍ ＥＬＩＴＥ（Ｌ−２１３０ポンプ、Ｌ−２２００オートサンプラー、Ｌ−２３５０カラムオーブン、Ｌ−２４８５蛍光検出器）を用い、分析用カラムは昭和電工製Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅを用いた。分析はグラジエントモードで行い、移動相は（Ａ）２％（ｖ／ｖ）酢酸／アセトニトリル溶液、（Ｂ）３％（ｖ／ｖ）酢酸、５％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン／水溶液を用い、９０分間で（Ａ）の比率を７０％から５％に変化させた。カラム温度は４０℃に保った。検出は蛍光検出で行い、実施例１および比較例（２ＡＢ化糖鎖）の場合は励起波長３３０ｎｍ、蛍光波長４２０ｎｍで検出し、実施例２（ＰＡ化糖鎖）の場合は励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで検出した。サンプル溶液の注入量は、実施例、比較例とも、全サンプル溶液の１／２０、すなわち、フェツインに換算して１０μｇとなるように調整した。
図１には実施例１（モノリスシリカ）の方法で精製した２ＡＢ化糖鎖のＨＰＬＣチャートを示す。図２には実施例２（モノリスシリカ）の方法で精製したＰＡ化糖鎖のＨＰＬＣチャートを示し、図３には図２の拡大図を示す。また、図４には比較例（粒子状シリカゲル）の方法で精製した２ＡＢ化糖鎖のＨＰＬＣチャートを示す。
横軸は保持時間（分）、縦軸は蛍光強度（ａ．ｕ．）である。図中、（ａ）は未反応ラベル化試薬由来のピーク、（ｂ）はシアル酸を１つ含む糖鎖由来のピーク、（ｃ）はシアル酸を２つ含む糖鎖由来のピーク、（ｄ）はシアル酸を３つ含む糖鎖由来のピーク、（ｅ）はシアル酸を４つ含む糖鎖由来のピークを示す。
又、表１に実施例１、比較例１のＨＰＬＣチャートの各ピーク（ａ）〜（ｅ）の面積値を示す。
Figure 0005872768
実施例、比較例ともに未反応のラベル化試薬由来のピーク（図中、ａ）は、糖鎖由来のピーク（図中、（ｂ）〜（ｅ））の検出を阻害しない程度に小さく、いずれの方法でも未反応試薬の除去は十分に行われていることが示された。実施例１および比較例１に着目すると、２ＡＢ化糖鎖フェツイン糖鎖由来のピーク （図中、（ｂ）〜（ｅ））については、実施例１の方が比較例１よりも明らかに面積が大きく、モノリスシリカを使用した方がラベル化糖鎖の回収量が多いことが分かった。いずれの方法でも、ピークのパターンは文献（Ｊ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．， ４， ｐｐ．１４６−１５２（２００５）など）で報告されているものと良好な一致を示した。
本発明において利用されるモノリスシリカは、従来、核酸の精製等に利用されていた（ＷＯ２００５−０７８０８８、特開２００６−２９６２２０）。一方、ラベル化糖鎖の精製には、従来、粒子状のシリカ、グラファイトカーボン、ゲルろ過ビーズ等が利用されていた。本発明においては、ラベル化糖鎖と未反応ラベル化試薬の分離へのモノリスシリカの応用を試みた。結果、モノリスシリカを用いることにより、従来の糖鎖の精製方法と比較して、操作をより簡便化し、糖鎖精製の効率を向上させることができた。
本発明の方法を用いると、糖鎖のラベル化反応後におこなう未反応試薬の除去工程の簡便化および高収率化が可能であり、糖鎖研究はもとより、天然物からの糖鎖回収、糖鎖標準物質の製造、さらには、糖鎖分析による疾患マーカーの探索、糖鎖分析による診断など医療の分野での利用可能性がある。

Claims (14)

  1. ラベル化糖鎖を含む試料溶液中の未反応のラベル化試薬を低減させるための糖鎖試料調製方法であって、
    （工程１）ラベル化糖鎖を含む前記試料溶液をモノリスシリカ（３次元網目構造をもつフィルター状の多孔質連続体をなすシリカであって、シリカに有機物を含有するものを除く。）と接触させることにより、前記モノリスシリカに糖鎖成分を吸着させる工程、
    （工程２）前記モノリスシリカを洗浄液で洗浄する工程、
    （工程３）前記モノリスシリカに溶出液を接触させ、吸着した糖鎖成分を溶出させる工程、
    を含み、
    前記工程１において、前記試料溶液が９０体積％以上のアセトニトリルを含むことを特徴とする糖鎖試料調製方法。
  2. 前記工程１が、流路内に前記モノリスシリカを充填したカラム状の容器に前記試料溶液を注入する工程、自然落下、吸引、加圧、又は遠心の方法により前記試料溶液をモノリスシリカ部に通過させる工程、を含む請求項１に記載の糖鎖試料調製方法。
  3. 前記工程１において、前記試料溶液が９５体積％以上のアセトニトリルを含む請求項１または２に記載の糖鎖試料調製方法。
  4. 前記工程２において、前記洗浄液が有機溶媒および水を含む溶液である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の糖鎖試料調製方法。
  5. 前記工程２において、前記洗浄液が９０体積％以上の有機溶媒および１０体積％以下の水を含む溶液である請求項４に記載の糖鎖試料調製方法。
  6. 前記工程２において、前記洗浄液が９５体積％以上の有機溶媒および５体積％以下の水を含む溶液である請求項４に記載の糖鎖試料調製方法。
  7. 前記洗浄液に含まれる前記有機溶媒がアセトニトリルである請求項４ないし６のいずれか１項に記載の糖鎖試料調製方法。
  8. 前記工程３において、前記溶出液が１０体積％以上の水を含む溶液である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の糖鎖試料調製方法。
  9. 前記工程３において、前記溶出液が５０体積％以上の水を含む溶液である請求項１ないし８のいずれか１項に記載の糖鎖試料調製方法。
  10. 前記工程３において、前記溶出液が水である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の糖鎖試料調製方法。
  11. 前記ラベル化糖鎖が、糖鎖の還元末端にアミノ基、ヒドラジド基、又はアミノオキシ基を含む化合物を結合したものである請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の糖鎖試料調製方法。
  12. 前記ラベル化糖鎖が、下記から選ばれる少なくとも一つのアミノ基含有化合物を、糖鎖の還元末端に結合したものである請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の糖鎖試料調製方法。
    2-aminopyridine； 2-aminobenzamide； 2-aminoanthranilic acid； 7-amino-1-naphthol； 3-(acetylamino)-6-aminoacridine； 9-aminopyrene-1,4,6-trisulfonic acid； 8-aminonaphtalene-1,3,6-trisulfonic acid； 7-amino-1,3-naphtalenedisulfonic acid： 2-amino-9(10H)-acridone； 5-aminofluorescein； Dansylethylenediamine； 7-amino-4-methylcoumarine； benzylamine
  13. 前記ラベル化糖鎖が、下記から選ばれる少なくとも一つのヒドラジド基含有化合物を、糖鎖の還元末端に結合したものである請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の糖鎖試料調製方法。
    2-aminobenzhydrazide； 2-hydrazinobenzoic acid； benzylhydrazine； 5-Dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl hydrazine (Dansylhydrazine)； 2-hydrazinopyridine； 9-fluorenylmethyl carbazate (Fmoc hydrazine)； 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionoc acid, hydrazide； 2-(6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin)acetohydrazide； 7-diethylaminocoumarin-3-carboxylic acid, hydrazide (DCCH)； phenylhydrazine；1-Naphthaleneacethydrazide； phenylacetic hydrazide
  14. 前記ラベル化糖鎖が、下記から選ばれる少なくとも一つのアミノオキシ基含有化合物を、糖鎖の還元末端に結合したものである請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の糖鎖試料調製方法。
    N-aminooxyacetyl(tryptophyl)arginine methyl ester； O-benzylhydroxylamine； O-phenylhydroxylamine； O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine； O-(4-nitrobenzyl)hydroxylamine； 2-aminooxypyridine； 2-aminooxymethylpyridine； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid methyl ester； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid ethyl ester； 4-[(aminooxyacetyl)amino]benzoic acid n-butyl ester； aminooxy-biotin
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